蜂蜜中羥甲基糠醛的脫除

張穎，王宇翔，張錦錦，孫婧，曹煒

(西北大學 食品科學與工程學院，陜西 西安，710069)

蜂蜜含有葡萄糖、果糖、蛋白質、維生素、有機酸、酚酸、黃酮、酶、礦質元素、芳香物質等多種成分，具有抑菌、抗氧化、抗炎、護肝、潤腸、提高免疫力以及抗癌等功效[1-3]，不僅是一種價值極高的藥食兩用天然食品，還被作為添加劑廣泛應用于各類食品加工中，深受消費者青睞[3-4]。

5-羥甲基糠醛(5-hydroxymthylfurfural, 5-HMF)是蜂蜜中容易產生的一種黑色、難聞物質，其在新鮮蜂蜜中幾乎不存在，但經熱加工或貯存條件差(溫度升高、貯藏時間過長等)時，蜂蜜中氨基化合物和羰基化合物在酸性條件下容易發生美拉德反應，5-HMF大量生成[5-6]。5-HMF對皮膚、眼睛及黏膜具有刺激性，攝入過多會對人體組織器官造成傷害，如損傷橫紋肌麻痹和內臟，甚至引發癌癥[6-7]。因此，在國際貿易中，5-HMF作為蜂蜜檢測指標，含量應≤40 mg/kg[6]。然而，目前我國蜂產品市場上，蜂蜜中5-HMF含量超標現象嚴重。2016年北京東城區食藥監控中心抽檢115批次市售蜂蜜，發現42批次超出5-HMF標準值，部分產品中5-HMF含量高達100 mg/kg以上[8]。對于5-HMF含量超標的蜂蜜，國外通常是將其進行銷毀處理，但實際上這種蜂蜜中仍含有很多營養成分和活性物質，直接銷毀是巨大的資源浪費。如能采取合適的技術手段先脫除或降低蜂蜜中超標5-HMF，然后再將其作為甜味劑、飼料成分或生物質能源等應用于食品加工或其他領域，對實現不合格蜂蜜的資源再利用具有重要意義。

連會[9]和宋秀超[10]采用活性炭吸附法研究蜂蜜中5-HMF的脫除技術，但活性炭吸附選擇性較差、機械強度低、使用壽命短、運行費用較高。相比之下，大孔樹脂吸附法具有選擇性好、吸附容量大、吸附迅速及可再生等優點[11]，在天然產物脫色、食品農殘和毒素脫除等方面已顯示出巨大優勢[12-15]。然而，目前缺乏利用大孔樹脂吸附技術脫除蜂蜜中超標5-HMF的研究。本文采用靜態吸附法，比較不同類型大孔吸附樹脂對蜂蜜中5-HMF的脫除效果，分析吸附工藝條件對5-HMF脫除的影響，以期為實現5-HMF超標蜂蜜的資源再利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

洋槐蜜，陜西永壽(2017年)；龍眼蜜、荔枝蜜，廣西(2011年)；枸杞蜜、蕎麥蜜，寧夏(2013年)；荊條蜜，陜西周至(2012年)；油菜蜜，青海青藏生物資源開發有限公司。所有蜂蜜樣本運至實驗室后4 ℃貯存待用。LSA-960、XDA-300、LSI-3、LX-260和LX-670型大孔樹脂，西安藍曉科技公司，5種大孔樹脂參數見表1。

表1 5種大孔吸附樹脂參數Table 1 Physical parameters of five kinds of macroporous resins

1.2 主要試劑

5-HMF標準品(純度為99%)，美國Sigma-Aldrich公司；色譜甲醇，美國Tedia公司。NaOH、KI，天津北聯精細化學品開發有限公司；I2，天津科密歐化學試劑有限公司；無水乙酸鈉、可溶性淀粉，天津市河東區紅巖試劑廠；CuSO4，天津瑞金特化學品有限公司；酒石酸鉀鈉、NaCl，天津天力化學試劑有限公司；蔗糖，天津東麗區天大化學試劑廠；濃HCl、冰乙酸、甲醇、乙醇，天津富宇精細化工有限公司；以上試劑均為分析純。

