蘋果醋飲料生產過程微生物污染關鍵點的分析

陳菊，陳林，胡濤，張小鳳，宋佳，鄭宇，*，石磊，萬守朋，王敏

1(天津科技大學 生物工程學院，食品營養與安全國家重點實驗室，天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津,300457)2(天津市利民調料有限公司，天津,300308)

飲料在我國有巨大的消費市場，2018年我國飲料產量達156 79.2萬t，同比增長6.9%，零售額突破2 000億元，是我國食品工業的重要組成部分[1]。近年來，伴隨著消費需求逐步升級，發酵型飲料產品取得較快發展，其中果醋飲料是近年來增長最快的種類之一。果醋飲料是水果深加工的新型產品，含有豐富的有機酸、氨基酸等營養與風味物質，風味獨特，深受消費者喜愛[2-3]。

工業生產中果醋飲料主要以水果或者果汁為原料，經酒精發酵和醋酸發酵2個過程釀造而成的一種風味獨特、營養豐富的飲品[4-5]。目前市場上消費量最大的果醋飲料是蘋果醋飲料，此外還有部分山楂醋飲料、草莓醋飲料等。采用的微生物主要有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和醋酸菌(Aceticacidbacteria)，特別是在醋酸菌發酵階段，由于醋酸具有較強的抑菌能力，普通微生物較難生長，而醋酸菌由于具有較強的醋酸耐受性以及乙醇氧化能力，常用于果醋發酵，常用的醋酸菌主要有Acetobacter、Komagataeibacter[6-7]。果醋飲料的生產過程為：原料→調配→酒精發酵→過濾→醋酸發酵→過濾→調配→殺菌→灌裝→殺菌→包裝，整個過程工業化程度較高，配合規范的管理操作能夠保障產品的質量安全。但由于發酵型果醋飲料產品營養豐富，并且生產線較長，也存在微生物污染的可能[8-9]。本研究對蘋果原醋儲罐底部出現的異常沉淀物進行檢測，分析潛在污染微生物，進一步對蘋果醋飲料生產過程關鍵環節管道及樣品進行分析檢測，從而確定生產過程預防微生物污染的關鍵控制點，為指導生產過程質量控制和潛在污染微生物的有效防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品

某蘋果醋生產企業提供的蘋果原醋儲罐中的絮狀沉淀物，某蘋果醋飲料企業提供的蘋果醋飲料產品。

1.1.2 培養基

PCA培養基(g/L)：胰蛋白胨5.0；酵母浸粉2.5；葡萄糖1.0；瓊脂15.0；pH 7.0±0.2。

1.1.3 儀器設備

S20K精密pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；WS2-134-75恒溫培養箱，天津市實驗儀器廠；1X2-1LLJ100普通光學顯微鏡，OLYMPUS；ZHJH-C1112B超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；YXQ-LS-50SII高壓滅菌鍋，上海博迅實業有限公司；PCR儀，德國艾本德公司；Gel Doc XR+凝膠成像儀，美國伯樂公司；IS50傅里葉紅外光譜，美國賽默飛世爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘋果原醋中沉淀物成分分析

從某蘋果醋生產企業蘋果醋儲罐底部取部分絮狀沉淀，利用紅外光譜方法分析沉淀成分。將少量樣品涂于2片紅外透明的KRS-5窗片之間，窗片的互相擠壓形成1個樣品薄層。壓片做好后，放入平臺檢測窗內，將探頭對準檢測窗，順時針旋下緊貼樣品進行紅外光譜分析[12]。

1.2.2 蘋果原醋沉淀物對蘋果醋飲料的影響

將蘋果原醋中沉淀物按照0.1%的接種量接種至蘋果醋飲料中，30 ℃靜置培養3～5 d，分析沉淀物對蘋果醋飲料生物穩定性以及產品理化指標的影響，主要檢測pH、總酸、還原糖、有機酸等指標變化。

1.2.3 蘋果原醋沉淀物中主要微生物分析

(1)樣品預處理：將沉淀物放入50 mL無菌離心管中，加入一定量的無菌生理鹽水，旋渦振蕩，8 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用生理鹽水洗滌沉淀，8 000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集菌體。

(2)利用深加工食品提取DNA試劑盒操作說明提取蘋果原醋沉淀物中細菌基因組，送金唯智基因公司測序，利用SILVA 123數據庫對測序結果進行比對分析，選擇同源性最高的菌種屬來解析微生物群落組成。

1.2.4 蘋果醋飲料生產過程潛在污染微生物分析

(1)針對蘋果醋飲料原料及生產過程設計取樣點，共選取11個取樣點，如圖1所示，編號1～11分別為軟化水、蘋果濃縮汁、果酒過濾管道、果酒循環泵、果酒儲罐、果醋管道、果醋循環泵、果醋儲罐、調配罐、巴殺出口、成品罐，每個取樣點分別用棉簽吸取或者蘸取3個不同位置后混合，用于潛在污染微生物分析。

