ORMDL3調控內質網應激在疾病中的研究進展①

李 佳 李 莉

(上海交通大學附屬第一人民醫院檢驗醫學中心,上海 200080)

2007年Moffatt團隊在Nature雜志上首次發表了哮喘的全基因組關聯研究(genome-wide association study,GWAS)結果，發現ORMDL3基因所在的17q21染色體區與哮喘高度相關，這是ORMDL3作為哮喘相關基因的首次報道，引起世界各國哮喘研究者高度關注[1]。后續十多年研究發現，除哮喘外，ORMDL3及其所在的17q21染色體區與炎癥性腸病、腎臟疾病及動脈粥樣硬化等炎癥相關疾病密切相關[2-5]。功能學研究發現ORMDL3主要調控內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、胞內Ca2+平衡、激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)參與自噬、凋亡等過程[5-7]。但目前功能研究的結論并不一致。雖然GWAS研究為發現疾病致病基因提供了良好的平臺，但隨后的功能研究對于闡明基因參與疾病的生物學機制更為重要。因此，本文對ORMDL3調控ERS參與疾病的相關研究進展進行綜述。

1 ORMDL3概述

ORMDL3基因屬于進化保守的ORM基因家族，包括小鼠和人的3個高度同源基因ORMDL 1/2/3，ORMDL3定位于17q21染色體區，與哮喘高度相關，而ORMDL1和ORMDL2分別定位于2q32和12q13.2，未見其與哮喘相關的報道。配對比較人和小鼠ORMDL 1/2/3發現，蛋白結構和氨基酸同源性分別達95%和80%[8]。

ORMDL3編碼1個含有153個氨基酸的4次跨膜內質網蛋白，在成人肺和肝臟、腎臟和胰腺等器官中表達，但在骨骼肌、心臟及大腦中未檢測到ORMDL3 mRNA表達[8]。ORMDL3目前在過敏性哮喘中研究最多，在參與炎癥反應的細胞中表達尤其高，在小鼠和人氣道上皮細胞和巨噬細胞中高表達，在T細胞和嗜酸性粒細胞中高表達，而中性粒細胞表達ORMDL2而非ORMDL3[9-11]。

目前ORMDL3蛋白的功能尚不明確。近年研究表明，人ORMDL3轉基因小鼠表現出的自發性氣道重塑、纖維化、黏液合成、炎癥和氣道高反應性證實ORMDL3為致病因素[12]。目前ORMDL3在疾病中的功能及機制研究尚處于起步階段，綜合國內外研究進展，ORMDL3通過抑制肌漿/內質網Ca2+ATP酶(sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCAs)活性參與內質網介導的Ca2+平衡，并激活ERS[2,5,6,13,14]。此通路是ORMDL3參與疾病發生發展的關鍵，但其在各種疾病中的作用的研究結果并不一致。

2 ORMDL3調控ERS

2.1內質網及SERCAs 內質網膜系統是細胞加工蛋白質、脂質及貯存Ca2+的主要場所。對于大多數分泌和跨膜蛋白來說,新翻譯的未經折疊的蛋白經過富有Ca2+與折疊酶環境的內質網進行初步加工，形成穩定的三級結構是分泌途徑的第一步。

內質網作為受調控的Ca2+存儲庫，對于細胞內Ca2+信號的產生至關重要。內質網上存在Ca2+釋放通道(如肌醇三磷酸受體和蘭尼堿受體)控制Ca2+從內質網進入細胞質，同時也存在鈣泵(如SERCAs)使Ca2+返回內質網。因此，SERCAs活性決定了細胞內Ca2+的動向，影響Ca2+信號形成，有助于維持較低的胞內Ca2+水平。SERCAs還可通過調節用于下一個刺激應答可釋放的內質網Ca2+水平影響Ca2+依賴的細胞反應[15,16]。SERCAs在Ca2+穩態中起關鍵作用，多種與內質網Ca2+失調相關的疾病與SERCAs功能失調相關，如哮喘和阿爾茨海默病[17,18]。

2.2ORMDL3通過SERCAs調節Ca2+穩態激活ERS 在HEK293細胞中分別轉染GFP和ORMDL3，通過卡巴膽堿刺激內質網Ca2+釋放，發現轉染ORMDL3的細胞內質網中Ca2+水平較低，且SERCAs活性較低，胞漿Ca2+清除率下降，免疫染色和免疫共沉淀研究表明，ORMDL3與SERCAs共定位并抑制其功能，致使胞漿Ca2+升高，內質網Ca2+降低，Ca2+穩態失衡進而激活ERS[6]。此結果為ORMDL3與SERCAs直接作用調節SERCAs活性提供了確鑿證據。