1.3 儀器與設備

SHA-B恒溫振蕩器，北京宏昌信科技有限公司；722G可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；BSA224S電子分析天平(精度0.1 mg)，北京賽多利斯科學儀器有限公司；Five Easy Plus pH酸度計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DDS-11A數顯電導率儀，上海佑科儀器有限公司；Ultimate-3000高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；HP1049A電化學檢測器、G1315A二極管陣列檢測器，美國安捷倫科技公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 大孔樹脂活化處理

大孔樹脂用無水乙醇浸泡24 h后，用去離子水反復淋洗至無醇味，之后依次用5倍體積HCl(pH 2)、NaOH(pH 12)溶液淋洗，2次淋洗前后均用去離子水淋洗至中性。

1.4.2 不同種類大孔樹脂對蜂蜜中5-HMF脫除效果比較

1 kg洋槐蜜加一定量5-HMF標準品(70 mg)，制成模擬加工貯藏后5-HMF含量超標的蜂蜜。蜂蜜樣品與蒸餾水按質量比1∶1均勻，常溫超聲振蕩10 min。稱取20 mL蜂蜜水溶液，分別加入0.3 g LSI-3、LSA-960、XDA-300、LX-260和LX-670型大孔樹脂，然后在25 ℃恒溫條件下水浴搖床振蕩150 min。吸附結束后按公式(1)計算5-HMF脫除率。

大孔樹脂對蜂蜜中5-HMF脫除率計算如公式(1)：

(1)

式中：A表示蜂蜜樣品5-HMF脫除率；C0、C1分別表示大孔樹脂處理前后蜂蜜樣品中5-HMF含量，mg/kg。

1.4.3 大孔樹脂吸附工藝對蜂蜜中5-HMF脫除的影響

1.4.3.1 吸附溫度對蜂蜜中5-HMF脫除的影響

稱取3份20 mL蜂蜜水溶液，每份加入0.3 g LSI-3型大孔樹脂，分別在25、35和45 ℃條件下，水浴搖床恒溫振蕩150 min。吸附結束后公式(1)計算5-HMF脫除率。

1.4.3.2 樹脂用量對蜂蜜中5-HMF脫除的影響

稱取8份20 mL蜂蜜水溶液，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g LSI-3型大孔樹脂，在25 ℃恒溫水浴搖床振蕩150 min。吸附結束后按公式(1)計算5-HMF脫除率。

1.4.3.3 吸附時間對蜂蜜中5-HMF脫除的影響

稱取7份20 mL蜂蜜水溶液，每份加入0.3 g LSI-3型大孔樹脂，25 ℃恒溫水浴搖床振蕩，分別在20、40、60、80、100、120、150 min取樣。吸附結束后按公式(1)計算5-HMF脫除率。

1.4.4 蜂蜜電導率、pH測定

將20 g蜂蜜樣品用重蒸蒸餾水溶解并定容到150 mL，測定電導率和pH。

1.4.5 蜂蜜淀粉酶值和還原糖含量測定

分別參照GB/T 18932.16—2003[16]和GB 5009.7—2016[17]中方法測定。

1.4.6 蜂蜜總酚含量測定

參照HINNEBURG等[18]方法測定。

1.4.7 蜂蜜中酚類化合物高效液相色譜分析

參照賀瓊等[19]方法提取蜂蜜中酚類化合物，然后采用高效液相色譜進行分析。具體色譜條件：ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相，甲醇(A)和0.1%(v/v)甲酸水溶液(B)；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測電壓900 mV；洗脫梯度：0～10 min，5% B；10～20 min，15% B；20～25 min，30% B；25～30 min，35% B；30～50 min，50% B；50～55 min，55% B；55～60 min，75% B。

