蘋果多酚處理后冰鮮大黃魚貯藏期間品質與水分遷移的變化

王蒙，藍蔚青,2,3,4*，邱澤慧，傅子昕，鞏濤碩，謝晶,2,3,4*

1(上海海洋大學 食品學院，上海,201306) 2(上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海,201306)3(上海冷鏈裝備性能與節能評價專業技術服務平臺，上海,201306)4(食品科學與工程國家級試驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海,201306)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)又名黃花魚，屬鱸形目石首魚科海產經濟魚類，其肉質細嫩鮮美，營養豐富，是我國經濟魚類之一[1]。然而，其為多脂魚，易發生脂肪氧化酸敗，同時在貯藏期間還易受到微生物與酶的作用，易發生腐敗變質，貨架期相應縮短。

近年來，隨著抗氧化劑在冷卻肉中的廣泛應用，天然植物抗氧化劑逐漸引起人們的關注。國內外科研人員現已研究了植物提取物對水產品的保鮮作用，如花椒葉[2]、迷迭香[3]、葡萄籽等提取物[4]，為植物源提取物的開發利用提供了良好的研究基礎。蘋果多酚(apple polyphenols, AP)是蘋果果實在生長發育期間產生的次生代謝物。其主要成分為單環酚酸、黃烷-3-醇類、原花色素類、黃酮醇類、二氫查爾酮和花色苷等化合物[5]。據荷蘭、美國等營養學家調查，蘋果是繼茶與洋蔥后的第3大酚類物質膳食來源，具有良好的應用前景。其中，前期報道提及的蘋果多酚已被用于魚的抑臭試驗，取得了良好效果[6]。夏凡[7]研究發現蘋果多酚能有效延長真空包裝冷卻豬肉的貨架期；SUN等[8]研究得出殼聚糖-蘋果多酚膜可作為包裝材料，延長冷藏草魚片的貨架期。目前蘋果多酚在水產品保鮮應用處于起步階段，基于此，本研究將不同濃度的蘋果多酚用于冰藏大黃魚片保鮮處理，通過貯藏期間的理化指標(pH值、色差、TBA值、TVB-N值、總巰基含量、持水率)、微生物指標(菌落總數、嗜冷菌數)與感官分析，并結合低場核磁共振和核磁成像技術，以綜合評價不同濃度蘋果多酚對冰藏大黃魚品質與水分遷移變化的影響，從而為植物源提取物在水產品保鮮中的應用研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

新鮮大黃魚購于上海浦東新區蘆潮港海鮮批發市場，重量為(500±50) g，體長為(340±20) mm，選擇體態勻稱，鱗片完整且緊貼，魚鰓鮮紅清晰、眼球飽滿的黃魚。購后立即置于碎冰上，層冰層魚處理，30 min內運至試驗室進行試驗。

1.2 主要藥品試劑

蘋果多酚(食品級，純度≥98%)，上海維編科貿有限公司；蛋白定量測試盒，南京建成生物工程研究所；平板計數瓊脂(plate count agar, PCA)，青島高科技工業園海博生物技術有限公司；輕質氧化鎂、硼酸、95%(體積分數)乙醇溶液、NaCl、NaOH、HCl、石油醚、乙酸、異辛烷、KI、硫代硫酸鈉、三氯乙酸(trifluoroacetic acid, TCA)、2-硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)、氧化鎂、硼酸、甲基紅/藍、Tris試劑、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍、溴苯酚藍等(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器設備

FE20型pH計，梅特勒-托利多(上海)有限公司；CR-400型色彩色差計，日本柯尼卡美能達(中國)儀器有限公司；H-2050R型臺式高速低溫離心機，湖南湘儀試驗室儀器開發有限公司；Kjeltec8400型凱氏定氮儀，丹麥FOSS中國上海有限公司；JX-05拍打式無菌均質器，上海凈信實業發展有限公司；AUW320型分析天平，日本島津公司；DHG-9053A型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；LDZM-40KCS-Ⅲ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療機械廠；VS-1300L-U型超凈臺，蘇凈安泰集團；生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；Meso MR23-060H-I型核磁共振分析及成像系統，上海紐邁電子科技有限公司；Synergy2型自動酶標儀，美國BioTek公司。

1.4 原料處理

將新鮮大黃魚去頭、去尾、去內臟并清洗后隨機分成4組，每組14條魚。參考文獻[9-10]及前期預試驗，將樣品分別置于0.25、0.50、1.00 g/L的AP液中，以無菌水處理為對照組(CK)。樣品浸漬處理15 min后瀝水，隨機裝入PE保鮮袋內，輔以層碎冰層魚，模擬超市商品陳列方式，將其置于4 ℃貯藏，分別于0、2、4、6、8、10、12、14 d進行相關指標測定。

