謝瓦散囊菌CICC 41584產香特性及在濃香型白酒大曲生產中的應用

崔香香，白飛榮，于學健，白秀彬，許玲，于盼盼，姚粟*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)2(山東扳倒井股份有限公司，山東 淄博，256300)

中國白酒是世界著名的六大蒸餾酒之一，香型分為清香型、醬香型和濃香型[1],深受廣大消費者喜愛。濃香型白酒以其“窖香濃郁、綿柔甘洌、香味協調”的酒體風格而聞名，以己酸乙酯為主體香[2-3]。白酒風味及酒體設計向“淡、雅、柔”方向發展，茶香風味物質對白酒風味的調節，可促進白酒香型的風味提升，使白酒酒體風味滿足新興消費需求[4-5]。大曲作為白酒釀造過程中的糖化、發酵和增香劑，含有多種微生物和生物酶，對白酒的風味和口感起關鍵性作用[6]。微生物是制曲過程中糖化發酵的動力，也是大曲生香的重要來源，是釀造白酒的酒體風味形成的重要物質基礎。

散囊菌屬(Eurotium)真菌大量存在于傳統發酵食品生產過程中，具有產茶香、產多種生物酶等性能[7-11]，在釀酒過程中發揮著重要作用，對大曲的風味有積極貢獻，是一種重要的功能微生物類群。目前，在白酒釀造領域，散囊菌屬在清、濃、醬香型白酒大曲中均有分離到，如茯磚茶中的“金花菌”-“冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)”，可產生芳樟醇氧化物、L-芳樟醇、1-辛烯-3-醇等多種風味物質，賦予茯磚茶特有的菌花香氣。謝瓦散囊菌(Eurotiumchevalieri)為濃香型和醬香型大曲中的優勢真菌[12-13]，目前相關研究主要集中在菌種的分離鑒定水平，對其風味物質的分析及茶香風味物質在大曲固態發酵中的作用還未見報道，對于微生物茶香風味物質對大曲及釀造白酒的酒體風味調節研究還處于空白階段。

本研究以分離自中高溫大曲的產香E.chevalieriCICC 41584為研究對象，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用方法檢測該菌株液體搖瓶發酵液中的揮發性風味物質，結合感覺閾值和相對氣味活度值(relative odor activity value, ROAV)確定其關鍵性風味物質，并將該菌種以菌劑形式應用于白酒大曲生產中，通過對強化大曲風味物質分析揭示該菌株對大曲風味品質的提升效果，為后續白酒風味品質的改善提升提供了可行性思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

EurotiumchevalieriCICC 41584分離于山東扳倒井股份有限公司濃香型白酒中高溫大曲，保藏于中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection, CICC)。

1.1.2 試劑及耗材

成品曲，山東扳倒井股份有限公司；麥芽浸粉，北京奧博星生物技術有限責任公司；蔗糖等其他試劑為國產分析純。

1.1.3 培養基

察氏瓊脂培養基(czapek dox agar, CDA)、麥芽浸粉肉湯培養基(malt extract broth, MEB)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar, PDA),北京陸橋技術有限公司。

種子液培養基：麥芽浸粉20 g/L，蔗糖40 g/L，121 ℃滅菌15 min。

發酵培養基：在MEB培養基中添加葡萄糖40 g/L，自然pH，121 ℃滅菌15 min。

麩皮固體培養基：麩皮25 g，與蒸餾水1∶1混合，121 ℃滅菌60 min。

1.2 儀器與設備

BHG-8082型恒溫培養箱、THZ-98C恒溫振蕩培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；ESCO B2型二級生物安全柜，北京五洲東方科技發展有限公司；固相微萃取裝置(備有85 μmPA萃取頭)，美國SupeLco公司；氣相色譜-質譜聯用儀，島津GC/MS-QP2010 Plus。

1.3 試驗方法

1.3.1 液體搖瓶發酵培養基的風味物質測定

1.3.1.1 菌株發酵液樣品制備

挑取1環活化好的菌株接入種子液培養基中，以2%接種量接入含有40 g/L葡萄糖的100 mL MEB發酵培養基中，于28 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養10 d。