ERS是重要的細胞自我防御機制，在缺氧、藥物、Ca2+穩態失衡等刺激下，內質網功能紊亂，大量錯誤折疊蛋白質堆積于內質網，促使其啟動應急機制，此過程稱為ERS，經典應急通路即為未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)。過表達ORMDL3的人氣道上皮細胞研究表明，ORMDL3選擇性激活UPR的活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)通路[13]。Haze等[19]證實ORMDL3表達提高可激活UPR信號通路基因，而siRNA介導的ORMDL3表達下調可減弱UPR。此外，ORMDL3表達提高導致ERS/UPR轉導分子eIF2α磷酸化和免疫球蛋白重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP) mRNA水平升高，提示ORMDL3通過激活ERS，活化UPR通路。

2.3UPR專屬通路觸發細胞自噬 內質網上存在3種ERS受體：RNA依賴的蛋白激酶樣內質網激酶(RNA-dependent protein kinase (PKR)-like ER kinase,PERK)、肌醇依賴酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)及活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。靜息狀態下，3種受體與內質網中含量豐富的分子伴侶GRP78/BiP結合而處于無活性狀態。一旦發生ERS并啟動UPR，GRP78/BiP 便與上述3種受體解離,轉而結合新生的未折疊蛋白，解離的膜受體繼而活化專屬激活通路：PERK-eIF2α通路、IREl-XBP1s通路及ATF6 通路。上述3條UPR專屬通路均可觸發細胞自噬，清除錯誤折疊蛋白、蛋白聚集物及受損細胞器，緩解內質網壓力[3,20]。

2016年大隅良典因發現“細胞自噬機制”獲得諾貝爾生理學或醫學獎。自噬是細胞層面的回收再利用，從形成吞噬體開始級聯反應，最終降解并回收細胞成分，完成進化保守的物質周轉過程，對細胞的穩態維持和存活具有重要意義[21,22]。多種常見疾病，包括癌癥、感染、退行性疾病和自身免疫性疾病中自噬均具有重要作用。炎癥、ERS、血脂異常等刺激因素均可引起自噬，而ORMDL3在上述誘因中均發揮作用，因此ORMDL3可能為自噬相關基因。

Yang等[23]通過向擬南芥幼苗液體培養基中加入化學物PBA(4-苯基丁酸鈉)或TUDCA(牛磺脫氧膽酸)或過表達BiP蛋白，可減少內質網中未折疊蛋白積累，從而抑制自噬。加入未折疊蛋白芐星青霉素或羧肽酶CPY*則可激活UPR和細胞自噬[23]。炎癥性腸病的研究顯示，具有高分泌特征的潘氏細胞自噬活性顯著增強可平衡高水平的ERS[4]。人內皮細胞株中進行的研究表明，敲除ORMDL3不僅能明顯減輕氧化型低密度脂蛋白誘導的自噬，且能明顯減輕基礎和血清饑餓誘導的自噬[2]。因此，ERS可活化UPR專屬通路，觸發細胞自噬。

3 ORMDL3調控的ERS在疾病中的作用

3.1過敏性哮喘 ORMDL3被確認為哮喘相關基因已十余年，各研究團隊在各類哮喘相關細胞中開展功能研究，但目前尚未定論。Miller等[24]研究ORMDL3在氣道上皮細胞中的作用，發現體外過表達ORMDL3可活化UPR ATF6途徑，并誘導哮喘相關基因表達，過表達ORMDL3的THP-1人單核細胞可激活UPR ATF6途徑；相反，Cantero-Recasens等[6]報道ORMDL3過表達激活PERK通路，但不影響UPR的IRE1通路；而Hsu等[24]研究顯示，ORMDL3表達水平變化不影響NF-κB誘導氣道上皮細胞產生IL-6和IL-8，通過siRNA沉默ORMDL3對UPR并無影響。以上結果不一致原因可能為實驗用細胞系不同，目前對UPR的3條通路雖然研究透徹，但3條通路在不同的細胞中分布不同，UPR反應中同一信號分子在ERS的不同時段發揮的效應不同，增加了ERS 研究的復雜性。

