甾體類藥物的微生物轉化制備技術新進展

吳天飛，潘建洪，方從申，陳 凱

（臺州仙琚藥業有限公司，浙江 臺州 317016）

0 前言

生物催化具有高選擇性、環境友好等特點，是現今可代替及拓寬有機合成的一個重要研究領域[1]。全細胞生物催化法因細胞自身所具有的輔酶再生系統，其反應過程中無需額外添加昂貴的輔因子，且酶在細胞內環境中具有較強的催化活性，可省去復雜的胞內酶的分離和純化步驟[2-3]。甾體類藥物具有很強的抗過敏、抗感染能力，已成為除抗生素以外的第二大類藥物[4]。甾體類藥物化學合成制備存在步驟復雜、收率低等問題，全細胞生物催化法不僅合成過程高效、簡便，并且還能合成一些化學法所不能合成的甾體中間體[5]，因而全細胞生物催化技術廣泛應用于甾體類藥物的制備研究。生物催化反應介質與催化性能有著密切的聯系，在生物轉化過程中，底物分子需被運送至細胞內，與胞內酶進行反應后再運輸出細胞，其中酶的催化能力與其自身酶活性有關，而底物的傳質速率則取決于轉化體系的性能[6]，因此，選擇合適的生物催化反應介質對提高微生物細胞轉化合成目標產物的能力至關重要。

1 水相體系

全細胞生物催化過程中，為保證催化體系的穩定性，常使用磷酸鹽等緩沖液維持體系pH 及細胞滲透壓。然而一般甾體類物質具有很強的疏水性（溶解度范圍：10-5～10-4mol/L），而甾體轉化酶屬于胞內酶，底物只有擴散進入細胞才能與酶接觸而進行轉化反應，這就導致底物與轉化酶不能很好接觸，造成轉化率偏低，發酵時間延長[7]。因此，開發適用于甾體類化合物微生物轉化的新型反應介質體系受到了人們的重視。

2 雙水相體系

雙水相體系通常指高聚物與高聚物、高聚物與無機鹽組成的兩相體系，也包括某些低分子有機物與無機鹽雙水相和表面活性劑雙水相體系。其成相機理是由于高聚物分子的空間阻礙作用，使得無法相互滲透形成均一相。雙水相體系中微生物細胞催化的優勢，在于它可將細胞限于一相而產物迅速萃取到另一相中，從而可減少產物抑制，或是縮短產物在細胞附近的停留時間來阻止產物的降解[8]。雙水相體系粘度較高，也在一定程度上影響生物轉化過程中氧傳遞的速率。楊英等[9]采用分枝桿菌Mycobacterium sp.UV-8 轉化植物甾醇為雄甾-4-烯-3，17-二酮（AD）（如圖1），考察了高聚物無機鹽雙水相系統、高聚物高聚物雙水相系統對轉化的影響，研究表明，由不同高聚物組成的雙水相體系都可實現甾醇的轉化，且轉化率明顯高于由高聚物與無機鹽構成的雙水相體系，當PEG10000 和DEX2000 濃度分別為12%和8%時，轉化率達50%左右。王艷婷等[10]利用分枝桿菌Mycobacterium sp.MB 3683 降解植物甾醇轉化AD，在組成為200 g 規模的聚乙二醇6000（7 wt%）/葡聚糖70000（8 wt%）雙水相體系中，吐溫-40 加量為1%（V/V）、轉速為240 r/min的優化條件下，豆甾醇投料濃度為10 g/L，轉化96 h 后AD 的濃度達1.1 g/L。

圖1 植物甾醇微生物轉化制備AD

3 雙液相體系和微乳體系

雙液相體系是指由水相與另一不與水相溶的有機相組成的兩相體系。在生物轉化中，該反應介質通過底物及產物與細胞的溶解相不同，從而降低了底物和產物抑制。為增強甾體化合物在反應介質中的溶解度，通常加入甲醇、氯仿、異丙醇、環己烷、正庚烷等有機溶劑作為底物溶解相，但有機溶劑也會對細胞產生一定的毒性作用[11]。因此，一般也會選擇某些毒性較低的表面活性劑作為增溶劑，如吐溫-80、卵磷脂、植物油等。周配等[12]利用分枝桿菌Mycobacterium sp.NRRLB-3683 轉化去氫表雄酮（DHEA，3β-羥基雄甾-5-烯-17-酮），比較了使用大豆油、花生油、玉米油、山茶籽油、葵花油等植物油溶解底物對生物轉化結果的影響，優選出大豆油/水雙相體系作為DHEA 生物轉化的最適體系，并采用30 L 發酵罐進行了放大實驗。反應中添加30%大豆油和25 g/L底物，轉化體系pH=8.0，空氣流量和攪拌速度分別控制在1.0 vvm 和300 r/min，于30 ℃下轉化，轉化率為96.76%，DHEA 濃度和產率分別為16.33 g/L 和92.65%。徐陽光等[13]對不同甾醇底物對有機溶劑和環糊精及其衍生物的偏好性進行了研究。結果表明，植物甾醇（混合甾醇）最適于作為側鏈降解的轉化底物，且底物甾醇對不同的增溶劑無明顯偏好性。以有機溶劑作為增溶劑時，乙醇和丙酮在提高產率方面均優于其它有機溶劑；而環糊精作為增溶劑時，甲基-β-環糊精效果最好，當投料濃度為15 g/L 時（環糊精與底物的質量比為2 ∶1），產率仍大于60%。He 等[14]研究了甲苯與Tris-HCl 緩沖液構成的雙相體系中添加親水性離子液體[BMIM][Lac]作為共溶劑對簡單節桿菌Arthrobacter simplex UR10611 催化β-羥基甲羥孕酮（HMP）轉化為11β，17α-二羥基-6α-甲基孕甾-1，4-二烯-3，20-二酮（PDMDD）的影響，結果表明，體系中加入2%的[BMIM][Lac]時，在80 mg HMP 濃度下，反應16 h，轉化率較未添加離子液體的對照試驗提高了26.8%。