1.5 試驗方法

1.5.1 pH值

根據李穎暢等[11]方法測定pH值。稱取5 g魚肉，加入45 mL蒸餾水，均勻靜置30 min后過濾，取濾液測定其pH值，每個樣品重復測定3次，取平均值。

1.5.2 色差

參考THIANSILAKUL等[12]方法測定其色澤。使用色差計對樣品表面進行檢測，得到L*和b*，其中L*表示亮度值，b*表示黃度值。每個樣品選取5個位點進行檢測，并加以標記，盡量使樣品間測定位點一致，減小誤差。取5個位點的平均值作為其色差值。

1.5.3 TBA值

參考SANCHEZ-ALONSO等[13]方法，稱取魚肉5.00 g加入50 mL離心管，隨后加入25 mL 200 g/L的TCA，均質后靜置1 h，經4 ℃，8 000 r/min離心10 min后過濾，用蒸餾水定容至50 mL，取濾液5 mL加入5 mL 0.02 mol/L的TBA溶液混勻，沸水浴20 min，冷卻后在532 nm處用分光光度計測定其吸光度(A)。結果以1 kg魚肉中產生的丙二醛(malondialdehyde, MDA)質量(mg)計，即單位為mg/kg。根據吸光度A和標準曲線計算TBA值。

1.5.4 TVB-N值

根據鄧輝萍[14]方法略有修改，稱取大黃魚肉5 g，利用全自動凱氏定氮儀進行樣品TVB-N值測定，平行測定3次，結果以mg N/100 g表示。

1.5.5 總巰基含量

根據巰基測定試劑盒進行分析，先配制標準應用液，以肌動球蛋白溶液為待測樣本。使用總巰基測定試劑盒說明書的方法計算總巰基含量。

1.5.6 菌落總數與嗜冷菌數

參照GB 4789.2—2016[15]進行測定。稱取10 g魚肉于滅菌袋中，加入90 mL 0.85%(質量濃度)無菌生理鹽水，拍打均勻，以10倍梯度稀釋，取3個合適的稀釋度，各取1 mL于無菌培養皿內，每個稀釋度作3個平行，以不添加滅菌稀釋液作對照試驗。平板分別在(30±1) ℃培養(72±3) h，(4±1) ℃培養10 d后計算菌落總數與嗜冷菌數，結果以lg CFU/g表示。

1.5.7 感官分析

根據AOAC[16]規定，并結合GB/T 18108—2008[17]和SC/T 3101—2010[18]，進行新鮮大黃魚魚肉的感官指標制表，具體評分標準見表1。

表1 大黃魚感官評價表Table 1 Sensory evaluation standards of Pseudosciaena crocea

感官評定人員由6名經過專門訓練的試驗人員組成，各指標評分為5時表示樣品品質最佳，評分下降則表示魚肉塊品質劣變[19]，各項得分低于2則視為感官排斥點。

1.5.8 持水率

參考李長樂等[20]方法并稍作修改，取3 g樣品放在濾紙中包裹，置于離心管中，在3 000 r/min下離心10 min，瀝干體表水分稱量質量，重復3次，取平均值。持水率計算方法如公式(1)所示：

(1)

1.5.9 低場核磁共振與核磁成像分析

按照CAO等[21]方法測定稍有修改。將魚肉切成2 cm×2 cm×1 cm魚塊。擦干樣品表面水分，稱重，保鮮膜包裹后，將其放入核磁管(15 mm×200 mm)中并置于分析儀中。共振頻率為100 kHz。重復掃描次數為4，回波個數為8 000，通過(Carr-Purcell-Meiboom-Gill, CPMG)脈沖序列采集樣品橫向弛豫時間(T2)。2次連續掃描之間的重復時間為3.5 s，脈沖間的τ值為150，μs為90°和180°。T2分布通過MultiExp Inv分析軟件獲得。CPMG測試后的樣品進行MSE序列成像測試，運用MRI成像軟件及MSE多層自旋回波序列采集樣品冠狀面質子密度像。

1.6 數據處理

每個樣品設3個平行，采用SPSS 17.0軟件進行數據分析，試驗數據采用ANOVA進行鄧肯氏(Duncan’s)差異分析，結果以平均值±標準偏差表示，P<0.01為極顯著，P<0.05為顯著，P>0.05為不顯著，并使用Orgin 8.5繪圖。