1.4.8 大孔樹脂吸附對脫除不同種類蜂蜜中5-HMF的適用性

選取龍眼蜜、枸杞蜜、蕎麥蜜、荊條蜜、荔枝蜜、油菜蜜和2種百花蜜，按照1.4.3 LSI-3型大孔樹脂吸附的優化工藝條件，分析其對脫除不同種類蜂蜜中5-HMF的適用性。

1.4.9 蜂蜜中5-HMF含量分析

參照GB/T 18932.18—2003分析方法[20]。1 g試樣與1 mL色譜甲醇混勻，蒸餾水定容至10 mL，經0.45 μm濾膜過濾，采用高效液相色譜進行檢測。色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相A甲醇有機相，流動相B水相，10% A等梯度洗脫15 min；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長285 nm。

1.4.10 數據處理與分析

實驗重復3次，數據以平均值±標準偏差表示，使用Microsoft Office Excel軟件進行數據處理并繪制圖表；顯著性分析采用SPSS 19.0軟件進行，P<0.05表示存在差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同類型大孔樹脂對蜂蜜中5-HMF脫除能力比較

由圖1可知，5種大孔樹脂對蜂蜜中5-HMF脫除能力存在明顯差異，其中LSA-960、LSI-3和XDA-300型樹脂對脫除5-HMF具有較好效果，脫除率為45.35%～52.63%；LX-260型樹脂脫除效果較差，脫除率僅6.35%，LX-670型樹脂對5-HMF幾乎沒有脫除能力。大孔樹脂主要通過物理吸附作用，依靠吸附劑和吸附質之間范德華力來脫除溶液中的目標物質，其對目標物的吸附性能與樹脂極性、比表面積與孔徑均有關[21-22]。在選取的5種樹脂中，LSA-960、LSI-3和XDA-300屬于弱極性樹脂，LX-260和LX-670屬于強極性樹脂，由此可見，大孔樹脂極性對5-HMF吸附作用影響較大，弱極性樹脂適合脫除蜂蜜中的5-HMF。劉清清等[12]在蜂蜜中農殘脫除實驗中，則發現極性樹脂更適合脫除擬除蟲菊酯。另外，對于3種弱極性樹脂，LSI-3型樹脂對蜂蜜中5-HMF脫除效果最佳，脫除率達52.63%。而雷海燕研究蜂蜜中硝基咪唑類和喹諾酮類藥物大孔樹脂脫除技術時，發現LSI-3型樹脂對甲硝唑等農殘脫除效果遠不如另2種弱極性樹脂LSI-1和LSI-2[23]。這預示著，對于不同吸附質分子，其適合的大孔吸附樹脂類型差異較大。以脫除蜂蜜中5-HMF效果最佳的LSI-3型樹脂為對象，進一步分析吸附工藝條件對5-HMF脫除的影響。

圖1 不同類型大孔樹脂對蜂蜜中5-HMF脫除能力比較Fig.1 Effects of macroporous resin types on 5-HMFremoval from honey注：不同字母代表顯著差異P<0.05。下同。

2.2 大孔樹脂吸附工藝條件對蜂蜜中5-HMF脫除的影響

2.2.1 吸附溫度對蜂蜜中5-HMF脫除的影響

溫度會影響溶質分子運動活性，從而可能改變大孔樹脂對溶質的吸附效果。選取25、35和45 ℃ 3個溫度，研究吸附溫度對脫除蜂蜜中5-HMF的影響，結果如圖2所示。

圖2 吸附溫度對脫除蜂蜜中5-HMF的影響Fig.2 Effects of adsorption temperature on 5-HMFremoval from honey

結果表明，在不同吸附溫度下，LSI-3型樹脂對蜂蜜中5-HMF脫除效果有顯著差異(P<0.05)，25 ℃下大孔樹脂的脫除效果最佳，隨溫度升高，5-HMF脫除率逐漸降低。孟范平等[24]用聚苯乙烯型大孔吸附樹脂脫除海水中有機磷農藥，同樣發現溫度越高農藥脫除效果愈差。溶質分子運動活性隨溫度升高而增強，但可能由于LSI-3型樹脂對5-HMF的吸附作用為放熱反應，從而導致低溫有利于蜂蜜中5-HMF脫除[14,24]。