1.3.1.2 揮發性風味物質固相萃取

取發酵液5 mL，并加入2 g NaCl，置于20 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入手動進樣器，在溫度60 ℃左右頂空萃取40 min后取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口，熱解吸3 min進樣，進行GC-MS分析。

1.3.1.3 氣相色譜和質譜條件(GC-MS)

氣相色譜條件：CP-WAX57CB毛細管柱(50 m×0.25 mm×0.2 μm)，柱溫采用程序升溫，初溫35 ℃，保持3 min后以3 ℃/min升溫至80 ℃，再以9 ℃/min升到200 ℃，保持20 min。載氣為高純He(99.999%)，流速1.0 mL/min；進口溫度230 ℃，不分流進樣1 min。質譜條件：電子電離源(elctronic ionization, EI)，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質譜掃描范圍50～500 amu。

1.3.1.4 定性定量方法

將得到的揮發性風味物質的質譜數據與NIST14標準庫進行對照匹配，取匹配度大于80的化合物保留分析，用于定性分析；定量分析采用峰面積歸一化法計算各成分相對百分含量。

1.3.2EurotiumchevalieriCICC 41584在濃香型白酒大曲生產中的強化應用

1.3.2.1EurotiumchevalieriCICC 41584菌劑制備

挑取1環活化好的菌株接入種子液培養基中，將種子液以10%接種量接種于麩皮固體培養基，28 ℃培養14 d，培養期間觀察有無雜菌污染。隨機選取1瓶培養好的麩皮培養物稱取5 g，稀釋10倍，吸取1 mL涂布于PDA平板上，28 ℃培養5 d，未觀察到有雜菌生長；檢驗合格后，用無菌長柄勺將麩皮培養物扣取至無菌的2 L燒杯中，搖勻，稱取1 g培養物溶解于2 mL無菌蒸餾水中，顯微鏡檢無雜菌孢子。將麩皮培養物轉入20 L旋轉蒸發儀旋瓶中，40 ℃水浴真空干燥24 h，水分控制到8%～10%(水分測定為8.7%)。通過250 W微型粉碎機粉碎30 s，過20目篩，菌粉封裝于無菌自封袋中，共141 g。稱取上述菌粉產品按照GB4789(霉酵計數方法)進行計數，其活菌落數為107～108CFU/g。

1.3.2.2EurotiumchevalieriCICC 41584強化方式及取樣方法

取上述制備好的Eurotiumchevalieri菌粉100 g溶解于15 L含20 g/L NaCl無菌蒸餾水中，采用微生物強化技術，將Eurotiumchevalieri菌劑應用于濃香型白酒中高溫大曲生產過程中。實驗室前期通過表面噴灑和內部混料2種方式對中高溫大曲進行了強化，對成品曲質量進行評價。結果表明內部混料方式強化大曲質量優于噴灑方式，后續強化試驗研究采用內部混料方式。

將不添加Eurotiumchevalieri菌劑的一房大曲作為對照，另一房大曲通過內部混料方式添加Eurotiumchevalieri菌劑，加入8～9 mL終濃度為1.2×105CFU/mL的菌液，每個曲房大約1 700塊。為保證采樣均一性，使用五點法結合四分法進行采樣[14-15]。具體采樣方式：在曲房的四角和中間5個位置各取1塊長勢良好的成品曲塊，粉碎后混合均勻，四分法進行采樣，供后續試驗使用。

1.3.3 強化大曲感官指標測定

根據文獻中大曲評價方法的描述對強化成品曲和對照成品曲進行感官指標評價[14]。

1.3.4 強化大曲風味物質測定

取粉碎均勻成品曲1 g，根據上述方法對強化大曲和對照大曲揮發性風味物質進行測定分析。

1.3.5 特征香氣成分評價方法

參考劉登勇等[16]的方法，特征香氣成分評價采用氣味活度值法(odoractivity value, OAV)評價各揮發性成分對樣品總體香氣的貢獻，即氣味OAV為各香氣組分的濃度(C)與感覺閾值(T)的比值：OAV=C/T。當OAV<1時，說明該物質對總體香味無影響；當OAV>1時，說明該物質可能對總體香味有直接影響；在一定范圍內，OAV值越大說明該物質對總體風味貢獻越大。

