酒精性股骨頭壞死動物模型的研究進展

謝程欣,王 維,余城墻,安 楊,金 鑫,尹 東*

(1.廣西中醫藥大學研究生院,南寧 530200； 2.廣西壯族自治區人民醫院骨科,南寧 530021)

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是一種骨科常見的進行性疾病,最終會導致股骨頭塌陷。 該病發病率及致殘率較高,給患者家屬和整個社會帶來了不可估量的勞動力和經濟損失。 據估計,全球ONFH 患者總數高達2000 多萬例[1]。 在中國,非創傷性ONFH 數量約為500 萬～750 萬例,并且每年新增病例10 ～20 萬例[1-2]。 保守治療時,大多數受影響的髖關節(＞80%)在最初診斷的4 年內進展為股骨頭塌陷和關節炎,最終將接受全髖關節置換術[3]。

長期過量飲酒被認為是非創傷性ONFH 的主要危險因素之一。 據報道,日本非創傷性ONFH 的病因構成酒精性占31%[4]；中國和韓國所有ONFH的病因構成中酒精性分別占 30.68%[1]和32.4%[5]；并且,在中國男性患者中,酒精性是最常見的病因(40.4%)[1]。 隨著酒精消費的不斷增加,尋找預防和治療酒精性股骨頭壞死(alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head, AIONFH)的有效方法至關重要。 然而,AIONFH 的具體發病機制尚未完全闡明,缺乏理想的動物模型阻礙了成功預防和治療的進展。 因此,建立一個可靠地模擬人類疾病各個階段的AIONFH 動物模型是非常必要的。 本文基于動物實驗,對AIONFH 的發病機制、動物模型構建和防治措施的最新進展進行綜述。

1 發病機制

AIONFH 的發病機制很多,但還沒有共識的確切機制。 骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨/成脂分化受損被認為是導致AIONFH 的主要因素。 脂肪細胞的異常增殖和骨細胞內脂肪的積聚可導致股骨頭的骨內壓力升高和血液循環障礙,最終導致股骨頭壞死[6]。 過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferatoractivated receptor gamma, PPARγ)是一種在脂肪形成中起重要作用的轉錄因子。 研究表明,酒精可以上調BMSCs 中PPARγ 基因的表達,促進BMSCs 的成脂分化并抑制其增殖及成骨分化[6-7]。 Wnt/βcatenin 信號通路是引導BMSCs 向成骨細胞分化的重要因素。 據報道,Wnt/β-catenin 信號下調和糖原合成酶激酶-3-β(glycogen synthase kinase-3-β,GSK3β)去磷酸化與酒精對大鼠骨重建的抑制有關[8]。 Chen 等[9-11]的研究表明乙醇通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路和蛋白激酶B(Akt)/GSK3β/βcatenin 通路抑制BMSCs 成骨分化。 此外,哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路的激活也可導致BMSCs 成骨分化受損[12-13]。 Liu 等[12]報道,大量慢性飲酒激活磷脂酰肌醇- 3 - 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt/mTOR 通路上調PPARγ 并下調成骨相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)的表達,導致小鼠骨量減少。 Jie 等[14]發現酒精增強BMSCs 中脂肪特異基因-422 的表達。 相反,Cui 等[15]發現乙醇處理的小鼠克隆BMSCs 中,脂肪特異基因-422 和PPARγ 的表達均無顯著增加。

AIONFH 模型的建立與血管環境有關。 據報道,酒精處理后的動物血清脂質過氧化物升高,超氧化物歧化酶活性降低,導致小動脈變性和硬化,最終誘發股骨頭缺血壞死[16]。 細胞膜微粒通過介導血管炎癥、促進凝血及血管內皮損傷、抑制血管舒縮等途徑,誘發股骨頭微血管損傷[17]。 楊云等[17]在長期白酒灌胃的Wistar 大鼠中觀察到細胞膜微粒CD31、CD54 的含量明顯升高。

乙醇及其代謝物的直接毒性作用會導致脂肪肝和其他酒精性肝損傷,有助于ONFH 的發生。 多數研究在動物中觀察到高膽固醇血癥和肝脂肪變性[7,16,18-19]。 Okazaki 等[20-21]的研究發現,激素誘導和酒精誘導的ONFH 大鼠均存在肝損傷的表現。這些變化導致血液循環中脂肪類物質增多, 易聚集成脂肪球,導致股骨頭軟骨下區栓塞。 另外,高脂血癥還會增加血液中的游離脂肪酸,導致前列腺素增加,從而破壞小血管壁,產生血管炎。 此外,Okazaki 等[21]報道,皮質類固醇可通過Toll 樣受體4信號通路干擾全身免疫反應誘導ONFH。 然而,他們沒有發現Toll 樣受體4 與大鼠AIONFH 的發生之間存在任何關系[20]。 總之,AIONFH 是多種因素共同作用的結果,其潛在的發病機制尚待挖掘。