2.2.2 樹脂用量對蜂蜜中5-HMF脫除的影響

如圖3所示，隨著樹脂用量增加，脫除效果逐漸增大，當樹脂蜂蜜質量比達到44 g/kg后，樹脂用量對5-HMF脫除率改變程度影響較小，大孔樹脂對5-HMF吸附逐漸趨于平衡。考慮到經濟因素，選取樹脂蜂蜜質量比44 g/kg作為LSI-3型大孔樹脂脫除蜂蜜中5-HMF的最佳用量。

圖3 樹脂用量對脫除蜂蜜中5-HMF的影響Fig.3 Effects of macroporous resin amount on 5-HMFremoval from honey

2.2.3 吸附時間對蜂蜜中5-HMF脫除的影響

圖4顯示的是蜂蜜中5-HMF脫除率隨吸附時間的變化規律：0～80 min內，蜂蜜中5-HMF脫除率先快速增加后逐漸趨緩，80 min以后，大孔樹脂對5-HMF吸附達到平衡，5-HMF脫除率沒有顯著變化。因此選取80 min作為LSI-3型大孔樹脂脫除蜂蜜中5-HMF的最佳吸附時間。吸附初期，樹脂所有表面層均存在吸附力場，吸附能力最強，蜂蜜中5-HMF含量快速減少；隨吸附時間延長，樹脂表面活性面積逐漸減小，5-HMF分子與樹脂活性部位接觸機會越來越少，因此，蜂蜜中5-HMF脫除速率在20～80 min減慢，直到達到平衡階段(80～150 min)[11,13,21]。

圖4 吸附時間對脫除蜂蜜中5-HMF的影響Fig.4 Effects of adsorption time on 5-HMF removalfrom honey

綜合吸附溫度、樹脂用量以及吸附時間對蜂蜜中5-HMF脫除的影響，確立LSI-3型大孔樹脂脫除蜂蜜中5-HMF的優化工藝條件：吸附溫度25 ℃，樹脂用量44 g/kg蜂蜜，吸附時間80 min。在優化脫除工藝條件下，LSI-3型樹脂對蜂蜜中5-HMF脫除率達62.49%。

2.3 大孔樹脂吸附對蜂蜜理化指標及酚類化合物組成的影響

蜂蜜組成非常復雜，目前已從蜂蜜中發現150多種成分，其中總糖75%～80%、水分18%～22%、蛋白質0.02%～0.5%，此外，還含有維生素、有機酸、酚酸、黃酮、多種酶類、礦質元素、色素、芳香物質等多種物質[1-2]。為研究大孔吸附樹脂在脫除蜂蜜中有害物質5-HMF同時，是否會帶來其他成分的改變，選取電導率、淀粉酶值、pH、還原糖含量以及總酚含量5個指標進行評價。結果如表2所示，LSI-3型樹脂對蜂蜜的電導率、pH和還原糖總量沒有顯著影響(P≥0.05)，淀粉酶值略有降低，總酚含量下降明顯。這說明，樹脂處理后蜂蜜仍保留糖類及大部分營養功能成分，是甜味劑、飼料成分或生物質能源等的良好物質來源，可實現對不合格蜂蜜的資源再利用。

表2 LSI-3型大孔樹脂吸附對蜂蜜理化指標的影響Table 2 Effects of LSI-3 macroporous resin adsorption on honey routine physical and chemical indexes