(2)微生物數量檢測：在超凈工作臺中，將取樣點樣品接種到PCA液體培養基中進行富集培養，24 h后，取富集后樣品逐次稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同濃度梯度，吸取0.1 mL稀釋液涂布到PCA培養基分離平板，正向放置30 min待液體被固體培養基吸收完全，37 ℃培養箱培養，每個稀釋度做3個平行。

(3)潛在污染微生物分離純化與鑒定：將各取樣點樣品于生理鹽水中懸浮振蕩，分別于80 ℃水浴20 min進行熱處理，再涂布于平板培養基上，37 ℃培養24 h，利用3區劃線法對耐熱微生物菌落進行純化。對純化后單菌落進行培養，利用試劑盒提取基因組，選用細菌通用上下游引物27F與1492R擴增16S rDNA片段，送公司測序，測序序列在GenBank進行Blast比對，選擇同源性最高的種屬作為鑒定結果。

圖1 蘋果醋飲料生產過程取樣示意圖Fig.1 Sampling diagram of apple vinegar beverageproduction process

1.2.5 分析方法

根據GB/T 30884—2014方法測定蘋果醋飲料pH；根據GB/T 5009.39—2003測定蘋果醋飲料中還原糖和總酸含量(以乙酸計)；采用HPLC法[13]測定蘋果醋飲料中有機酸含量。

1.2.6 數據統計分析

樣品理化指標、菌落計數等實驗均設置3個平行，利用Excel軟件計算平均值及方差。

2 結果與分析

2.1 蘋果原醋中沉淀物分析

采用紅外光譜檢測方法分析蘋果原醋中絮狀沉淀物組成。化合物紅外光譜與分子的結構密切相關，通過紅外光譜測定，可以分析樣品中存在哪些有機官能團，繼而確定化合物的可能結構。由圖2-A可知，蘋果原醋中絮狀沉淀物在1 205～1 036 cm處的吸收峰是糖苷鍵的特征峰，說明該物質中含有連接糖苷分子中的非糖部分(即苷元)與糖基，或者糖基與糖基[12]。通過查閱相關文獻，推測蘋果原醋樣品中的絮狀沉淀物可能為細菌纖維素[13]，紅外光譜分析表明該沉淀物與細菌纖維素的特征峰位基本一致(圖2-B)。

2.2 蘋果原醋絮狀沉淀物對蘋果醋飲料生物穩定性的影響

根據圖2分析，蘋果原醋樣品中出現的絮狀沉淀可能為細菌纖維素，可能由一些具有耐酸性的微生物產生，說明蘋果原醋中出現的絮狀沉淀對后續蘋果醋飲料的生產有潛在危害，因此將蘋果原醋中絮狀沉淀物接入蘋果醋飲料產品中，分析其對產品生物穩定性的影響。正常的蘋果醋飲料清澈透明，接入絮狀沉淀物后蘋果醋飲料中出現渾濁，并有絮狀沉淀產生，說明蘋果原醋樣品中的絮狀沉淀含有部分微生物，會導致蘋果醋飲料的污染。通過顯微鏡觀察，沒有發現明顯的絲狀真菌以及酵母，經染色發現革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌。

A-蘋果原醋中絮狀沉淀；B-細菌纖維素圖2 沉淀物紅外光譜分析Fig.2 Infrared spectra analysis of sediment

分析比較蘋果醋飲料接菌前后的主要理化指標，如表1所示，與對照相比，接菌后的蘋果醋飲料樣品還原糖降低約1.0 g/100 mL，總酸(以乙酸計)增加11.8%，說明絮狀沉淀物中的污染微生物會利用蘋果醋飲料中的還原糖代謝產生有機酸，因此，進一步分析了其中有機酸組成。

表1 樣品的主要理化指標分析Table 1 Analysis of samples physical and chemical properties

注：**，極顯著(P< 0.01)。

乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸是蘋果醋飲料中的主要有機酸，與對照相比，接菌后的蘋果醋飲料乳酸濃度增加2.3倍，其他有機酸濃度變化不大。有研究報道，許多微生物能夠以異養方式合成胞外細菌纖維素，主要有葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacter)、八疊球菌屬(Sarcina)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、產堿菌屬(Alcaligenes)、根瘤菌屬(Rhizobium)、固氮菌屬(Azotobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、無色桿菌屬(Achromobacter)和產氣桿菌屬(Aerobacter)等[14]。微生物可以利用糖類物質，通過糖酵解、戊糖磷酸等途徑將單糖轉化為丙酮酸，進而生成乳酸等代謝產物[15-16]，從而導致酸度升高。