2 結果與分析

2.1 pH值

水產品在貯藏期間，其pH通常呈先降后升趨勢，其原因可能由于水產品死后會經歷僵直、解僵、自溶及腐敗階段。在初期僵直階段，其體內糖原發生糖酵解反應，產生乳酸、磷酸等酸性物質，使pH值下降[22]；隨著貯藏時間的延長，魚體蛋白酶分解及微生物作用產生氨及胺類物質，導致pH值升高[11]。

如圖1所示，貯藏初期，所有組別樣品均呈下降趨勢，可能由于魚體此時正處于僵直階段。第2天后，各組樣品的pH值逐漸升高，反映其品質劣變。其中，經蘋果多酚處理后大黃魚pH值的升幅緩于CK組，可能是由于蘋果多酚的酚羥基會游離出H+，使處理組樣品的pH值上升速度減緩[23]。其中，AP3組樣品的pH值明顯低于其余各組。

圖1 蘋果多酚處理對冰藏大黃魚pH值變化影響Fig.1 Effects of apple polyphenols on the change of pHvalue in Pseudosciaena crocea during ice storage

2.2 色差

水產品在貯藏期間，色澤易發生改變，因此色差值可作為評價魚肉品質與鮮度的重要指標之一[24]。

由表2可知，各組別在貯藏期間的L*值差異顯著(P<0.05)。與CK組相比，AP處理組樣品的L*值略高，不同AP組間總體變化趨勢一致，其中AP2組的L*值在第14天略高于AP3組，可能由于多酚類黃酮化合物的降解使AP組樣品的L*值增高[25]。而AP各組間的b*值差異不明顯(P>0.05)，可見蘋果多酚具有一定的護色作用，能延緩大黃魚冰藏期間的色澤改變，本研究結果與SHI等[26]一致。同時，微生物增殖與脂肪氧化也會影響其色澤變化，細菌生長過程中的副產物如H2S與H2O2等，其可結合不穩定蛋白，從而生成呈色蛋白使肉色改變。此外，脂肪也會因其發生氧化而使肉色變暗[7]。

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表2 蘋果多酚處理對冰藏大黃魚色差變化影響Table 2 Effects of apple polyphenols on the change ofL* and b* value of Pseudosciaena crocea during ice storage

注：表中數據為樣品的“平均值±標準差”(n=3)；同一列中的不同字母表示差異顯著(P<0.05);“-”表示未檢出。

2.3 TBA值

大黃魚中的不飽和脂肪酸，在貯藏期間易氧化酸敗，經氧化分解后產生的MDA，其會與TBA試劑發生顏色反應[27]。因此，TBA值可用于評價魚類貯藏過程中的品質變化。

由圖2可知，各組樣品的TBA值隨貯藏期的延長而逐漸升高，表明其氧化加劇。其中，CK組樣品的TBA值在冰藏12 d后增至1.94±0.236 mg/kg，魚肉已發生酸敗。其中，AP3組樣品的TBA值變化幅度最低，其在冰藏期間均未超過1.5 mg/kg，與AP2組無顯著差異(P>0.05)。可能由于多酚由1個或多個帶有極性羥基(—OH)的疏水性芳香核組成，能提供大量的活性羥基，對樣品脂質中游離自由基抑制或清除作用較強，能有效抑制脂肪酸敗，延長其貨架期[28]。王丹丹等[29]研究發現，茶多酚能有效抑制帶魚片脂肪的氧化酸敗，這與本研究結果一致。也與SUN等[8]研究結果相似。

圖2 蘋果多酚處理對冰藏大黃魚TBA值變化影響Fig.2 Effects of apple polyphenols on the change of TBAvalue in Pseudosciaena crocea during ice storage

2.4 TVB-N值

TVB-N值是評價水產品腐敗變質的指標之一，反映水產品中蛋白質因微生物與內源性酶作用分解蛋白質和非蛋白物質，積累的具有揮發性的氨二甲胺與三甲胺等低級胺類含量[30]。據SC/T 3101—2010鮮凍大黃魚標準[18]，TVB-N值≤13 mg/100 g為一級鮮度，13 mg/100 g

由圖3可知，隨著貯藏時間延長，樣品的TVB-N值呈先緩升后加速上升趨勢，變化過程與TBA值相似。第0天，樣品的TVB-N值達(10.69±0.114) mg/100 g，處于一級鮮度。貯藏初期，各組樣品的TVB-N值緩增，無明顯差異(P>0.05)。冰藏第6天時，CK組樣品的TVB-N值達(13.13±0.58) mg/100 g，超過一級鮮度，此時AP1組樣品的TVB-N值上升加速；第10天后，AP2與AP3組樣品的TVB-N值迅速增加，結合TBA值分析可見大黃魚在第10天時品質明顯劣變；第12天時，CK組樣品的TVB-N值達(32.90±1.655) mg/100 g，超出二級鮮度。AP3組樣品的TVB-N值在第14天后才增至(32.04±0.626) mg/100 g，超出鮮度限值。表明蘋果多酚處理能有效抑制魚肉中的蛋白質變性，一定程度上延緩其腐敗。魏勝華等[31]研究發現黃酮類化合物對微生物有抑制作用，降低其脫氨脫羧反應，減少含氮類化合物的生成。