采用峰面積歸一化法計算得到的揮發性香氣組分濃度為相對濃度(Cr)，用相對濃度代替絕對濃度。將OAV值最大的香氣組分作為標準，其他組分的OAV值與之相比，進而定義為相對氣味活度值(relative odor activity value, ROAV)[16-18]，即各化合物的ROAVi為各香氣組分的OAVi值與OAVmax值最大的香氣組分的比值，即ROVAi=(OAVi/OAVmax)×100。

本研究認為ROAV≥1的組分為所分析樣品的關鍵風味化合物，0.1≤ROAV<1的組分對樣品的總體風味具有重要的修飾作用[16-18]。

2 結果與分析

2.1 Eurotium chevalieri CICC 41584發酵液風味物質測定

EurotiumchevalieriCICC 41584接種于發酵培養基中，28 ℃振蕩培養10 d后，發酵液嗅覺感官為茶香、青草香，通過HS-SPME-GC-MS方法對發酵液揮發性風味物質進行檢測，鑒定結果見表1。Eurotiumchevalieri發酵液共檢測到45種揮發性物質，其中醇類21種，醛類3種，酮類3種，酯類4種，酚類2種，烴類9種，酸類1種，其他2種。

表1 謝瓦散囊菌發酵液揮發性香氣成分GC-MS鑒定結果Table 1 Indentification of aroma compounds of Eurotium chevalieri fermentation broth by GC-MS

續表1

編號組分名稱相對含量/%閾值/(μg·L-1)[19]ROAV風味描述35苯并噻唑1.01--似喹啉氣味,米糠香氣或糯米香36月桂酸0.65--微有月桂油香味37十四烷0.51--/38十五烷2.02--/39長葉烯0.44--/40十六烷3.17--/41降姥鮫烷1.2--/42姥鮫烷3.33--/43十七烷3.36--/44十八烷2.68--/45十九烷1.54--/

注：閾值為酒精水溶液中的嗅覺閾值；“-”表示因為未查到該化合物的感覺閾值；“/”表示該化合物為非風味物質。下同。

對Eurotiumchevalieri發酵液揮發性物質進行特征風味物質成分分析，共有16種物質與茯磚茶中風味物質一致[20-23]，其中7種物質是茯磚茶中普遍存在的風味物質，包括1-辛烯-3-醇、芳樟醇、香葉醇、橙花叔醇、苯乙酮、香葉基丙酮、棕櫚酸甲酯。另外檢出了2,4-二叔丁基苯酚、十七烷、十六烷、柏木醇、十八烷、正辛醇(1-辛醇)、萜品醇(松油醇)、癸醛、壬醛。

由表1可知，1-辛烯-3-醇、芳樟醇(里哪醇)、癸醛和香茅醇的ROAV值均大于1，是Eurotiumchevalieri發酵液中關鍵風味化合物。其中，1-辛烯-3-醇具有青草香、水果香、蘑菇香和油脂風味[19]，芳樟醇具有綠茶青香、木青氣息、玫瑰的花香[24]，葵醛具有醛香、蠟香、脂肪、柑桔香氣[25]，香茅醇具有糖果香、玫瑰香、柑橘香[17]，這些關鍵風味物質為發酵液獨特的風味特征做出了主要貢獻。芳樟醇、橙花叔醇等萜烯類物質不僅是呈香物質，也是健康生物活性成分[26]。另外，橙花叔醇含量為0.72%，具有干甜而少清，帶有像玫瑰、鈴蘭和蘋果花的氣息，微帶木香，香氣持久等特征[27]；柏木醇含量為3%，具有溫和的柏木芳香，該類物質會使白酒香氣更加復合、濃郁、綿柔[28]，也對發酵液風味具有重要貢獻。發酵液中的香氣物質1-辛烯-3-醇和芳樟醇的ROAV值分別為100和26.87，ROAV值較高，為風味主導成分，表現為茶香型風味，符合菌種發酵液的茶香嗅覺風味。

