乳酸菌合成細菌素及對腸道菌群的影響

王剛，朱慧越，俞赟霞，趙建新，張灝，陳衛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

大量研究表明乳酸菌具有維持腸道微生態平衡、抑制腸道有害菌生長繁殖等益生功能。針對一些乳酸菌的代謝產物，如具有抑菌功能的食品級乳酸菌細菌素，目前已有大量的理論及應用研究。乳酸菌細菌素具有很高的應用價值，但由于其體內作用機制尚不清楚，出于安全性考慮，乳酸菌細菌素在生產實踐中仍面臨著諸多困難。此外，隨著人們對腸道菌群與人體健康研究的不斷深入，發現腸道菌群結構的變化與諸多人體疾病相關。因此，本被認為可安全食用的乳酸菌，其中能夠產細菌素的個體，是否會對腸道菌群造成潛在的不良影響，也逐漸被人們所重視。乳酸菌在腸道中發揮益生功效是否與其代謝合成細菌素有關、乳酸菌及其細菌素在食品領域的應用是否會影響到人體的腸道菌群并進而影響人體健康等問題也成為人們新的研究方向。

1 乳酸菌及其合成的細菌素

作為一類可發酵碳水化合物、主要產乳酸的細菌[1]，乳酸菌通常被認為是安全的微生物。目前在細菌分類學上，乳酸菌至少可分為23個屬，主要包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、雙歧桿菌屬、乳球菌屬等[2]。乳酸菌是一種兼性厭氧細菌，革蘭氏染色呈陽性，接觸酶陰性，無芽孢，存在球狀、球桿狀和棒桿狀3種形態，DNA堿基組成中G+C含量低于55 mol%。幾千年來，乳酸菌除了在發酵工業中提高食品的風味和營養，還可以抑制腐敗菌和致病菌，提高食品的衛生安全質量[3-4]。乳酸菌所產的抑菌物質包括雙乙酰、有機酸、過氧化氫和細菌素等[5]。雙歧桿菌、乳酸桿菌等乳酸菌被大量應用于食品行業，以發酵乳制品、益生菌粉等形式進入人體，在腸道內發揮著益生作用。

1.1 產細菌素的乳酸菌

1908年，報道了乳酸桿菌對非腸道微生物的抑制作用，自此乳酸菌代謝產物得到廣泛研究。一些乳酸菌種屬，可以通過定植于腸道，競爭腸道生態位、代謝產生乳酸與細菌素等，從而抑制病原菌入侵和定植[6]，調節腸道免疫功能[7]，改善腸道屏障功能[8]。至今發現的產抑菌活性物質的乳酸菌至少有8個屬，如乳桿菌屬Lactobacillussp.、鏈球菌屬Streptococcussp.、乳球菌屬Lactococcussp.、明串珠菌屬Leuconostocsp.、片球菌屬Pediococcussp.、雙歧桿菌屬Bifidobacteriumsp.、肉食桿菌屬Carnobacteriumsp.和腸球菌屬Enterococcussp.等[9]。細菌素是乳酸菌合成的一種十分重要的抑菌物質，也是乳酸菌發揮其益生作用的重要因素。據研究統計，在發酵食品(包括動物類的酸奶和植物類的泡菜等)、嬰兒糞便、動物腸道和變質食品中都可以分離出產細菌素的乳酸菌。此外，除了已知的細菌素外，益生菌清除致病菌的機理仍在不斷探究中。如芽孢桿菌益生菌可以合成脂肽類抗生素FENGYCIN[10]，通過競爭抑制干擾目標菌群體感應途徑，從而清除腸道內金黃色葡萄球菌。這也為乳酸菌的益生機制提供新的思路。

1.2 乳酸菌細菌素

一類細菌素會作用于目標菌細胞壁及被膜，阻礙細胞壁的合成，形成膜孔道，使胞內容物外泄導致菌死亡，如Lantibiotic NAI-107可以吸附在參與合成細胞壁多糖骨架的萜醇上，作用于細胞膜，損害其功能[11]，另一類作用于細胞內，影響基因表達和蛋白合成，如來源于kefir的Peptide F1可以進入Escherichiacoli細胞，黏在菌的DNA上阻止其合成[12]。乳酸菌細菌素種類繁多，采取高效可靠的鑒別方法，細菌素以不同的標準分類，有助于了解乳酸菌細菌素的特性，便于根據特性進行細菌素改造、利用，實現其在多個行業的開發應用。