微乳體系是指由水、油、表面活性劑和助表面活性劑（助表面活性劑通常為酚、短鏈醇或其他較弱的兩性化合物）按適當比例混合后，形成的具有各向同性、熱力學穩定的透明或半透明分散體系。楊玉芬等[15]采用簡單節桿菌Arthrobacter simplex UR016 在Tween-80/乙醇/食用油/水構成的微乳體系中考察了11β-羥基甲羥孕酮C1，2的生物脫氫能力，在10 g/L 食用油加量，4 g/L 的Tween-80，7%（V/V）乙醇及4 g/L 底物的濃度下，于33 ℃下轉化46 h，脫氫轉化率達88.6%，較水相轉化工藝提高了66.2%，取得了較好的轉化結果。

4 含離子液體介質體系

離子液體是指在室溫或接近室溫下呈現液態的、完全由離子（有機陽離子和無機或有機陰離子）所組成的鹽，離子液體作為一種新型反應介質，被譽為21 世紀清潔綠色工業中最理想的反應介質之一，它具有非揮發性、強極性和熱穩定性好等特點[16]，目前已有將其應用于甾體化合物生物轉化的相關研究報道[17]。與其他反應介質比較，離子液體存在粘度大、價格較高的問題。Shen 等[18]利用簡單節桿菌Arthrobacter simplex CPCC 140451催化轉化醋酸可的松（CA）為醋酸強的松（PA）（如圖2）。比較了兩種咪唑啉類離子液體對反應的影響情況及相關機制的研究，結果表明離子液體處理后增加了細胞膜的通透性，使得甾體轉化效率得到了提高。Huang 等[19]考察了7 種不同的親水性離子液體和3 種有機溶劑對簡單節桿菌Arthrobacter simplex UR016 催化17α-羥基-16β-甲基孕甾-4，9（11）-二烯-3，20-二酮（HMPDD）為17α-羥基-16β-甲基孕甾-1，4，9（11）-三烯-3，20-二酮（HMPTD）反應性能的影響，盡管大多數離子液體表現出較有機溶劑更高的毒性，但在離子液體濃度低于2.5 mmol/L 時，[EMIM][Lac]或[BMIM][Lac]有助于細菌生長，且在[EMIM][Lac]含量為0.3%的最優條件下，轉化率達到了93.4%。Wang 等[20]也考察了咪唑啉類離子液體對簡單節桿菌催化CA 時的影響，研究表明，側鏈上帶有3個碳原子的離子液體可增加簡單節桿菌對CA 轉化率、溶解度和細胞膜透性，普遍抑制了細胞的生長速率和活性，其中[PF6]-陰離子的ILs 抑制活性最強。袁俊杰[21]考察了合成的16 種水溶性離子液體對植物甾醇的溶解能力，結果表明，植物甾醇在12 種四丁基磷／銨脂肪酸鹽離子液體中的溶解度可達176～565 g/L，是離子液體[BMIM][BF4]（0.1 g/L）和[BMIM][Lac]（0.4 g/L）的1000 倍，較甲醇中提高了100 倍，比乙醇中也提高了10 倍左右。

圖2 簡單節桿菌（ASP）轉化醋酸可的松（CA）為醋酸強的松（PA）的反應過程

5 含低共熔溶劑體系

低共熔溶劑是指由氫鍵受體（如季銨鹽）和氫鍵供體（如酰胺、羧酸和多元醇等化合物）在一定比例下組合而成的兩組分或三組分低共熔混合物。低共熔溶劑的物理化學性質與離子液體非常相似，因此也有人把它歸為一類新型離子液體或離子液體類似物。天然低共熔溶劑因其易制備、無毒、易降解等特點，已被作為一種新型“綠色”介質引入生物催化中[22]。Mao 等[23]研究了3 種低共熔溶劑在簡單節桿菌Arthrobacter simplex TCCC 11037 催化CA 反應中的作用，發現反應體系中添加6%的醋酸膽堿/尿素，在5 g/L 的底物濃度下，產率可達93%，與不添加低共熔溶劑的對照試驗相比，產率提高了25%。

6 結論與展望

甾體類藥物在臨床上具有重要的藥理活性，市場經濟價值很高。在生物催化制備甾類藥物過程中，提高其底物溶解度一直是其制備研究的一項難題。利用介質工程構建不同的生物轉化介質體系，可很好地解決底物疏水性的問題，其中兩相體系能進一步降低底物和產物抑制，對提高底物濃度有著重要的作用。現今，離子液體與天然低共熔溶劑等具有綠色環保優勢的反應介質已被應用于甾體類藥物的生物轉化反應中，為構建新型綠色高效的生物轉化反應體系提供了新途徑，為甾體藥物的制備工藝提供了新的選擇。