益腎散結復方及其拆方對阿霉素腎病大鼠腎臟組織的影響研究*

王漱非，王悅彤，李現成，張 楠，趙亞峰，沈 霞，毛加榮，延 佩，王 宇，于小勇，程小紅，屈 凱△

1．陜西省中醫醫院(西安 710003)；2．陜西中醫藥大學(咸陽 712046)

大鼠阿霉素腎病(Adriamycin-induced nephropathy，ADN)是通過阿霉素及其代謝產物誘發腎小球上皮細胞脂質過氧化，破壞腎小球濾過膜結構和功能，最終導致濾過屏障的通透性而引起蛋白尿的一種腎臟病[1]。研究發現，蛋白尿是慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD) 進展至終末期腎臟病(End stage renal disease，ESRD)的主要因素，隨著蛋白尿的不斷增多，最終導致不可逆性的腎小球硬化的發生。

現代醫學在防治尿蛋白方面取得了一定的效果，但因其副作用多、依賴性強、價格昂貴等因素，限制了其廣泛應用。大量的臨床證據證實祖國醫學對防治CKD具有確切療效，發現中藥在諸多方面對腎臟病理損害有明顯的保護作用，能通過多種途徑減輕腎組織病理改變，從而延緩腎臟病的進展。

益腎散結復方(又名“腎復康Ⅱ號膠囊”，專利號：ZL201110334097.6)，其由黃芪、山藥、山萸肉、菟絲子、仙靈脾、丹參、金櫻子、熟地等藥物組成，其功效為補脾益腎、活血散結，該藥物作為陜西省中醫醫院院內制劑臨床應用十余年，取得了確切療效[2-6]。本研究采用尾靜脈注射阿霉素建模方法建立阿霉素腎病模型，觀察益腎散結復方及其拆方組合對阿霉素腎病大鼠尿蛋白、血清學指標、腎臟組織形態學改變等的影響。現將其結果報告如下。

材料與方法

1 動 物 健康清潔級SD大鼠70只，雌雄各半，2～3月齡，體重(200±20)g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(陜)2012-003，動物質量合格證號：No.0012260。實驗動物按照組別采用分養法，在溫度20℃～25℃，濕度55%～65%實驗室內，均給予標準顆粒飼料喂養，自由飲水和自然晝夜節律光照。

2 藥物及其制備 按照中醫病機和組方原則為依據進行拆方，將益腎散結復方按照溫腎益精化瘀組(菟絲子、淫羊藿、丹參、金櫻子、姜黃)、滋陰益腎化瘀組(山茱萸、熟地黃、丹參、金櫻子、姜黃)、益氣化瘀組(黃芪、山藥、丹參、金櫻子、姜黃)的組方原則進行拆方實驗研究。按上述分類及用藥比例在陜西省中醫醫院制劑中心制備，低溫冰箱保存。陽性對照組藥物：鹽酸貝那普利片，國藥準字H20030514，北京諾華制藥有限公司。造模藥物：注射用鹽酸阿霉素(Doxorubicin，DOX)：上海金穗生物科技有限公司提供(批號C4125316-40-9)。HE、PASM、Masson染色試劑，10%甲醛、4%戊二醛、二甲苯、不同梯度乙醇、1%鋨酸、PBS緩沖液、環氧樹脂：陜西省中醫醫院病理實驗室提供。

3 儀器與試劑 飼養籠、代謝鼠籠、梅特勒電子天平(AL104)、大鼠固定器、清潔工作臺、一次性注射器(1 ml、5 ml、10 ml)、灌胃針頭、萊卡腎組織平推式切片機、石蠟包埋機、烤片機、奧林帕斯顯微鏡、日立H-600電子顯微鏡等。

4 造 模 阿霉素腎病大鼠模型的建立。實驗大鼠于實驗第1天、14天給予尾靜脈注射DOX6mg/只。造模成功后(24 h蛋白尿量≥100 mg/d)灌服相應藥物2 ml/只/d，持續8周。

5 分組及給藥 查隨機數字表，從70只大鼠抽取10只為正常對照組大鼠，其余大鼠造阿霉素腎病模型。依據上述指標判斷模型建立后，按體質量大小查隨機數字表將60只模型大鼠分為6組：溫腎益精化瘀組、滋陰益腎化瘀組、益氣化瘀組、全方組、陽性對照組及模型對照組。于造模成功后的第2天開始分別給予不同治療組對應藥物，連續灌胃8周(參考實驗動物學給藥劑量確定給藥量，根據大鼠與人體表面積及基礎代謝率計算所得[6]，大鼠每千克體重給藥量為成人每千克體重給藥量的6倍，用藥量為10 g/kg，即灌胃量10 ml/kg)。陽性對照組給予鹽酸依那普利[鹽酸貝那普利片的規格為10 mg/片，成人用量為20 mg/60 kg，換算后大鼠每天給藥量為2.05 mg/kg，灌胃量10 ml/(kg·d)]，模型組給予灌服生理鹽水2 ml/只/d，連續灌胃共8周。

6 樣本采集和指標檢測

6.1 24 h尿蛋白定量：尿蛋白濃度采用考馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue，CBB)法檢測。送陜西省中醫醫院臨床中心實驗室采用Olympus AU2700自動分析尿蛋白濃度，計算24 h尿液及24 h尿蛋白定量。

6.2 血生化指標檢測：通過相關指標試劑盒采用Beckman LX20生化分析儀自動分析血清中尿素氮(BUN)、血肌酐(CRE)、膽固醇(Cholesterol)、甘油三酯(Triglycerides)的濃度。