1.2.1 乳酸菌細菌素分類

要理解細菌素的表征及其作用模式，關鍵是根據細菌素的生化特性對其進行鑒別分類。例如產生菌的種屬、抗菌肽大小、作用模式、抑菌能力、免疫機制和靶細胞上的作用受體、是否經過翻譯后修飾、細菌素特性甚至結構[13-15]。一般細菌素鑒別需經過分離、層析、HPLC純化和質譜分析等步驟[16]，繁瑣耗時。近年來PCR技術應用于細菌素分類鑒別方面已有許多研究，如利用已知的植物乳桿菌素基因設計引物PCR擴增目標菌DNA，根據發現的相關基因可以快速確定目標菌產的細菌素種類[17]。

對乳酸菌合成的細菌素進行分類最早是由KLAENHAMMER[18]提出的，隨著一些新發現的細菌素無法歸到原有的類別中，之后有很多學者在此基礎上做出新的分類：①classⅠ細菌素，包括所有在細菌素生物合成期間經過酶修飾的肽，由1個供酶識別、轉運和保持肽失活狀態的前導肽和與之融合的中心肽組成[19]，帶有不常見氨基酸，性質受結構影響，可細分為6小類，屬于這類的細菌素有Nisin、Enterocin AS-48、Subtilosin A、Streptolysin S和Glycocin F等；②classⅡ細菌素，抑菌活性和穩定性優于其他幾類[20]，可分為4小類，由于這類細菌素并未經過修飾，因此除了前導肽和運輸體，其成熟不需要酶作用；這類細菌素有片球菌素Pediocin PA-1、雙肽鏈細菌素Lactococcin G、環狀細菌素Enterocin L 50、非片球菌素單一線性肽Lactococcin 972等。近年KASUGA等[21]通過SDS-PAGE原位活性測定并確定Gassericin T和Gassericin S均為Ⅱb細菌素，并且發現兩者協同作用可以拓寬抑菌譜；③classⅢ細菌素，未經修飾，可分為Bacteriolysins和Non-lytic。具體的乳酸菌所產細菌素分類見表1。

表1 乳酸菌細菌素的分類Table 1 Classification of Bacteriocins from lactic acid bacteria

注：*為非乳酸菌細菌素。

1.2.2 乳酸菌細菌素的特點

乳酸菌細菌素的優勢主要有：①在體內外，乳酸菌細菌素均可抑制或殺死與其產生菌親緣較近的細菌；②毒性低，無污染、無副作用、無抗藥性；③分子穩定，有較好的耐熱性、耐酸堿性；④寬、窄抗菌譜的細菌素有各自適用的范圍；⑤細菌素生產方式多樣；⑥細菌素直接由基因編碼合成，通過操縱編碼基因可以進行“生物工程改造(bioengineering)”[33]，便于后期修飾；⑦細菌素有可能通過乳酸菌原位(in situ)產生[34]。當然，乳酸菌細菌素也存在一些缺陷，如：①有些細菌素的溶解度低甚至不溶解；②大多細菌素只能抑制革蘭氏陽性菌；③乳酸菌細菌素有可能引發耐細菌素細菌的出現，研究表明免疫模仿(immune mimicry)[35]和對細菌素的溶蛋白性裂解是限制細菌素在臨床上應用的一個重要原因。但隨著更多新的廣譜細菌素不斷被發現，乳酸菌細菌素的缺陷也正在被克服，如PEI等[36]報道的經篩選提純得到的Plantaricin SLG1, 這種植物乳桿菌素具有更寬的抑菌譜，可以抑制革蘭氏陽性、陰性菌和一些真菌。

