傷科黃水經口給藥的長期毒性研究*

蔣春飛，劉東文，鄭芳昊

廣東省佛山市中醫院(佛山 528000)

傷科黃水由黃連、黃柏等共六味中藥組成，是佛山市中醫院自發研制的院內制劑，主要用于治療跌打損傷、軟組織及骨骼損傷等[1-5]。根據臨床觀察，傷科黃水的藥物療效確切，安全性較高，具備新藥開發的價值。目前，按照中藥新藥申報的要求已經完成了臨床前制劑工藝、質量標準和藥效學的研究工作，但是有關該制劑的毒副作用卻并不明確[6-13]。考慮到傷科黃水為外用制劑，如果采用外敷的方式進行試驗，不容易充分暴露潛在的毒性。因此，本研究采用口服給藥的方式考察了傷科黃水重復給藥的毒副作用。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 試驗藥物：傷科黃水制劑(批號：17002，佛山市中醫院自制)，500 ml/瓶，醫療機構制劑注冊標準：粵ZB20111358。制備方法：按傷科黃水復方比例稱取黃連、黃柏、梔子藥材，加水煎煮1.5 h，過濾，收集濾液；藥渣加入白礬、紫草藥材，再煎煮45 min，加薄荷煮沸15 min，過濾，收集濾液；合并兩次濾液，濃縮至規定濃度，加入防腐劑，即得。給藥劑量參考小鼠急性毒性試驗的結果設計。經計算傷科黃水的LD50為51.66 g/kg，28.33 g/kg及以下劑量均未見動物死亡。結合LD50設置1/2的LD50，即25.83 g/kg為本次試驗的最高劑量，按體表面積折算為大鼠的等效劑量為18.33 g/kg，低、中劑量分別設置為高劑量的1/4、1/2。據此，試驗用藥配制方法為：將傷科黃水原藥液濃縮10倍，分別配置成含原藥材0.46 g/ml、0.92 g/ml、1.83 g/ml的藥液，供動物試驗用。

1.2 動物：SPF級SD大鼠32只，體質量180～300 g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。

1.3 試劑：0.9%氯化鈉注射液(批號：B17061502，湖南科倫制藥有限公司)；烏來糖(批號：20170105654，上海撫生實業有限公司)；尿質控液(批號：55170031，桂林優利特集團有限公司)；尿液試紙條(批號：56170949，桂林優利特集團有限公司)。

1.4 儀器：凈化工作臺(SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司)；尿液分析儀(Uritest-200B，桂林優利特集團有限公司)。

2 實驗方法 將SD大鼠按體重和性別隨機均衡分為4組，分別為空白對照組，傷科黃水4.58 g/kg劑量組、9.16 g/kg劑量組、18.33 g/kg劑量組，每組8只，雌雄各半。試驗各組均以10 ml/kg灌胃給藥，每天給藥1次，連續給藥14 d。試驗期間，每天觀察大鼠的外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、糞便性狀等，在給藥第1、4、7、11、14天測定大鼠體重。在剖檢前一天(給藥第14天)進行尿液、眼科檢查。剖檢當天處死全部大鼠，進行臟器檢查。

2.1 一般狀況觀察：給藥每天觀察動物外觀體征、行為活動、分泌物、呼吸、排泄物、中毒反應和死亡情況等。每天至少觀察1次，及時做好記錄，發現死亡或瀕死動物，及時解剖檢查并盡量采血檢查。每周測定兩次體重。

2.2 眼科檢查：采用左右眼相互對比方法，進行動物雙眼的外觀檢查。用棉簽輕觸眼旁皮膚觀察雙瞼閉合、眼球轉動等活動情況；用光束照射眼睛觀察瞳孔對光反應是否正常；觀察角膜的透明度是否清晰；觀察結膜的顏色、血管、分泌物有否異常；觀察虹膜的形狀與平整度是否正常。

2.3 尿液檢查：通過擠壓法采集大鼠尿液，應不少于0.5 ml。進行尿液外觀檢查后，用尿液分析儀進行檢測。樣本應該及時檢測，如未能在樣本采集后馬上檢測，應將樣本放在2℃～8℃環境，并在8 h內進行檢測。檢測時環境溫度應控制在15℃～30℃。

2.4 臟器檢查：剖檢當天用20%烏來糖以0.75 ml/100g進行皮下注射麻醉，在大鼠麻醉狀態達外科麻醉期后，采用腹主動脈采血處死。系統剖檢后，肉眼觀察各器官和組織的變化，測定臟器重量，并采用10%中性福爾馬林固定。臟體系數、臟腦系數按如下公式計算：

結 果

1 一般狀況觀察 給藥第6、7天，傷科黃水18.33 g/kg劑量組雄性動物分別有3例、2例動物于給藥前排軟便；給藥第11天，雄性動物有1例動物出現稀便，1例動物出現水樣便，其余各組無明顯變化。與空白對照組相比，傷科黃水18.33 g/kg劑量組給藥第14天雌性動物的體重(P<0.05)和14 d內的增重(P<0.01)均明顯下降，其余各組無明顯變化。具體實驗結果參見表1。