2 動物模型

目前用于AIONFH 造模的實驗動物有大鼠、小鼠、兔、羊、犬、鴯鹋等,造模方法主要包括三種:①含酒精飲食；②酒精灌胃；③股骨頭局部注射乙醇。

2.1 大鼠

大鼠是一種傳統的實驗動物,具有與人類相似的生理和代謝特性。 其股骨頭大小適中,便于影像學和病理學研究,是目前最常用的AIONFH 動物模型。 早在1984 年,Solomon 等[22]就在隨意飲酒40周的大鼠中觀察到骨質疏松和ONFH。 由于大鼠無嘔吐反射,國內學者通常采用酒精灌胃的方式,更準確地控制酒精攝入量。 最近,Yang 等[13]的研究對大鼠進行6 周的酒精喂養,起初濃度為5%并每周增加5%,最后一周穩定在30%。 這種逐步增加酒精喂養濃度的方式比灌胃法更簡便、也更符合人AIONFH 發病的飲酒過程。 Lieber 飲食[23]是建立AIONFH 大鼠模型最常用的方法[8-11,13,20],其優勢在于它可以高效地吸收乙醇。 Okazaki 等[20]飼喂雄性Wistar 大鼠含5%乙醇的Lieber-DeCarli 液體飼料長達24 周,結果顯示4 周時 6/12 的大鼠發生AIONFH。 隨后,其同事Shimizu 等[24]采用相同的飼喂方案,4 周后雄性大鼠有7/20 發生AIONFH,然而不會引起雌性大鼠AIONFH。 該方案[20,24]建模的大鼠最快可在7 天內開始發病,但24 周時未出現股骨頭塌陷。 楊云等[25]對Wistar 大鼠進行白酒10 mL/(kg·d)灌胃6 個月,并采取高籠喂養加強負重對雙后肢的影響,使其更接近人類生物力學作用。 結果顯示,AIONFH 造模成功率高達89.48%,大鼠死亡率為10%,但仍未觀察到股骨頭結構塌陷。 可見,無論是低濃度酒精飼喂還是高濃度灌胃造模,都只能模擬AIONFH 的早期階段。 Okazaki 等[26]的另一項研究表明,負重對類固醇誘導ONFH 的發生沒有影響。 大鼠ONFH 的早期發展和塌陷形成是獨立的,與人類髖關節的生理應力差異是導致股骨頭結局不同的因素之一。

2.2 小鼠

小鼠容易飼養且繁殖迅速,擁有與人類相似的骨骼系統。 然而,小鼠股骨頭較小,限制了其模型的實用性[27]。 Wang 等[7]對昆明小鼠進行長期灌胃乙醇濃度為46%的白酒,6 個月后觀察到小鼠股骨頭軟骨下區骨髓壞死,脂肪細胞肥大增生,骨小梁稀疏,造血功能減弱,空骨細胞陷窩數較對照組明顯增加(P＜0.05)。 Liu 等[12]給予雌性C3H/HeJ 小鼠飲用不同濃度(5%～30%)的乙醇,連續4 周誘導骨量減少。 盡管在小鼠體內誘導AIONFH 是可行的,但仍需進一步的研究對比,尋找一種小鼠耐受性好,造模成功率高,經濟性更強的造模方案。

2.3 兔

兔子易獲取,飼養成本低,易于繁殖,是激素性ONFH 最常用的動物模型[27], 也被廣泛用于AIONFH 的造模研究。 1991 年Shih 等[18]用米酒2 g/(kg·d)喂養新西蘭白兔長達1 年,發現血清膽固醇水平,髓內壓和股骨頭脂肪細胞體積均高于對照組。 兔子AIONFH 造模最常采用酒精灌胃法,王義生[16,19]等給予家兔灌胃濃度為45%烈性酒1 ～6 個月,觀察到股骨頭髓內脂肪細胞增生肥大,骨小梁變細稀疏,面積分數降低,空骨陷窩百分比在2 個月后開始增加(P＜0.05),并隨時間延長增加更明顯。莫堅[28]等報道,采用灌胃法造模的動物因不進食、腹瀉、腹脹等原因,死亡率較高(8/20)。 此外,Liu等[29]采用股骨頭注射無水乙醇的方法,建立日本大耳白兔AIONFH 模型。 但是,仍缺乏客觀數據支持這種方案在兔子模型中運用的可行性。

