基于GEO數據庫芯片探索miRNA參與肝纖維化的潛在機制

黃翀 鄭雅慧 張巨波

肝纖維化是病毒性肝炎、酒精性肝病等各種慢性肝損傷后肝臟的創傷愈合反應，其特征為肝臟中過量細胞外基質蓄積，破壞肝組織結構和功能，是慢性肝病發展至肝硬化的必經病理階段[1-6]。最新全球疾病負擔數據顯示，2017年超過132萬人死于各種慢性肝病及相關肝硬化，造成了嚴重的社會經濟負擔[7]。因此當前亟待闡明肝纖維化的發病機制，制訂有效的抗纖維化治療策略，改善患者預后。

資料與方法

一、數據來源

本研究芯片數據下載自GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)。GSE19865芯片采用GPL8824平臺(Agilent-019119 Mouse miRNA Microarray 1.0 G4472A)，包含3只橄欖油處理小鼠及5只四氯化碳處理小鼠。GSE66278芯片采用GPL17017平臺(TaqMan Rodent microRNA A array v 2.0),包含2只正常小鼠及6只四氯化碳處理小鼠。

二、芯片分析及差異miRNA篩選

miRNA芯片分析采用數據庫自帶軟件GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)。GSE19865芯片以橄欖油處理組為對照組，四氯化碳處理組為肝纖維化組進行分析。GSE66278以正常小鼠為對照組，四氯化碳處理組為肝纖維化組進行分析。選取P<0.05且差異倍數|logFC|≥0.585為條件篩選差異 miRNA。

三、miRNA靶基因預測

miRNA靶基因預測采用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)及microT-CDS(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=microT_CDS/index)兩款在線軟件進行分析，預測結果取交集得到miRNA靶基因。

四、靶基因功能分析

利用Cytoscape 軟件(version 3.5.1)的ClueGO插件對靶基因進行功能分析，包括Gene Ontology(GO) biological process, GO molecular function以及Reactome pathway分析，對P<0.05的富集結果通過Cytoscape進行可視化。

結 果

一、差異microRNA

通過GEO2R進行芯片分析，按P<0.05且差異倍數|logFC|≥0.585為條件篩，GSE19865芯片中miRNA上調37個，下調0個；GSE66278芯片中miRNA上調19個，下調18個，見表1。兩組芯片中表達均上調的miRNA為mmu-miR-802，見圖1A，其在不同芯片中的表達水平見圖1B。

二、miRNA靶基因

TargetScan預測得到mmu-miR-802潛在靶基因250個，microT-CDS預測分析顯示mmu-miR-802潛在靶基因為666個，通過對兩款軟件預測結果取交集得到mmu-miR-802靶基因138個，見圖2。

三、靶基因Pathway分析及GO分析

通過Cytosccape插件ClueGO對138個靶基因進行功能分析，結果顯示上述基因顯著富集于22條Reactome pathway，36種生物學過程及21種分子功能，見圖3。其中富集最顯著的前10位的信號通路為：Mitochondrial biogenesis, Signaling by TGF-beta receptor complex, PKMTs methylate histone lysines, Toll like receptor (TLR) 4 cascade, MyD88:MAL(TIRAP) cascade initiated on plasma membrane, MyD88-independent TLR4 cascade, TLR9 cascade, TLR10 cascade, TLR3 cascade, TLR5 cascade; 富集最顯著的前10位生物學過程包括Histone-lysine N-methyltransferase activity, Regulation of nucleobase-containing compound transport, Wnt signaling pathway, calcium modulating pathway, Activation of JUN kinase activity, Response to gamma radiation, Circadian regulation of gene expression, Cellular response to glucose starvation, Protein neddylation, Adipose tissue development, Cellular response to amino acid stimulus; 富集最顯著的前10位分子功能包括Protein self-association, Thyroid hormone receptor binding, Positive regulation of lipase activity, Positive regulation of JUN kinase activity, Activation of JUN kinase activity, Poly-Pyrimidine tract binding, Poly(U) RNA binding, Histone methyltransferase activity, Protein-lysine N-methyltransferase activity, Lysine N-methyltransferase activity。