6.3 腎臟組織病理學變化的觀察：取部分腎臟組織，置4%戊二醛固定，PBS緩沖液漂洗，1%鋨酸固定，乙醇脫水后，浸透劑浸透,環氧樹脂包埋浸蠟切片，甲苯胺藍染色，超薄切片機切片5 μm，鏡下觀察腎臟組織結構變化。

結 果

1 益腎散結復方及拆方組合對大鼠尿量及尿蛋白定量的影響 與正常對照組比較，模型對照組尿蛋白定量明顯上升(P<0.01),提示阿霉素造模對大鼠腎臟造成了影響，導致尿蛋白排泄增加；用藥后，與模型對照組比較，各治療組大鼠尿蛋白定量均有所下降(P<0.05)。同時，據數據分析，提示益腎散結全方改善尿蛋白療效優于陽性對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠尿蛋白定量情況對比(mg/kg)

注：與模型組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.01；與陽性組比較，△P<0.05

2 益腎散結復方及拆方組合對大鼠血生化指標的影響

2.1 各組大鼠膽固醇情況分析：見表2。與模型組對照，治療組、陽性對照組均有效改善膽固醇水平(P<0.01)；同時，益腎散結全方組改善膽固醇水平優于陽性對照組(P<0.05)。

2.2 各組大鼠甘油三酯情況分析：見表3。與模型對照組，治療組、陽性對照組均能有效改善甘油三酯水平(P<0.01)；同時，溫腎益精化瘀組、益氣化瘀組、全方組改善甘油三酯水平優于陽性對照組(P<0.05)。

表2 各組大鼠膽固醇情況分析(mmol/L)

注：與模型組比較，*P<0.01；與陽性組比較，△P<0.05

表3 各組大鼠甘油三酯情況分析(mmol/L)

注：與模型組比較，*P<0.01；與陽性組比較，△P<0.05

2.3 各組大鼠血尿素氮情況分析：見表4。與模型組對照，各治療組、陽性對照組均有效降低血尿素氮水平(P<0.01)；同時，全方組改善血尿素氮水平優于陽性對照組(P<0.05)。

2.4 各組大鼠血肌酐情況分析：見表5。與模型組對照，各治療組、陽性對照組均有效降低血肌酐水平(P<0.01)；同時，溫腎益精化瘀組、滋陰益腎化瘀組、益氣化瘀組及全方組改善血肌酐水平優于陽性對照組(P<0.05)。

表4 各組大鼠血尿素氮情況分析(mmol/L)

注：與模型組比較，*P<0.01；與陽性組比較，△P<0.05

表5 各組大鼠血肌酐情況分析(μmol/L)

注：與模型組比較，*P<0.01；與陽性組比較，△P<0.05

3 電鏡下組織形態學結構觀察 見圖1。正常對照組，腎小球系膜細胞和基質輕度增生，基底膜無明顯增厚，足突節段性融合；模型組腎小球系膜細胞和基質輕-中度增生，足突廣泛融合；鹽酸貝那普利陽性對照組與溫腎益精化瘀組、滋陰益腎化瘀組、益氣化瘀組比較，系膜細胞核基質增生情況有改善，足突融合程度無明顯變化；與益腎散結復方全方組比較，全方組腎小球系膜細胞和基質輕度增生情況較鹽酸貝那普利陽性對照組改善明顯，且足細胞僅顯示部分融合，提示全方組修復能力最強。

A.正常對照組，B.阿霉素模型組，C.鹽酸貝那普利陽性對照組，D.溫腎益精化瘀組

討 論

陜西省中醫藥研究院腎病研究所程小紅主任醫師基于多年臨床經驗，認為各類腎小球疾病的中醫病理發展基礎是因腎虛日久導致瘀血阻腎絡，提出“益腎散結”的學術觀點，組成益腎散結復方。課題組基于“益腎散結”的學術觀點及前期研究結果，按照中醫病機和組方原則為依據進行拆方，將益腎散結復方按照溫腎益精化瘀組、滋陰益腎化瘀組、益氣化瘀組的組方原則進行拆方實驗研究，觀察全方組及拆方組對阿霉素腎病大鼠體質量、血脂水平、血糖水平、尿蛋白定量、腎功能及腎臟組織形態學改變的影響，進一步證實其保護腎臟的有效性[7-10]。全方中黃芪、山藥健脾益氣以滋養先天，山茱萸補益肝腎，收斂固脫，“壯元氣，秘精”，“功專助陽固陰”共為君藥，菟絲子補腎固精，金櫻子固精縮尿，共為臣藥以助君藥益腎之力；仙靈脾溫腎壯陽為佐藥，姜黃以活血化瘀散結，散體內凝滯之血，為使藥，諸藥相伍，以補脾益腎、活血散結之功，以此來抑制纖維化的發展保護腎功能[11-15]。

本研究選取經典的阿霉素腎病模型，采用尾靜脈注射方式，造模后的大鼠與正常組大鼠相比，四足均較青紫，且活動度明顯下降[16]，這些指征均類似于中醫“腎虛血瘀”證的表現。故從狀態觀察，初步判斷本模型比較符合益腎散結復方所治方證的中醫證候學特征。本實驗通過觀察益腎散結全方及拆方組合對阿霉素腎病模型大鼠血生化、尿蛋白定量、腎臟組織形態學改變等的影響，研究結果顯示，與正常對照組比較，阿霉素腎病造模大鼠生長速度緩慢，出現血脂代謝紊亂、尿蛋白及不同程度的腎功能下降。治療后，陽性對照組、益腎散結復方全方組及拆方組均不同程度改善脂代謝紊亂，有效降低蛋白尿，改善腎功能，修復腎臟組織。進一步顯示，全方組在控制蛋白尿、改善腎功能、修復腎臟損傷方面優于陽性對照組。此實驗結果，為進一步開展細胞實驗奠定基礎。