2.4 羊

綿羊是一種出色的ONFH 動物模型,其股骨頭大小、髖關節和血管解剖結構與人類相似,適用于對人體手術的評估。 國內外學者最常采用局部注射乙醇的方法誘導綿羊AIONFH,2001 年Simank[30]及其同事Manggold 等[31]在X 射線透視下注射8 mL無水乙醇(1 mL/min)于單側股骨頭中央上部,組織病理學及影像學均可見股骨頭壞死表現。 然而,股骨頭宏觀結構、循環和關節軟骨完整,均未出現股骨頭結構塌陷。 一方面,解剖結構完整的股骨頭存在正常的骨修復作用。 另一方面,乙醇的毒性作用僅限于高濃度的區域,并且持續時間短暫。 因此,該模型只能模擬人類AIONFH 的早期病理變化。 隨后,Yilmaz 等[32],Feitosa 等[33]及Zhu 等[34]同樣采用局部注射法誘導AIONFH。 在Zhu 等[34]的研究中,影像學檢查發現12 周時股骨頭外形略有改變,25 周時股骨頭局部塌陷伴關節間隙狹窄,組織學表現為髓腔內大量紅細胞及骨小梁壞死,空骨陷窩率(最高＞60%)明顯高于Simank 等[30-31]的結果。 主要原因可能在于Zhu 等[34]進行了雙側股骨頭造模,從而增強了負重的效果。 此外,乙醇注射量及動物存在品種、體重和性別等差異,也會影響研究結果。毫無疑問,負重是導致股骨頭壞死及結構塌陷過程中不可忽視的因素。

2.5 犬

與綿羊相比,犬科動物容易飼養,而且在夏天不容易生病。 乙醇注射和冷凍損傷是誘發大型哺乳動物ONFH 最常用的方法,但冷凍損傷所致病理變化不同于人類ONFH 的發展[35]。 Wang 等[35-36]利用3D 打印技術設計了一種新的導航模板,以防止在注射過程中乙醇泄漏,研究發現注射3 周后,犬股骨頭出現壞死,空骨陷窩增多,造血細胞減少等表現,并在6 周和9 周時加重。 盡管影像學及組織學變化表現與人類ONFH 相似,但未觀察到股骨頭塌陷。 鑒于犬髖關節的力學環境與人體不同,李鴻帥等[37]建立了三足負重AIONFH 模型:用克氏針固定Beagle 犬的一側前肢,將酒精直接注射至股骨頭內,影像學及組織學上均表現逐步進展的關節面塌陷。 持續的生理應力阻礙骨修復反應,進一步降低骨小梁的力學強度,是導致股骨頭塌陷的重要因素[37]。

2.6 鴯鹋

鴯鹋是一種來自澳洲的大型鳥類,善跑但不會飛(類似鴕鳥),具有一定危險性。 由于鴯鹋的體型、重量和生物力學特性與人類相似,與此相關的ONFH 造模研究已逐漸開展[38-39]。 2014 年范猛等[40]采用股骨頭內局部注射乙醇的方法建立AIONFH 模型,部分動物股骨頭軟骨下骨折及局部骨吸收,但均未發現股骨頭塌陷[40]。 同樣,王琰[41]的研究中股骨頭內表現為不同程度的骨壞死,但也沒有觀察到股骨頭塌陷。 在隨后的研究中,范猛等[42]通過對比兩種造模方法對股骨頭骨顯微結構的影響差異,發現冷熱交替法建立的ONFH 模型具有較高的塌陷率。 冷熱交替法建立的模型在組織學上表現為破壞性修復,而乙醇注射法建立的模型則表現為重建性修復[40,42]。 可見,修復方式對于壞死股骨頭最終是否塌陷具有關鍵性的影響。 此外,小型雙足動物也被用于AIONFH 的研究。 據報道,在馬血清致敏條件下,采用灌胃法建立的雞AIONFH 模型具有造模周期短、成功率高(87.5%)等特點[43]。

2.7 造模方案的比較

根據當前研究所示,小型哺乳動物造模最常采用酒精飲食法和灌胃法,大型動物造模常采用局部注射法。 相比之下,酒精飲食法具有操作簡便、死亡率低等優點,也更真實地模擬了人飲酒致病的過程。 灌胃法通常需要每天給予高濃度乙醇(＞45%)的烈酒[7,16,19,25,28],雖然造模成功率較高,但動物死亡的風險也更大。 局部注射法造模時間短,成功率高,但與臨床AINOFH 的病因差別較大。 股骨頸骨折和乙醇滲漏是注射法的主要并發癥[30-31,35],乙醇的泄漏會降低劑量的準確性,還可能損害周圍的軟組織[35]。 通過提高術者的技巧及熟練度,以及運用導航模板等新技術,將會使造模成功率進一步提升。

