基于乳糖水解酶的乳酸乳球菌乳糖代謝多樣性研究

鄧笑穎，楊宇，姜楊，劉小鳴，趙建新，張灝，陳衛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)作為一種傳統的乳品發酵劑[1]，被廣泛地應用于干酪、酸奶油和酸奶等發酵乳制品的生產過程中[2]。乳糖是牛乳中最主要的碳水化合物[3-4]，其含量高達99%以上，乳糖代謝特性對乳酸乳球菌在乳體系中的應用至關重要[5]。目前，國內外對乳糖代謝的研究著重于通過乳酸菌的發酵降低乳制品中的乳糖含量。OHLSSON等[6]發現，在牛乳中添加乳酸乳球菌乳脂亞種能代謝更多的乳糖。

研究發現，乳酸菌中有2條乳糖代謝通路(圖1)[7]，一條是通過磷酸轉運系統(phosphotransferase systems，PTS)攝入乳糖，磷酸化使其轉化為6-磷酸乳糖，6-磷酸乳糖在磷酸-β-半乳糖苷酶(phosphate-β-galactosidase，P-β-galactosidase)的作用下水解成6-磷酸半乳糖和葡萄糖，6-磷酸半乳糖通過塔格糖-6-磷酸(tagatose-6-phosphate，T6P)途徑發生進一步代謝，葡萄糖則進入糖酵解途徑代謝分解[8-11]；另一條則是乳糖通過透性酶進入細胞內，在β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的作用下水解形成半乳糖和葡萄糖，半乳糖經Leloir途徑進一步代謝，葡萄糖進入糖酵解途徑[12-13]。

乳糖的不徹底分解會造成大量的半乳糖積累，這些半乳糖的存在往往會影響發酵乳制品的品質，如造成馬蘇里拉奶酪、瑞士硬干酪和切達奶酪的褐變[14-16]。WU等[17]研究發現干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和乳酸乳球菌等能夠通過上述2條不同的代謝途徑代謝半乳糖，其中干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌編碼T6P途徑的基因位于染色體上，而乳酸乳球菌則是由質粒編碼[13]。因此，乳酸乳球菌的半乳糖代謝能力存在菌株差異性。

本文選取了10株不同的乳酸乳球菌并測定了它們在以乳糖為單一碳源的培養基中生長、產酸、乳糖代謝情況以及β-半乳糖苷酶和P-β-半乳糖苷酶的活力，以市售發酵劑中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為對照，探究不同的乳酸乳球菌菌株在乳糖代謝能力方面是否存在差異。為了進一步確定各菌株中2種半乳糖代謝途徑的差異，測定了發酵液中半乳糖積累情況，為從乳糖利用角度篩選優良的乳酸乳球菌發酵劑提供了一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑

胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、無水葡萄糖、檸檬酸氫二銨、吐溫80、一水合乳糖、CH3COONa、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、K2HPO4·3H2O、CHCl3、Na2CO3、Na2HPO4、NaH2PO4·H2O、KCl，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG),分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司；鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷-6-磷酸環己胺鹽,分析純，上海創賽科技有限公司。

圖1 乳酸菌Leloir途徑和塔格糖-6-磷酸途徑的概貌Fig.1 General presentation on the Leloir pathway and tagatose-6-phosphate pathway in lactic acid bacteria

1.1.2 儀器設備

UV-1800紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；3020酶標儀，Thermo Fisher SCIENTIFIC；ST3100型pH計，奧豪斯儀器(常州)有限公司；MK-20型干式恒溫器，杭州奧盛儀器有限公司；HWS-150型恒溫恒濕培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；GR60DA型立式自動壓力蒸汽滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；TGL-16M型臺式高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.1.3 實驗菌株

本文所使用的10株乳酸乳球菌、1株德氏乳桿菌保加利亞亞種和1株嗜熱鏈球菌均由江南大學食品學院生物技術中心提供。菌株具體信息如表1所示。

表1 實驗菌株信息Table 1 Information of strains used in this study

1.2 方法

1.2.1 試劑配制

1.2.1.1 培養基

普通MRS培養基參照WU等[18]的配方，MRS-乳糖培養基(MRS-lactose broth)在普通MRS培養基配方的基礎上稍作修改，用乳糖等量替換葡萄糖。所有培養基在使用前均于115 ℃中滅菌20 min。