圖3 蘋果多酚處理對冰藏大黃魚TVB-N值變化影響Fig.3 Effects of apple polyphenols on the change ofTVB-N value in Pseudosciaena crocea during ice storage

2.5 總巰基含量

總巰基含量反映了樣品中的蛋白質變性聚合程度，是肉制品中蛋白質氧化的標志之一[32]。其主要由于樣品在冰藏過程中，其肌原纖維蛋白分子構象發生變化，暴露于蛋白質表面的半胱氨酸殘基氧化成二硫鍵，使總巰基含量相應減少[33]。

由圖4可知，第0天時，大黃魚樣品的總巰基含量為(78.68±1.615) nmol/mg。隨著貯藏時間延長，各組樣品的總巰基含量呈遞減趨勢，這是由于冰藏期間，魚肉中的肌原纖維蛋白結構改變，使分子內部的巰基暴露，其在內源酶的作用下發生降解，且易發生氧化并與二硫化物置換，使巰基含量減少[34]。其中以CK組降幅最明顯，AP1、AP2與AP3組樣品總巰基含量的下降趨勢有所減緩。貯藏末期，CK、AP1、AP2與AP3組樣品的總巰基含量分別為初期的28.30%、33.34%、36.49%與37.17%，可見蘋果多酚能延緩樣品中總巰基含量的下降。RAMIAREZ等[35]提出抗氧化劑能與蛋白質結合，減緩其氧化降解。

圖4 蘋果多酚處理對冰藏大黃魚總巰基含量變化影響Fig.4 Effects of apple polyphenols on the change ofsulfhydryl content in Pseudosciaena crocea duringice storage

2.6 菌落總數與嗜冷菌數

參照相關文獻[36]可知，菌落總數<104為一級鮮度；104≤菌落總數<106為二級鮮度；菌落總數>106為魚肉腐敗。

由圖5可知，貯藏初期，樣品的TVC值與PBC值分別為(3.71±0.014) lg CFU/g與(2.87±0.120) lg CFU/g，處于一級鮮度。隨著貯藏時間的延長，各組樣品的微生物指標均呈遞增態勢。其中，CK組樣品的TVC值在第8天時達(6.84±0.078) lg CFU/g，超出鮮度限值；此時，AP1、AP2與AP3組樣品的TVC值分別為(6.28±0.050) lg CFU/g、(6.14±0.120) lg CFU/g與(5.55±0.007) lg CFU/g，表明蘋果多酚對微生物生長有較好的抑制作用。樣品PBC值的變化趨勢與TVC類似，CK組樣品在貯藏期間的PBC值增幅明顯快于AP組，其在第6天時超出鮮度限值，而AP1、AP2與AP3組則分別在第8、10與12天時才達到腐敗階段。可能由于酚類化合物能導致菌體細胞膜損傷，對其生長代謝造成影響[37]。

圖5 蘋果多酚處理對冰藏大黃魚菌落總數(a)與嗜冷菌數(b)變化影響Fig.5 Effects of apple polyphenols on the change ofTVC(a) and PBC(b) in Pseudosciaena crocea duringice storage

2.7 感官分析

魚和魚類產品在貯藏過程中的直觀可接受性取決于其感官變化，也決定了消費者的購買意愿。大黃魚在冰藏期間的感官變化如圖6所示。

a-黏性；b-氣味;c-質地圖6 蘋果多酚處理對冰藏大黃魚感官分值變化影響Fig.6 Effects of apple polyphenols on the change of sensory evaluation in Pseudosciaena crocea during ice storage

由圖6可知，隨著貯藏時間的延長，大黃魚樣品的黏性、氣味與質地均有所下降。貯藏前4 d時，各組樣品的黏性和質地變化無明顯差異(P>0.05)。但在貯藏6 d后，CK組樣品體表黏液明顯增多且渾濁，腥味加重，腐敗氣味明顯。對質地而言，各組樣品變化無明顯差異(P>0.05)，但在貯藏末期呈松軟狀態。CK組樣品在貯藏末期腐敗氣味明顯，質地松軟，體表發黃，而AP處理組樣品仍在可接受范圍。