1.2.3 乳酸菌細菌素的應用

乳酸菌細菌素由于其獨特優勢，在多個行業得到廣泛應用，尤其是養殖、食品和醫藥領域。在養殖領域，替代抗生素是乳酸菌細菌素的一個主要用途。由于抗生素在消滅致病菌的同時，也殺死了有益菌，使得有些菌群永遠無法完全恢復[37]。此外，抗生素耐藥性的產生也是一大威脅。將乳酸菌細菌素添加到飼料中可以延長飼料的保質期，防止飼料受到污染，而且可以抑制動物體內致病微生物的生產繁殖[38]。韓雪等[39]采用產細菌素乳酸菌發酵的棉籽粕飼喂蛋雞后,發現替代基礎日糧40%時,可顯著提高蛋雞的免疫能力和對營養素的利用率。李南充[40]在水中直接加入乳酸菌細菌素或產細菌素的乳酸菌，發現能改善水質，調整魚腸道菌群結構，提高飼料吸收率。應用可產細菌素、能定植于動物腸道的乳酸菌對開發無抗生素飼料、推動養殖業發展具有重要價值。在食品領域，隨著健康理念的深入，消費者偏向于無化學添加的食品，天然細菌素成了替代化學添加劑的最佳選擇之一，它可以賦予食品一個“先天免疫”形式[41]。50年前，Ⅰ類羊毛硫氨酸細菌素Nisin成為首個商業化運用的細菌素型食品防腐劑[42]，至今已有50多個國家將其用于乳制品及罐裝食品中。采用細菌素進行食品生物保藏[43]的方式有4種：①乳酸菌發酵食品；②純化、半純化的細菌素用作食品添加劑；③細菌素嵌入或涂層于包裝膜上[44]；④發酵食品做原料用于食品加工。人們還將細菌素以固定化形式用于食品工業中，既保證細菌素的梯度增強式釋放，又防止細菌素與食物成分及酶發生作用而失活[45]。VUKOMANOVI等[46]將Nisin結合到納米Au的表面后，發現通過納米包埋技術，Nisin抗菌效果顯著增強。在醫藥領域，由于細菌素的作用機制特殊，致病菌一般不會對其產生耐藥性，被認為是“策劃藥物”。研究表明許多細菌素對臨床疾病中的靶向致病菌有很強的特異性，其中就包括耐抗生素的菌株。DICKS等[47]發現細菌素Nisin F可以預防金黃色葡萄球菌感染長達7 d，因此可將乳酸菌細菌素用于感染性細菌的術后控制。GIACOMETTI等人[48]比較了單獨使用Nisin和Nisin與抗菌物質聯用時的抑菌效果，發現均對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有抑制作用，但聯用后的效果更強。最有趣的是探究細菌素作為潛在的抗癌劑，VILLARANTE等[49]報道了一種類似PediocinPA-1、分離自PediococcusacidilacticiK2a2-3的新Pediocin，具有針對HT29(人結腸腺癌和HeLa細胞系)的細胞毒活性。因此，通過優化已有的細菌素以及對新型細菌素的開發，解決現有細菌素的不足，將使細菌素得到更廣泛的應用。

2 乳酸菌細菌素與腸道菌群

人體腸道微生態是一個密集、復雜和動態的系統，腸道菌群是系統中最重要且活躍的組成之一，腸道菌群的結構組成反映了微生物及其宿主水平的自然選擇，促進了二者之間的相互合作并維持這個復雜系統的功能穩定性。腸道菌群的結構和代謝產物的改變與人體健康關系密切，造成腸道菌群結構及代謝產物變化的因素很多，包括飲食[50]、環境[51]、抗生素[52]以及益生菌的攝入等。

2.1 腸道菌群結構和代謝產物對相關疾病的影響

腸道菌群可以定植于腸道黏膜，構成天然保護屏障[53]，并且合成有益的代謝產物(如短鏈脂肪酸SCFAs[54]等)，產生抑菌物質，預防機體感染[55]。近年來，研究者發現腸道菌群的結構及其代謝產物能夠以不同方式作用于宿主的免疫、激素和神經等系統，從而影響人體的健康。對單種菌群和復雜腸道菌群的組成與功能的表征顯示了腸道微生物代謝對宿主的極大重要性。當腸道微生態的平衡被打破，造成的紊亂會引發許多疾病，如2型糖尿病[56]、肥胖癥[57]、炎癥性腸病[58]、精神類疾病、腫瘤、癌癥[59]和機體老化等[60]。例如，張婷等[61]通過收集167例炎癥性腸病患者、54例健康志愿者的新鮮糞便，對其中10種細菌進行分析，研究結果表明患者的腸道菌群結構發生明顯失衡：腸球菌等條件致病菌數量上升，破壞腸道黏膜屏障功能，同時乳酸桿菌等有益菌數量也有所增加，這種有益菌的增多在某種程度上反映了腸道自我保護的反饋調節。因此，探究乳酸菌及其代謝產物對于腸道菌群的影響，進而影響疾病的治療，具有極大的臨床價值。