目前,僅Zhu 等[34]及李鴻帥等[37]的研究顯示壞死股骨頭出現塌陷的進展。 然而,無論是四足哺乳動物還是大型雙足動物,均無法進展到股骨頭塌陷的末期。 實驗側患肢會保護性限制負重,使患肢未能產生正常的生理應力,故較難模擬股骨頭壞死末期的塌陷過程[44]。 高籠喂養[25,45]及三足模型[37]的建立為今后的造模方案提供了新思路。 然而,僅在進食時突出生物力學作用,與人類在日常生活中行走及跑跳等運動時所承受的生理應力相去甚遠。此外,動物通常被關在籠內或狹窄空間里,其活動量受限,導致股骨頭承受生理應力的強度和時間不夠充分。 雙足動物的雙下肢負重特性更接近人類,但均為非哺乳動物。 相比之下,四足哺乳動物與人類親緣性更強,但其造模方案還需進一步改進,創造雙足負重模型是今后研究的方向。

3 防治措施

股骨頭壞死作為一種頑固性疾病,通常會導致髖關節的破壞,患者最終需要接受全髖關節置換術。 因此,尋找一種非手術治療方法來推遲或減少全髖關節置換術的需要,以促進股骨頭壞死在塌陷前的修復,具有重要的意義。

乙醇對BMSCs 的增殖及成骨分化具有明顯的抑制作用,恢復降低的成骨活性可以延緩ONFH 的進展。 據報道,mir-548 D-5p 通過直接靶向和下調PPARγ,抑制地塞米松誘導的BMSCs 成脂分化[46]。同樣,袁相偉[47]的研究表明mir-548 D-5p 也可以有效阻斷酒精誘導PPARγ mRNA 的表達。 宋石[48]發現mir-27a 不僅靶向下調PPARγ 基因的表達,還能通過上調Runx2 基因表達促進BMSCs 成骨分化。據報道,新型Akt 激活劑SC-79 通過激活Akt/GSK3β/β-catenin 信號通路,拮抗乙醇對Akt-Ser473磷酸化的抑制作用,預防AIONFH 的發展[9]。 哌啶菊酯-α 能夠抑制p53 激活和GSK3β 去磷酸化,拮抗乙醇對BMSCs 的作用[11]。 Wnt 通路是骨治療領域中的一個新靶點。 Chen 等[8]證實抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸能夠阻斷乙醇對Wnt 信號分子βcatenin 蛋白表達的抑制作用及GSK3β 去磷酸化,抑制脂肪生成。 因此,N-乙酰半胱氨酸和其他膳食抗氧化劑可能有助于防止AIONFH 的進展。

近年來,研究發現中草藥防治AIONFH 具有獨特作用。 Chen 等[10]發現蟲草素能重新激活Wnt/βcatenin 通路,降低乙醇對BMSCs 的抑制作用。 麝香不僅具有促進BMSCs 成骨分化和血管生成、舒張的能力,還能抑制白細胞介素1β 和腫瘤壞死因子α的表達,通過抑制炎癥過程阻止AIONFH 的進展[49]。 祛痰逐瘀方通過特異性上調mir-628/Pten/Runx2 的表達,促進壞死骨的修復[50]。 葛根素能夠防止脂肪肝、高脂血癥、毛細血管壁損傷和高凝狀態的發生,還能減少酒精誘導的PPARγ mRNA 的表達,從而減少骨髓的脂肪化并維持細胞的成骨分化[7]。

細胞自噬對成骨細胞具有保護作用,提高細胞自噬水平成為防治AIONFH 的重要靶點。 細胞自噬的調控主要涉及經典的PI3K/Akt/mTOR 信號通路,陶振宇等[51]發現雷帕霉素通過抑制mTOR 增強了細胞自噬水平,實驗組股骨頭大體形態良好,軟骨下壞死帶明顯少于對照組。 Liu 等[12]和Yang等[13]的研究也表明,雷帕霉素和甜菜堿通過阻斷mTOR 通路預防AIONFH 的發生。

股骨頭壞死的臨床本質是微循環損傷,重建壞死區的血管是骨修復的出發點。 血管內皮生長因子是誘導血管生成、促進壞死骨修復的重要因子[29]。 Liu 等[29]的研究證實血管內皮生長因子腺病毒轉導可促進股骨頭壞死區的血運重建和骨形成,減少骨吸收,避免壞死股骨頭的機械功能降低。

4 結語

股骨頭壞死的發病率和致殘率較高,隨著酒精消費增加,防治AIONFH 的重要性日益突出。 從分子層面上揭示AIONFH 的發病機制,并尋找新的治療靶點是目前ONFH 的研究熱點。 為了提高AIONFH 動物模型與人類的相關性,進一步了解疾病的發病機制,并使新的治療方法能夠得到評估。建立能夠模擬人類AIONFH 各個階段病理改變的動物模型,仍然是未來研究的方向。