3.2炎癥性腸病 腸上皮細胞具有高度分泌性，ERS/UPR在其分泌功能中發揮重要作用。炎癥性腸病(IBD)患者的腸上皮細胞通常表現出明顯的ERS，表明腸黏膜應激相關炎癥可能既是炎癥的主要來源，也是其延續的主要原因。目前，GWAS和Meta分析已確定了140多個與IBD相關的多態性位點，主要與IBD發病過程中的3條途徑相關：微生物識別、自噬和ERS,Hoefkens等[25]將ORMDL3劃分為ERS相關基因。

在腸上皮細胞XBP1缺失的小鼠(XBP1ΔIECmice)中，ERS及細胞凋亡水平升高，杯狀細胞及潘氏細胞數量下降，導致宿主防御肽合成減少，對李斯特菌易感性增強。XBP1也被證實可抑制實驗性結腸炎相關的癌癥，在TLR介導的促炎反應中必不可少[26]。PERK-eIF2α和ATF6通路也與腸炎癥相關，表達非磷酸化eIF2α的小鼠模型可導致潘氏細胞功能異常，增強沙門氏菌感染和DSS所致結腸炎的易感性。ATF6α缺陷小鼠表現出ERS增強(BiP、ATF4、CHOP和XBP1水平升高)，從而增強了對DSS所致結腸炎的敏感性[27,28]。總之，ERS/UPR途徑在維持腸道穩態方面起重要作用，其破壞與IBD中持續的腸道感染、慢性炎癥和免疫反應失調相關。因此，以調節該途徑為靶點的治療策略可能是IBD治療的突破點。

3.3動脈粥樣硬化 脂質引起的慢性炎癥在動脈粥樣硬化的發生發展中起重要作用，而ORMDL3在脂質穩態、炎癥反應、ERS和UPR中起重要調節作用，研究表明哮喘預示著更高的冠狀動脈疾病風險。因此，慢性炎癥性疾病間具有遺傳重疊的可能性，且有必要探索ORMDL3參與動脈粥樣硬化的發病機制。

Liu的團隊一直致力于ORMDL3的功能學研究，分別在中國北方和南方人群中首次證實了ORMDL3基因上2個高度連鎖不平衡的SNP位點(rs7216389和rs9303277)與動脈粥樣硬化的相關性，且在北方人群中證實攜帶這2個風險等位基因的患者ORMDL3 mRNA表達水平顯著升高，功能學研究表明，在內皮細胞中，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)上調ORMDL3表達，體外敲除ORMDL3不僅能明顯減輕ox-LDL誘導的自噬，且能明顯減輕基礎和血清饑餓誘導的自噬[2]。然而，目前ORMDL3通過哪些途徑及重要的信號通路或分子調節自噬尚未闡明。

3.4腎臟疾病 近10～15年研究表明，內質網功能對腎臟中的蛋白質穩態至關重要，而ERS是各種腎臟疾病的組成部分，如原發性腎小球腎炎、繼發于基因突變的腎小球疾病、糖尿病腎病、急性腎損傷、慢性腎病和腎纖維化。膜性腎病實驗模型上的研究證實，UPR被激活，LC3-Ⅱ水平升高[29]。糖尿病腎病小鼠腎皮質中CHOP和活化ATF6水平升高，sXBP1進入細胞核導致易位受損[30]。急性腎損傷中，缺血再灌注可引起腎小管上皮細胞內錯誤折疊蛋白積累，從而激活UPR，UPR保護缺血再灌注損傷，改善腎功能不全和損傷[31]。慢性腎病中，4-PBA處理可降低TGF-β介導的ERS，促纖維化因子和凋亡標記物增加，減輕ERS，減少腎小管細胞凋亡和纖維化[3]。ERS/UPR在維持腎臟蛋白質平衡中發揮重要作用，使用藥物維持ERS正常是在預防或阻止腎臟疾病進展的重要方向。

4 總結

盡管ORMDL3在調節胞內Ca2+平衡、激活ERS/UPR、參與自噬、脂質代謝及炎癥反應等功能研究中取得了一定進展，但該基因在疾病中的具體作用機制尚未闡明。目前，關于ORMDL3的研究多數局限于哮喘，其在其他炎癥性疾病的詳細調控網絡有待進一步研究。ORMDL3調控的ERS相關炎癥作用途徑不僅加深了本課題組對疾病致病機理的理解，也為發展新的治療方法提供了參考。