1.2.1.2 半乳糖苷酶檢測工作液

參照WU等[18]的配方配制Z buffer和ONPG底物溶液，鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷-6-磷酸環己胺鹽底物溶液在ONPG底物溶液配方的基礎上，用鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷-6-磷酸環己胺鹽等量替代ONPG。

1.2.2 菌株活化

實驗前菌株需在MRS培養基中活化3代，第1代從保菌管中蘸取菌液，涂布于MRS固體平板上，劃線分離，30 ℃培養48 h；第2代挑取單菌落至MRS液體培養基，30 ℃培養24 h；第3代按體積分數2%接種于MRS液體培養基中，30 ℃培養10 h。

1.2.3 菌株在MRS-乳糖培養基中生長特性的測定

將活化后的菌液按體積分數2%接種于MRS-乳糖液體培養基中，置于30 ℃培養箱中培養，每隔2 h取樣測定pH值和OD600，測定0、2、4、6、8、10、12 h菌株生長、產酸情況，取培養12 h的發酵液于-20 ℃凍存，待測。

1.2.4 乳糖水解酶活力的測定

1.2.4.1 β-半乳糖苷酶

參照WU等[18]的方法測定乳酸乳球菌的β-半乳糖苷酶。

1.2.4.2 磷酸-β-半乳糖苷酶

參照WU等[18]的方法并略作修改，將ONPG底物溶液換成鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷-6-磷酸環己胺鹽底物溶液，測定菌株的P-β-半乳糖苷酶活力。

1.2.5 復配實驗

選取具有代表性的乳酸乳球菌菌株分別與嗜熱鏈球菌菌株和保加利亞乳桿菌菌株進行復配實驗，將活化3代的單菌菌液按1∶1(V∶V)的比例兩兩復配，并按體積分數2%接種于MRS-乳糖液體培養基中，置于30 ℃培養箱中培養，取培養12 h的發酵液于-20 ℃凍存，待測。

1.2.6 乳糖、半乳糖含量的測定

量取1 mL上述待測的12 h后的發酵液，加純凈水稀釋4倍，混勻，以11 000 r/min在4 ℃離心5 min，離心后的菌液過0.22 μm濾膜，取濾液1 mL，送至江南大學國家重點實驗室測試平臺利用HPLC檢測乳糖和半乳糖含量。

1.2.7 統計分析及數據處理

采用SPSS 21.0統計分析軟件進行數據處理和統計分析，數據間的比較采用Duncan模型進行顯著性分析，顯著性水平P<0.05；數據圖采用Origin Pro8軟件繪制。

2 結果與討論

2.1 菌株在MRS-乳糖培養基中的生長和產酸特性

對10株乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌在MRS-乳糖培養基中的生長和產酸情況進行測定，結果如圖2、3所示。10株乳酸乳球菌在以乳糖為單一碳源的MRS培養基中均能生長，其中6株乳酸乳球菌(DYNDL66M43、DYNDL21-2、DSCAB12M2、DSCAB11M15、DSCAB2M1、E207)在培養6 h后進入穩定期，pH值降到4.90以下。2株乳酸乳球菌(FJNDD18M8和FSDHZ-D8-L3)在MRS-乳糖培養基中的生長和產酸較為緩慢，12 h內尚未進入穩定期，pH值末達到5.10。剩余2株乳酸乳球菌(DYNDL34-3和DYNDL50-3)在MRS-乳糖中生長極為緩慢，雖然6 h也能進入穩定期，但pH值只在前2 h內下降0.2～0.3，之后維持穩定。嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌在MRS-乳糖培養基中生長較為緩慢，在12 h內尚未進入穩定期，保加利亞乳桿菌pH值在12 h降至4.70以下，而嗜熱鏈球菌pH值為5.36。因此，結合上述菌株生長和產酸的情況可以推斷，乳酸乳球菌的不同菌株在以乳糖為單一碳源的環境中生長、產酸能力存在較大差異，且生長和產酸情況呈正相關關系，其中6株乳酸乳球菌的生長、產酸情況優于市售發酵劑中的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌。

圖2 不同菌株在MRS-乳糖培養基中的生長情況Fig.2 Growth of different strains in MRS-lactose broth

圖3 菌株在MRS-乳糖培養基中的pH值變化情況Fig.3 Changes pH of different strains in MRS-lactose broth

2.2 菌株在MRS-乳糖培養基中乳糖的利用情況

通過測定菌株發酵液中殘余乳糖含量可知菌株利用乳糖能力強弱(如圖4)。

圖4 不同菌株在MRS-乳糖培養基中培養12 h后培養基中殘余乳糖含量Fig.4 Residual lactose content of different strains in MRS-lactose broth after 12 h cultivation注：不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05),下同。