注：同一列具有不同上標字母數據之間表示顯著差異(P<0.05)。

酚類化合物是蜂蜜中重要的生物活性物質，包括酚酸、黃酮及其衍生物等多種成分，具有較強的抗氧化能力，對心腦血管疾病、癌癥、炎癥、動脈粥樣硬化及衰老等有輔助療效[25-26]。圖5顯示的是樹脂處理前后蜂蜜中酚類化合物種類和含量在高效液相色譜圖譜上的變化，樹脂處理前后蜂蜜酚類組分的色譜圖相似，色譜峰出峰時間均集中在14～34 min，大部分色譜峰也無明顯變化，但部分色譜峰值出現明顯降低(如15～20 min)，該現象與總酚含量的下降相呼應(表2)。由此可知，LSI-3型大孔樹脂在進行蜂蜜中5-HMF脫除處理時，可保留大部分酚類化合物，但也會造成部分酚類成分一定程度的減少。在我們構建的樹脂與非樹脂處理蜂蜜中酚類成分指紋圖譜研究中也發現，樹脂處理會導致蜂蜜中某些酚類特征成分發生顯著差異，利用化學計量學可將兩者有效區分(待發表數據)。樹脂處理前后蜂蜜中酚類成分的明顯差異可為避免一些不法商家將再處理蜂蜜假作正常蜂蜜售賣提供理論依據。

圖5 LSI-3型大孔樹脂吸附對蜂蜜中酚類化合物的影響Fig.5 Effects of LSI-3 macroporous resin adsorptionon phenolic compounds in honey

2.4 大孔樹脂對脫除不同種類蜂蜜中5-HMF的適用性

為研究LSI-3型大孔樹脂對脫除不同種類蜂蜜中5-HMF適用性，隨機選取實驗室貯藏的8種蜂蜜進行驗證，結果如表3所示。

表3 LSI-3型大孔樹脂對不同種類蜂蜜中5-HMF脫除效果Table 3 Removal of 5-HMF from different kinds ofhoney by LSI-3 macroporous resin

注：“-”代表未檢測到。

LSI-3型大孔樹脂對8種蜂蜜中5-HMF均具有良好的脫除效果：對于5-HMF含量較高的荔枝蜜和百花蜜1，經LSI-3型樹脂處理后5-HMF脫除率分別為45.66%和60.43%；5-HMF含量稍高的枸杞蜜、油菜蜜和百花蜜2，樹脂處理后5-HMF脫除率則分別為44.31%、60.45%和35.03%；而5-HMF含量較低的龍眼蜜、蕎麥蜜和荊條蜜，樹脂處理后5-HMF含量太低未檢測到。這說明，LSI-3型大孔樹脂適用于脫除不同蜂蜜品種中5-HMF，但脫除效果在蜂蜜種類間存在一定區別，可能是由于不同種類蜂蜜的化學組成或5-HMF初始含量存在差異，從而影響了大孔樹脂與5-HMF分子間的相互作用。

3 結論

大孔樹脂極性對5-HMF吸附作用影響較大，弱極性樹脂更適合脫除蜂蜜中5-HMF，其中LSI-3型樹脂脫除效果最佳；降低溫度、增加樹脂用量以及延長吸附時間有利于提高LSI-3型樹脂對蜂蜜5-HMF脫除效果，在吸附溫度25 ℃，樹脂用量44 g/kg蜂蜜，吸附時間80 min的優化工藝條件下，5-HMF脫除率達62.49%；LSI-3型大孔樹脂吸附對蜂蜜電導率、pH和還原糖總量沒有顯著影響，淀粉酶值略有降低，酚類化合物成分則明顯減少，因此，大孔樹脂在有效去除蜂蜜中超標5-HMF同時，仍保留蜂蜜中糖類及大部分營養功能成分，是甜味劑、飼料成分或生物質能源等的良好來源。此外，LSI-3型大孔樹脂對不同種類蜂蜜中5-HMF脫除具有良好適用性。采用大孔樹脂吸附技術可實現對不合格蜂蜜的資源再利用，并且樹脂處理前后蜂蜜中酚類成分存在差異，也可避免一些不法商家將此種再處理蜂蜜假作正常蜂蜜售賣。