四、靶基因PPI網絡分析

將138個靶基因上傳至NetworkAnalyst網站(http://www.networkanalyst.ca/)，選擇STRING數據庫進行蛋白相互作用分析，生成蛋白相互作用網絡圖，見圖4。如圖所示，根據蛋白相互作用的程度，鑒定出網絡中包含8個關鍵基因：YWHAE，PPP2CA， RHOA， FOS， PSMD2，CDK19，ATF2，PAFAH1B1。

圖1A 韋恩圖顯示基因芯片GSE19865及GSE66278中差異基因分布情況，右側為具體基因名稱，紅色標注的miR-802為兩組芯片中表達均上調的miRNA B miR-802在兩組芯片不同樣本中的表達水平

圖2 韋恩圖顯示同時被TargetScan及microT-CDS預測到的miR-802靶基因有138個

討 論

肝纖維化的發生是促纖維化因子刺激下各種信號通路相互作用的復雜過程，涉及眾多基因表達的調控，包括表觀遺傳學調控[8]。本研究通過GEO數據庫獲取肝纖維化miRNA芯片GSE19865及GSE66278，利用差異基因在線分析工具GEO2R獲取差異表達miRNA，通過取交集得到肝纖維化模型中表達上調的miRNA，即miR-802。通過綜合TargetScan及microT-CDS軟件預測結果，得到138個靶基因。通路分析顯示，這些靶基因主要參與線粒體生成，TGF-beta信號通路，組蛋白賴氨酸甲基化，Toll樣受體信號傳導等；生物學過程分析提示靶基因主要參與組蛋白賴氨酸甲基化，堿基轉運，Wnt及鈣調通路，JUN 激酶活化，基因表達的晝夜調控，葡萄糖饑餓的細胞應答， 蛋白類泛素化修飾，脂肪組織發育及細胞對氨基酸刺激的應答；此外分析提示靶基因的分子功能包括結合甲狀腺激素受體，正向調控脂肪酶活性，正向調控JUN 激酶活性，組蛋白甲基化等。