2.2 乳酸菌細菌素對腸道菌群結構及其代謝產物的影響

目前有關乳酸菌細菌素影響腸道菌群的研究報道還較少，主要集中于細菌素對于動物腸道環境的影響。例如，腸炎沙門菌與家禽的諸多胃腸道疾病有關，王蕾等[62]通過實驗，從1月齡藏雞的小腸黏膜中分離出具有強抑制腸炎沙門菌的食竇魏斯氏菌，這種乳酸菌產的細菌素可用來治療感染腸炎沙門菌的家禽。副溶血性弧菌被認為是與食用海鮮有關的胃腸炎的主要原因，LV等[63]從鯽魚腸道分離得到產細菌素的植物乳桿菌FGC-12，掃描電鏡分析表明，魚源細菌素能破壞目標副溶血性弧菌的細胞壁，使得菌細胞電導率增大，影響細胞膜的完整性，使得胞內容物泄露，他們進一步把這種菌產生的細菌素添加到蝦中，證實了其對副溶血性弧菌有較強的抗菌活性。TOMITA等[64]通過巧妙的設計，獲得了一種攜帶有接合缺陷型pPD1的糞腸球菌，這種菌可表達細菌素，但不能接合轉移，能減少或消除耐萬古霉素的腸球菌在小鼠腸道上的定殖，降低因使用抗生素治療疾病導致腸道菌群紊亂進而引發的感染。CORR等[65]的實驗表明，通過自身合成的細菌素ABP-118介導，LactobacillussalivariusUCC118可以與病原菌直接拮抗，有效抵抗小鼠模型中出現的食源性Listeriamonocytogenes感染。

在研究乳酸菌細菌素對腸道內目標致病菌產生抑制效果的同時，也有研究學者關注了乳酸菌細菌素對整體腸道菌群結構的影響。DABOUR等[66]通過體內外實驗表明，PediococcusacidilacticiUL5在ICR小鼠體內可以合成片球菌素，Pediocin PA-1可有效抑制L.monocytogenes感染，阻礙病原體易位到肝和脾，且實驗證明，相較于其他抗菌藥物，Pediocin PA-1的潛在優勢在于對小鼠腸道菌群結構基本無影響?；蚋脑霤lostridiumdifficileCD4合成的細菌素，得到修飾的R型細菌素diffocin Av-CD291.1和Av-CD291.2可以在基本不影響小鼠原生腸道菌群結構的情況下，有針對性地預防艱難梭菌在宿主腸道定植，并將其殺滅[67]。BUERL等[68]研究結果表明，5種產Pediocin PA-1、Plantaricins EF等Ⅱ類細菌素的乳酸菌具有潛在的益生功能，如抑制腸道內問題細菌，短暫有利地改善宿主屬水平上的原生腸道菌群結構，基本不影響門水平上的結構。此外，也有研究顯示[69]，唾液乳桿菌是否產細菌素Abp118基本不影響小鼠與豬的門水平上腸道菌群結構。另有實驗證實[70]，小鼠攝入的乳酸菌是否產細菌素、產生的細菌素種類及細菌素抑菌譜的寬窄都可能影響小鼠腸道的菌群結構，但不會顯著影響其代謝產生的SCFAs含量。實驗篩選得到具有抑菌能力的PediococcusacidilacticiCCFM 28和LactobacillusgasseriJCM 11657，前者抑菌譜較寬，對小鼠腸道菌群中厚壁菌門和擬桿菌門的影響較小，后者抑菌譜較窄，會顯著降低厚壁菌門的比例，提高擬桿菌門的比例，而對代謝產物SCFAs均無顯著影響。