2.2 強化大曲感官評價結果

對成品曲進行大曲表觀觀察(圖1)，并進行感官評價。結果表明，對照大曲未見黃色菌斑，強化大曲內部具有大量金黃色菌斑(Eurotiumchevalieri)，斷面整齊，較泡氣，曲香濃郁純正，無異味且具有茶香風味，具體感官描述見表2。綜合對照大曲和強化大曲的表觀形態，得出EurotiumchevalieriCICC 41584強化大曲在感官指標方面明顯優于對照大曲，且強化大曲達到優級曲水平，EurotiumchevalieriCICC 41584強化提高了大曲品質。

a-對照大曲;b-強化大曲圖1 中高溫大曲表觀形態Fig.1 The surface morphology of medium hightemperature daqu

表2 中高溫大曲感官特征及評價結果Table 2 The sensory characteristics and evaluation results of medium high temperature Daqu

2.3 強化大曲風味物質測定結果

采用HS-SPME-GC-MS方法檢測強化大曲與對照大曲的揮發性風味物質成分，并根據香氣閾值和ROAV對其進行主體香氣成分評價，結果見表3。由表3可知，強化大曲檢測出55種揮發性風味物質，其中醛類3種、醇類18種、酮類5種、酯類4種、吡嗪類8種、酸類8種、烴類7種、酚類1種、其他1種；對照大曲檢測出55種揮發性風味物質，醛類4種、醇類16種、酮類4種、酯類6種、吡嗪類8種、酸類5種、烴類8種、酚類2種、其他2種。

表3 對照大曲和強化大曲風味物質相對含量及相對氣味活度值Table 3 Flavor substance relative content and ROAV of contrast Daqu and intensified Daqu

續表3

序號組分名稱對照大曲相對含量/%強化大曲相對含量/%閾值/(μg·L-1)[19]對照大曲ROAV強化大曲ROAV風味描述46β-乙基苯乙醇0.18----/47乙酸3.2125.712 6006.586.88酸味中帶有刺激性臭味48丙酸0.040.3520 0000.010.01聞有酸味、進口柔和微澀49異戊酸1.635.911 045.478.303.93汗臭、酸臭、脂肪臭50壬酸0.050.353 559.230.070.07脂肪臭51肉豆蔻酸0.120.49---/52異丁酸-2.788 200-0.24似丁酸樣氣味53己酸-0.072 517.16-0.02汗臭、動物臭、酸臭,甜香、水果香54葵酸-0.2213 736.77-0.01山羊臭、酒稍子臭、膠皮臭、油漆臭55石竹烯0.171.36---/56長葉烯0.07----/572-甲基乳酸乙酯0.09----/58乙酸苯乙酯0.03----/59肉豆蔻酸甲酯0.04----/60棕櫚酸甲酯0.100.25---微弱蠟香、果爵和奶油香氣61棕櫚酸乙酯0.221.4314 0000.080.07蘋果香,味微甜,帶澀62油酸乙酯0.080.521000.430.36白色結晶,微有油味,脂肪氣味不明顯63苯酚0.08-18 909.340.02-來蘇水、似膠水、墨汁644-乙烯基愈創木酚0.402.01122.7417.3611.39香瓜香、水果香、甜香、花香

注：閾值為酒精水溶液中的嗅覺閾值；“-”表示因為未查到該化合物的感覺閾值和未檢測出此物質；“/”表示該化合物為非風味物質。

對大曲特征香氣物質成分進行分析，強化大曲中的1-辛烯-3-醇、芳樟醇(里哪醇)、異戊醛、乙酸、異戊酸和4-乙基愈創木酚ROAV值大于1，是強化大曲的關鍵風味物質。3-羥基-2-丁酮、正丁醇、2,6-二甲基吡嗪、異丁酸、油酸乙酯ROAV值在0.1～1之間，對強化大曲的總體風味起修飾作用。在對照大曲中異戊醛、3-羥基-2-丁酮、2,6-二甲基吡嗪、糠醇、β-苯乙醇、乙酸、異戊酸、4-乙基愈創木酚ROAV值>1，為關鍵風味化合物。此外，2,3-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪、正丁醇、苯甲醛、苯甲醇、油酸乙酯ROAV值在0.1～1之間，為對照大曲的總體風味具有重要的貢獻作用。