通過蛋白間相互作用分析，發現了8個位于調控網絡中心的關鍵蛋白： YWHAE、PPP2CA、 RHOA、FOS、PSMD2、CDK19、ATF2、PAFAH1B1。RHOA是Rho家族一員，屬于小分子GTP酶，是信號轉導的分子開關之一，在細胞增殖、遷移、黏附等過程中發揮重要作用。已有研究表明，RhoA能夠調控潛伏態TGF-β1分泌，并能影響Ⅰ型膠原表達[9,10]。研究發現，活性增強能夠促進肝星狀細胞活化，加重肝纖維化[11]。YWHAE是信號通路中重要的接頭蛋白，通過結合含有磷酸絲氨酸的蛋白介導信號轉導。既往研究發現，YWHAE能夠調控神經元形態發生[12]。此外，YWHAE能夠阻止小鼠受精卵由G2期進入M期[13]，YWHAE在肝纖維化中的作用有待進一步研究。PPP2CA是蛋白磷酸酶2 A的催化亞基，蛋白磷酸酶2 A是最主要的絲/蘇氨酸磷酸酶之一，參與細胞生長及分化的負向調控。前列腺癌時，PPP2CA能夠逆轉上皮間質轉化，進而抑制腫瘤細胞的生長及轉移[14]。PPP2CA能夠抑制甲狀腺癌細胞的遷移及侵襲[15]，PPP2CA在肝纖維化中的作用目前尚未見報道。FOS能夠與JUN家族蛋白二聚化形成轉錄因子復合體，從而調控細胞增殖、分化及轉化等過程，此外，某些情況下FOS表達與細胞凋亡相關。早期研究發現，c-FOS能夠促進增殖性疾病如肺癌、間皮瘤及肺纖維化等發展，而抑制蛋白激酶C能夠減少c-FOS表達，有望阻止疾病進展[16]。c-FOS表達見于丙型肝炎病毒感染患者，且其表達與肝纖維化分期及肝炎癥分級相關[17]。高糖可以誘導FOS表達，促進TGF-beta1產生，從而導致腹膜纖維化的發生[18]。在心肌成纖維細胞中，c-FOS能夠誘導細胞外基質蛋白過表達，引起心臟纖維化[19]，在肝纖維化中FOS是否發揮類似作用有待明確。PSMD2為26S蛋白酶體的非催化亞基之一，蛋白酶體主要參與蛋白質降解。既往研究發現，敲低PSMD2表達能夠減弱蛋白酶體活性，抑制肺癌細胞生長，誘導其凋亡[20]。PSMD2通過增強蛋白酶體對p21及p27的降解，促進腫瘤細胞增殖生長[21]。在輻射導致的皮膚纖維化大鼠模型中，通過蛋白組學分析發現，包括PSMD2在內的多個蛋白酶體亞基異常表達，提示靶向泛素-蛋白酶體系統或能有效治療皮膚纖維化[22]。目前，尚無報道闡明PSMD2在肝纖維化中的作用。CDK19屬于周期蛋白依賴性激酶之一，在多種細胞生物學過程中發揮重要作用，包括脂質代謝調控及發育生物學等[23]。CDK19能夠促進NF-κB介導的基因轉錄[24]。在多種腫瘤中，CDK19通過誘導上皮間質轉化促進腫瘤侵襲轉移[25]，然而CDK9介導的上皮間質轉化是否參與肝纖維化的發生目前仍不清楚。ATF2為作為轉錄因子能夠結合DNA，該過程依賴于ATF2形成同源二聚體或與c-Jun形成異源二聚體，激活CRE依賴的轉錄過程。實驗發現ATF2還具有組蛋白乙酰轉移酶活性，能夠特異性介導組蛋白H2及H4乙酰化[26]。早期研究發現，博來霉素能夠促進ATF2磷酸化，進而介導肺纖維化的發生[27]。在心臟纖維化中，去甲腎上腺素能夠增強TGF-beta1對ATF2的磷酸化作用，促進心臟纖維化進展[28]。ATF2是否影響肝纖維化有待進一步證實。PAFAH1B1是血小板活化因子乙酰水解酶的非催化亞基，又稱LIS1，該基因突變或缺失會導致無腦回綜合癥。研究發現，YWHAE及PAFAH1B1基因微缺失會導致獨特的腦白質病變[29]。此外，研究表明PAFAH1B1基因單倍體不足會擾亂齒狀回GABA神經元，破壞突觸的興奮/抑制平衡[30]。在肝臟內，PAFAH1B1缺失會誘發脂肪肝，并加速小鼠肝癌的發生[31]，但其在肝纖維化中的具體作用有待進一步探索。

A Reactome 通路分析 B GO生物學過程分析 C GO分子功能分析

圖3miR-802靶基因功能分析

圖4 基于STRING數據庫的蛋白質相互作用網絡分析

本研究從GEO數據庫獲取不同肝纖維化基因芯片，通過差異表達分析發現miR-802在纖維化組表達顯著上調。通過結合不同軟件進行靶基因預測，得到了138個潛在的miR-802靶基因。隨后，借助生物信息學軟件，對這些靶基因的功能進行了富集分析，發現多條信號通路及生物學過程參與了肝纖維化的發生發展。最后，通過蛋白互作網絡分析，發現了8個核心基因，其中RHOA能夠通過調控潛伏態TGF-beta1分泌及I型膠原表達參與肝纖維化。FOS，ATF2在肺纖維化及心臟纖維化發揮一定作用，PSMD2參與了皮膚纖維化的發生，PAFAH1B1能夠誘發脂肪肝的發生，這些基因在肝纖維化中的作用有待進一步闡明，而YWHAE，PPP2CA，CDK19目前尚無纖維化性疾病或肝臟疾病中的相關報道，但其在肝纖維化中的潛在作用值得關注和探索。