2.8 持水率

持水率可反映樣品中蛋白質的網絡結構，其凝膠結構越均勻致密，樣品的持水率則越好[38]。不同蘋果多酚對冰藏大黃魚持水率變化影響如圖7所示。

圖7 蘋果多酚處理對冰藏大黃魚持水率變化影響Fig.7 Effects of apple polyphenols on the change of waterholding capacity in Pseudosciaena crocea during ice storage

由圖7可知，大黃魚在貯藏初期無顯著差異(P>0.05)，從第6天起，各組樣品的持水率急速降低，AP處理組樣品持水率降幅低于對照組。與初始值相比，第12天時，CK、AP1、AP2與AP3組樣品的持水率分別下降了12.08%、10.72%、9.17%與8.72%，表明蘋果多酚能抑制魚肉持水率的下降。可能由于多酚含有豐富的活性羥基，能與魚肉蛋白較好結合，從而截留更多水分[39]。其中以AP3組樣品的持水率最高，表明其保水性能最佳。

2.9 低場核磁共振與核磁成像分析

近年來，低場核磁共振(LF-NMR)和核磁成像(MRI)技術已成為表征食品加工貯藏過程中水動力變化的有效工具[40]。LF-NMR弛豫時間T2譜圖的結果可在一定程度上反映肌肉中水分分布、遷移情況以及肌原纖維蛋白完整性。如圖8所示，各組中T2的弛豫時間譜圖均顯示出3個峰，分別對應3種水分相態，其中T21峰(0.01～10 ms)，主要涉及與大分子緊密結合的水；T22峰(10～200 ms)，與具有高度組織性的蛋白質結構內部的水有關；T23峰(>200 ms)，對應于蛋白質結構外部的水。

圖8 蘋果多酚處理對冰藏大黃魚弛豫時間變化影響Fig.8 Effects of apple polyphenols on the change of transverse relaxation time in Pseudosciaena crocea during ice storage

由圖8可知，隨著貯藏時間的延長，各組樣品T21無明顯變化，T22和T23逐漸右移且弛豫時間增加，T22處對應的峰面積呈緩慢下降趨勢，表明水分流動性增大，水分子更自由。

由核磁共振反演軟件得到的峰面積結果可計算出肉中不同狀態水分所占的比例(pT21(%)、pT22(%)、pT23(%))。4種濃度的蘋果多酚對大黃魚各組分水分變化影響如表3所示。

表3中，pT22占最大比例，表明樣品中最主要水分為肌原纖維網絡中的水。隨著貯藏時間延長，pT22逐漸降低，而pT23逐漸升高，表明與蛋白質緊密結合水向自由水轉變。AP3處理組總體保持最大峰面積比例，說明水分子與大分子結構結合效果最緊密且優于其他組，蘋果多酚降低了魚體內的自由水流動，與持水率結果一致。

核磁成像偽彩圖中的紅色表示1H質子(H2O)質子密度高，該部分的水含量越高，藍色表示水含量最低，通過信號顏色變化反映樣品中水分含量及遷移規律[41]。結果顯示，大黃魚新鮮魚肉中非結合水流動性較強，整體呈紅色。在整個貯藏期間，其水分變化明顯，隨著貯藏時間的延長，樣品圖像逐漸趨于藍色，表明樣品表面水分逐漸增多。其中，CK組魚肉中的紅色區域逐漸變小，第6天變成黃色。而AP處理組樣品的顏色轉變速度較CK組慢，AP3組直到第12天仍呈淺紅色，可見其水分流失最少，該研究結果與前期持水率變化結果相似。水分遷移規律也與車旭[42]將植物源保鮮劑作用于鯧魚的低場核磁測定結果一致。

表3 蘋果多酚處理對冰藏大黃魚各組分水分的百分含量pT2i變化 單位：%

3 結論

試驗研究了不同濃度蘋果多酚對冰藏大黃魚貯藏期間品質、蛋白質特性與水分遷移變化影響。結果表明，AP處理組樣品的pH值、TBA值、TVB-N值與微生物指標均明顯低于CK組，表明蘋果多酚具有較好的抗氧化與抑菌效果。通過總巰基含量、持水率與低場核磁共振分析得出，AP處理組的蛋白質結構穩定性與持水能力均較CK組好。AP浸漬處理能在一定程度上延緩大黃魚魚肉的腐敗變質，其中以1.00 g/L蘋果多酚(AP3)處理組效果最佳。綜合各評價指標，蘋果多酚處理能延長大黃魚的冰藏貨架期2～4 d。