由此推測，乳酸菌可以通過細菌素作用，在基本不干擾宿主腸道結構及其穩態平衡的前提下，拮抗宿主體內某些致病菌，有效預防病原菌的感染，并促進了有益菌的生長，維持了動物腸道菌群與宿主之間的動態交流，但是以上報道均未深入探究體內細菌素對腸道菌群在分子機制層面的作用。乳酸菌細菌素種類多、數量大，抑菌分子機制十分復雜，目前對于這方面的研究還比較少。現有研究證實，部分細菌素作用于目標菌細胞膜，會在胞外釋放出K+、Na+等金屬陽離子，通過降低電勢[71]影響膜的形狀與生長。國內外研究者認為細菌素可以作用于參與合成細胞壁的物質、Lipid II、DNA和膜上甘露糖磷酸轉移酶系統(MPTs)的N末端胞外環等，然而SANDHU等[72]發現，雖然目標菌細胞膜上缺少Lipid II，但Nisin仍對其產生作用。DABA等[73]發現LactococcuslactisQU 7產的新型特異細菌素Lactococcin Z與已知的Lactococcin A有55.6%的同源性，但是可能由于兩者C末端區相似度較低，Lactococcin Z殺菌時沒有降低敏感細胞的膜電位，也不形成膜孔道，這表明細菌素抑菌還存在著諸多未知的機制。PIEWNGAM等[10]通過Agr缺陷菌株證實了Staphylococcusaureus腸道定植依賴于其Agr群體感應系統，而益生菌枯草芽孢桿菌產生的脂肽芬薺素Fengycin和自誘導肽AIP這一群體感應關鍵因子結構相似，能干擾Agr信號轉導，并且灌胃產Fengycin的枯草芽孢桿菌能完全消除Staphylococcusaureus在小鼠腸道的定植，這為乳酸菌類細菌素在腸道中是否也存在通過干擾目標菌的信號轉導從而影響其在腸道內的定植進而消除致病菌干擾的機制提供了新的思路。人體腸道環境復雜，不同的乳酸菌細菌素在體內能否特異性識別致病菌并將其殺滅、體外抑菌分子機制明確的細菌素在體內是否遵循相同的機制殺菌、是否會給人體健康帶來未知的影響還需進一步研究。

基于腸道菌群與人體健康的密切聯系、乳酸菌的益生功能和乳酸菌細菌素有效的抑菌性，研究乳酸菌細菌素對腸道微生態影響意義重大，了解細菌素對腸道菌群及代謝產物的影響能更好地確定益生菌株的有效性及安全性。然而在人體內，乳酸菌細菌素對腸道菌群的影響還非常少。人體共生菌群中的有益菌，有希望在上皮細胞的外表面產生細菌素，從而抑制細菌感染。據推測，乳酸菌細菌素對腸道菌群和宿主的作用可以分成2種，一種是細菌素先影響腸道菌群的結構，改變其種類及數量，再影響腸道菌群的代謝，最終影響宿主的正常功能，這類細菌素就是定植肽[74](colonizing peptides)和殺傷肽[75](killing peptides)。另一種是細菌素直接影響宿主的代謝，類似于細菌素作為一個信號分子起作用，即信號肽[76](signaling peptides)。如HEENEY等[77]認為，植物乳桿菌通過與細菌素Plantaricin EF相關的機制減少HFD誘導小鼠的體重增加，改善肥胖小鼠的腸道，并且有可能強化腸上皮細胞。此外，產細菌素的乳酸菌除了可以通過胞外分泌的信號肽實現菌種間或乳酸菌成員間的交流，也可以起到與人類自身產生的抗菌肽一樣的作用，作用于人體細胞，比如免疫細胞。例如TAVERNE等[78]發現LactobacillusplantarumWCFS1的產細菌素基因在一定程度上可對人樹突狀細胞進行免疫調節，從而影響宿主代謝，因此，乳酸菌細菌素可能具有一定調節宿主免疫系統的功能。

然而值得警惕的是，編碼細菌素的基因如存在于質粒上，則可能存在將細菌素基因傳遞給其他菌的情況。例如，可在種間和屬間找到類Pediocin PA-1的細菌素，而且在原位情況下質粒的轉移效率更高[79]，若是將這類菌運用于腸道中，由于細菌素能增強產生菌在腸道中的定植能力，則可能會造成該種細菌的大量繁殖，引發腸道菌群的紊亂，存在引發疾病的風險。

3 展望

細菌素由于表現出的優良性質使其很可能被用于臨床治療，但是目前這些研究多基于動物模型，人體實驗還比較少，需要進一步理解其作用機制、建立防止或減少耐細菌素細菌產生的有效措施。乳酸菌在人體內發揮益生功效離不開腸道菌群這個重要的場所，由于乳酸菌在生活中占據著越來越重要的消費地位，乳酸菌是否安全以及乳酸菌細菌素是否會對健康人體的原生腸道產生影響成為迫在眉睫的問題。由于部分乳酸菌抗菌肽的產生需要競爭誘導，而人體腸道菌群是一個十分復雜的系統，有些在體外試驗中不產細菌素或細菌素產量低的乳酸菌到了體內有可能產生大量的抗菌物質，因此乳酸菌的安全性還需要經過其對人體腸道菌群的影響進行評估。結合飛速發展的宏基因組技術，人們需要更深入地研究腸道中菌群與產細菌素乳酸菌的關系，對乳酸菌的應用提出更科學的依據。