2 眼科檢查 各組動物眼科檢查均未見異常。

3 尿液檢查

3.1 雌性動物：傷科黃水9.16 g/kg劑量組、18.33 g/kg劑量組分別有2例、4例動物尿液外觀呈暗綠色。空白對照組有2例動物尿液隱血(+)，4例動物出現蛋白質(+)。傷科黃水4.58 g/kg劑量組有3例動物尿液出現蛋白質(+)。傷科黃水9.16 g/kg劑量組有2例動物尿液出現蛋白質(+)，1例動物蛋白質()，1例動物出現膽紅素(+)，1例動物出現尿膽原(+)，1例動物尿膽原(+)。傷科黃水18.33 g/kg劑量組有4例動物尿液出現蛋白質(+)，3例動物出現膽紅素(+)，4例動物出現尿膽原(+)，1例動物出現白細胞(+)。

3.2 雄性動物：傷科黃水4.58 g/kg劑量組、9.16 g/kg劑量組、18.33 g/kg劑量組分別有1例、1例、4例動物尿液外觀呈暗綠色。給藥各劑量組尿比重高于空白對照組(P<0.05或P<0.01)，尿液pH低于陰性對照組(P<0.01)。空白對照組有1例動物尿液出現蛋白質(+)，3例動物蛋白質(+)，4例動物出現酮體(+)。傷科黃水4.58 g/kg劑量組有1例動物尿液出現隱血(+)，1例動物隱血()，1例動物隱血()，1例動物尿液出現蛋白質(+)，2例動物蛋白質(+)，1例動物蛋白質()。傷科黃水9.16 g/kg劑量組有1例動物尿液出現蛋白質(+)，3例動物蛋白質()，1例動物出現酮體(+)，1例動物酮體(+)。傷科黃水18.33 g/kg劑量組有1例動物尿液出現隱血(+)，2例動物蛋白質(+)，2例動物蛋白質()，1例動物出現尿膽原(+)。

表1 傷科黃水連續給藥對SD大鼠體重的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，△P<0.01

表2 傷科黃水連續給藥對SD大鼠尿常規的影響(n=4)

注：與空白對照組比較，*P<0.05，△P<0.01

4 臟器檢查

4.1 雌性動物：受試各組動物未見明顯臟器損傷。傷科黃水18.33 g/kg劑量組胸腺臟器重量、臟體系數、臟腦系數低于空白對照組(P<0.05或P<0.01)，心臟臟器重量低于空白對照組(P<0.05)，其余各組無明顯差異。

4.2 雄性動物：受試各組動物未見明顯臟器損傷。傷科黃水9.16 g/kg劑量組睪丸臟腦系數低于空白對照組，其余各組未見統計學差異(P<0.05)。

表3 傷科黃水連續給藥對SD大鼠臟器重量的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，△P<0.01

表4 傷科黃水連續給藥14 d對SD大鼠臟體系數的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，△P<0.01

表5 傷科黃水連續給藥14 d對SD大鼠臟腦系數的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，△P<0.01

討 論

傷科黃水作為院內制劑在佛山市中醫院已有60多年的使用歷史，臨床療效確切，未發現明顯的毒副作用。該制劑于2015年獲得廣東省中醫藥局中醫藥強省專項資金-醫院中藥制劑開發項目的資助，計劃通過3年的組織實施，深度改良制劑處方和制備工藝，提高質量標準，明確藥理藥效，使之成為安全性高、臨床療效確切、質量穩定可控、使用方便的中藥制劑，并爭取培育成擁有自主知識產權的中藥新藥。本研究正是在處方固定、生產工藝穩定、質量可控的前提下，根據國家食品藥品監督管理局對中藥新藥注冊申報的要求，進行了長期毒性的初步研究。

有研究表明，黃連單味水煎液灌胃給小鼠后，會出現活動減少、呼吸急促、被毛粗亂的現象，部分小鼠甚至出現痙攣、死亡的情況，剖檢結果表明主要毒性靶器官為腦、肝、脾、肺、腎[4]。黃連、黃柏作為苦寒類中藥的代表，容易引起引起稀便甚至腹瀉[14-15]。本研究表明，傷科黃水經口給藥后，部分大鼠雖出現了軟便或稀便現象，與黃連、黃柏誘導的胃腸道刺激反應一致，但是對主要功能器官并未產生毒性作用。而傷科黃水作為外用制劑，通常透皮吸收后進入胃腸道的可能較小，不會引起胃腸道反應。另外，不同劑量的傷科黃水對大鼠尿液產生了一定影響，但經研究發現主要與藥物濃度有關，并未產生病理性代謝產物。因此，可以認為傷科黃水未有明顯的毒副作用。

本研究觀察了連續灌胃給予傷科黃水后大鼠產生的毒性反應及其嚴重程度，主要的毒性靶器官或靶組織及其損害的可逆性，為臨床主要監測指標提供一定參考。