以蘋果原醋中絮狀沉淀為樣品，提取基因組，分析其中微生物多樣性，結果如圖3所示，蘋果原醋產生的絮狀沉淀中主要微生物為Pediococcus，此外，Paracoccus，Gluconacetobacter和Lactobacillus也占有較高的濃度。其中，測序結果同源性最高的種分別為Pediococcusstilesii(99%)、Paracoccusangustae(100%)，Gluconacetobacterxylinus(100%)、Lactobacillusacetotolerans(99%)、Aquabacteriumolei(100%)和Lysobactergummosus(96%)。有研究表明，Gluconacetobacterxylinus能夠產生細菌纖維素[17]，這與前面沉淀物的紅外光譜分析結果一致。翟磊等[18]通過對比分析以及回接實驗證明耐酸乳桿菌(Lactobacillusacetotolerans)會引起正常醋樣出現產氣、異味、顏色變化，以及可溶性固形物減少和pH升高等變質現象。Lysobacter分泌于胞外酶和活性小分子物質，能抑制真菌的生長及增殖，這也有可能有利于抑制蘋果原醋中真菌的生長[19]。

圖3 蘋果原醋沉淀中細菌菌群組成Fig.3 Composition of bacteria in sediment of raw applevinegar

2.3 蘋果醋飲料生產過程微生物污染預防關鍵點分析

為準確分析各個取樣點對后續蘋果醋飲料產品的危害，對樣品進行巴氏殺菌處理，重點分析其中耐熱微生物。結果如表2所示，通過取樣分析，發現有部分耐熱微生物存在于生產過程中，菌落數較多的地方集中在軟化水、果酒循環泵、果酒過濾管道、果醋管道，尤其以各環節原料運輸的管道居多。蘋果醋飲料生產過程存在的耐熱微生物主要有7個屬，15個種，其中芽胞桿菌屬(Bacillus)和短芽胞桿菌屬(Brevibacillus)居多，給產品質量安全帶來危害。歐文氏桿菌和科恩氏菌普遍存在于空氣和土壤中[20-21]，本文首次在蘋果醋生產過程中分離得到。

表2 蘋果醋飲料生產過程微生物檢測Table 2 Microbial detection during the production processof apple vinegar

注：微生物菌落數(CFU/mL):“-”未檢出；“+”1-10個；“++”10-100個；“+++”100～1 000個。

蘋果醋是一種酸性食品，含有較高濃度的乙酸等有機酸，乙酸能夠使蛋白變性并導致細菌死亡[22]，使得大多數污染微生物不能生長繁殖。除蘋果醋外，一些耐酸微生物也會導致谷物醋的污染，孫文麗等[23]在脹氣食醋中分離到6株細菌，其中一株為Bacillustequilensis，該菌株可在糖發酵培養基中產生較多白色絮狀物沉淀，同時還檢測到2株金黃色葡萄菌屬也可以產生沉淀。本文檢測到的耐熱微生物的數量隨著生產過程逐漸減少，成品中沒有檢測到耐熱微生物，說明生產過程中清洗、殺菌等工藝能夠有效減少微生物污染的威脅。但也有一些微生物具有特殊的性能，能夠在高酸和高溫條件下存活，比如一些芽胞桿菌屬的細菌生成的芽胞結構致密，較難被破壞，一旦條件適宜即可大量繁殖[24-25]。特別是其中的蠟樣芽胞桿菌，它是一種較為常見的食品污染微生物，在10～45 ℃、pH為2～11的環境下都可以生長繁殖，在酸性條件下其營養細胞會發生一系列的應激反應來適應酸性環境[26]。有文獻報道，80～85 ℃水浴5～10 min可刺激蠟樣芽胞桿菌的芽胞萌發[27]，因此這類微生物是生產過程預防的重點。

值得注意的是，部分樣品經過熱處理后依然可能存在微生物污染，而且如果暫存罐和運輸管道的滅菌不徹底，灌裝和存儲過程中的管理不善，都有可能造成微生物污染。通過微生物的耐熱實驗，發現部分污染微生物采用普通巴氏滅菌條件很難被殺死，可以考慮采用瞬時超高溫滅菌，或者采用膜過濾等方式除菌[28]。同時，也可以采用抑菌效果更好的防腐劑。有研究指出防腐劑山梨酸鉀和乳酸鏈球菌素在酸性條件下對芽胞桿菌具有較強的抑制作用，防腐劑尼泊金丙酯鈉只需要0.15 g/kg添加量就能很好地抑制細菌生長[29-30]。

3 結論

通過紅外光譜技術分析，發現蘋果原醋中的絮狀沉淀物可能為細菌纖維素，采用高通量測序方法檢測到絮狀沉淀物中主要存在6個屬的細菌，將沉淀物接種到蘋果醋飲料中會導致產品生物穩定性降低，乳酸濃度顯著增加。根據蘋果醋飲料生產工藝流程，對蘋果醋飲料生產過程中11個關鍵點進行微生物檢測，發現存在微生物污染較多的地方集中在軟化水、果酒循環泵、果酒過濾管道、果醋管道，以及果酒和果醋儲罐中，尤以各環節連接管道居多，主要耐熱微生物為具有芽胞生成能力的細菌，如芽胞桿菌屬和短芽胞桿菌屬。蘋果醋飲料生產過程中要注意生產設施的清洗殺菌，完善在線清洗與在線殺菌系統(CIP/SIP)，預防原料與管道中潛在污染微生物污染。