結合菌株發酵液風味物質分析，強化大曲檢測出關鍵性風味物質1-辛烯-3-醇、芳樟醇，且ROAV值較高，為強化大曲主導型風味物質，賦予大曲清香、青草香風味；對照大曲未檢測出1-辛烯-3-醇和芳樟醇。EurotiumchevalieriCICC 41584強化大曲曲香濃郁，主導型風味物質更接近于發酵液主導風味物質。

對強化大曲風味物質中的功能因子進行分析，結果見表4。一些醇類、酸類等健康因子對大曲風味貢獻較小，但含量高于對照大曲。在強化大曲中檢測到的活性戊醇、異戊醇和α-苯乙醇峰面積明顯高于對照大曲，分別是對照大曲的3.25、1.67和4.84倍，這些醇類化合物的風味閾值普遍較高，對大曲整體風味貢獻較小。強化大曲中正丁醇峰面積比對照大曲提高144.91%，對大曲具有助香作用，對形成酒的風味和促使酒體豐滿、濃厚起著重要的作用。強化大曲中的乙酸和4-乙基愈創木酚峰面積明顯高于對照大曲，比對照大曲分別提高了86.25%和19.25%，且在對照大曲中未檢測出芳樟醇。這3種物質都為關鍵風味物質并具有多種活性功效。芳樟醇具有抗菌、抗病毒及抗炎等活性功效[26]，乙酸具有促進胃液分泌、幫助消化、降血脂、降膽固醇、擴張血管、延緩血管硬化等功能[29]，Eurotiumchevalieri產生健康因子阿魏酸，經菌株強化之后會轉化為4-乙烯基愈創木酚，4-乙烯基愈創木酚具有較好的抗氧化、抗腫瘤和增強人體免疫力的作用[30]。強化大曲香葉基丙酮峰面積為89 618.391 62，是對照大曲的1.1倍，菌種搖瓶發酵液產生香葉基丙酮物質，經強化之后大曲中香葉基丙酮含量提高。強化大曲2,6-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪和四甲基吡嗪峰面積分別達到335 701.026 9、2 227 155.516和848 127.033 8，分別比對照大曲提高7.90%、47.59%和43.73%，明顯高于對照大曲，這些物質都是白酒健康因子，具有抗氧化，增強免疫力等功效[26]。強化大曲2,3-丁二醇含量降低，可經過一系列轉化生成乙酸和四甲基吡嗪[31]。EurotiumchevalieriCICC 41584強化大曲有助于提高大曲品質，為進一步研究白酒風味奠定基礎，對改善酒體風味提供理論參考。

表4 對照大曲和強化大曲風味物質的峰面積Table 4 Peak area of contrast Daqu and intensified Daqu flavor substance

3 結論

本研究解析了EurotiumchevalieriCICC 41584發酵液茶香關鍵風味物質組成情況，EurotiumchevalieriCICC 41584可產生以1-辛烯-3-醇、芳樟醇(里哪醇)、癸醛、香茅醇為關鍵揮發性風味化合物，其中1-辛烯-3-醇和芳樟醇(里哪醇)ROAV值分別為100和26.87，對發酵液風味貢獻巨大，表現為茶香型風味。將該菌株強化于白酒大曲中，對比分析了強化大曲和對照大曲關鍵揮發性風味物質，強化大曲關鍵風味物質為1-辛烯-3-醇、芳樟醇、異戊醛、乙酸、異戊酸、4-乙基愈創木酚，其中1-辛烯-3-醇、芳樟醇ROAV值較高，為主導型風味，與Eurotiumchevalieri純菌種發酵液主導茶香型風味物質1-辛烯-3-醇和芳樟醇結果一致。揭示了該菌株對大曲風味品質的提升效果，為后續的白酒風味品質改善提供理論基礎。