從圖4可以看出，用于空白對照的MRS-乳糖培養基中乳糖含量為21 279.04 mg/L；與對照組相比，乳酸乳球菌DYNDL34-3和DYNDL50-3的發酵液中乳糖含量沒有發生顯著性下降，FSDHZ-D8-L3和FJNDD18M8的乳糖含量出現小幅度下降，其余6株乳酸乳球菌(DYNDL66M43、DYNDL21-2、DSCAB12M2、DSCAB11M15、DSCAB2M1、E207)和嗜熱鏈球菌StK1的乳糖利用較多，12 h內發酵液中乳糖下降5 439～8 551 mg/L。而相較于乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌，保加利亞乳桿菌的乳糖利用能力最強，在12 h內發酵液乳糖含量下降約9 100 mg/L。

菌株在MRS-乳糖培養基中的乳糖利用情況與菌株的生長情況(圖2)基本一致，其中乳糖利用多的DYNDL66M43、DYNDL21-2、DSCAB12M2、DSCAB11M15、DSCAB2M1和E207在MRS-乳糖培養基中的生長明顯優于菌株DYNDL34-3、DYNDL50-3、FSDHZ-D8-L3和FJNDD18M8，因此推測各菌株的β-半乳糖苷酶活力和P-β-半乳糖苷酶活力存在差異，導致菌株的乳糖利用能力差異較大，酶活力高的菌株可以代謝更多的乳糖獲得生長優勢。

2.3 乳糖水解酶活力的測定

為了進一步探究不同菌株乳糖利用存在差異的原因，對10株乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌StK1和保加利亞乳桿菌LbK1的β-半乳糖苷酶活力和P-β-半乳糖苷酶活力進行了測定，結果如圖5所示。保加利亞乳桿菌LbK1的β-半乳糖苷酶活力最高，達到1 947.22 Miller Units，嗜熱鏈球菌的β-半乳糖苷酶活力次之，為1 375.90 Miller Units。而10株乳酸乳球菌中FSDHZ-D8-L3和FJNDD18M8的β-半乳糖苷酶活力較高，分別為223.97 Miller Units和173.65 Miller Units，其余8株菌的β-半乳糖苷酶幾乎無活力。以往研究表明，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的β-半乳糖苷酶活力要高于其他乳酸菌。WU等[18]的結果顯示，保加利亞乳桿菌ASCC859的β-半乳糖苷酶活力約為1 500 Miller Units，嗜熱鏈球菌ASCC1275的酶活力超過1 000 Miller Units，遠高于瑞士乳桿菌和干酪乳桿菌。

圖5 不同菌株的β-半乳糖苷酶和磷酸-β-半乳糖苷酶活力Fig.5 β-galactosidase and phosphate-β-galactosidaseactivities of different strains

嗜熱鏈球菌StK1和保加利亞乳桿菌LbK1均無P-β-半乳糖苷酶活力，8株乳酸乳球菌都表現出一定的P-β-半乳糖苷酶活力，其中菌株DYNDL21-2的活力最高，達到144.89 Miller Units。此外，P-β-半乳糖苷酶活力在100 Miller Units以上的菌株還包括DSCAB11M15，DSCAB12M2，DYNDL66M43。E207和DSCAB2M1的P-β-半乳糖苷酶的酶活力大于50 Miller Units，其余2株乳酸乳球菌的P-β-半乳糖苷酶活力都低于15 Miller Units，DYNDL34-3和DYNDL50-3基本無P-β-半乳糖苷酶活力。

結合菌株的β-半乳糖苷酶和磷酸-β-半乳糖苷酶活力可知，不存在1株菌的2種半乳糖苷酶活力均高于15 Miller Units，即這些菌株多以1種半乳糖苷酶活力為主。由此推斷，菌株FSDHZ-D8-L3、FJNDD18M8、StK1和LbK1主要依賴β-半乳糖苷酶水解乳糖，進而利用Leloir途徑代謝半乳糖，菌株DSCAB2M1、DSCAB11M15、DSCAB12M2、DYNDL21-2、DYNDL66M43和E207主要依賴P-β-半乳糖苷酶水解乳糖，并利用T6P途徑代謝半乳糖，而菌株DYNDL34-3和DYNDL50-3不能水解乳糖，因此無法在以乳糖為單一碳源的培養基中生長。

WU等[17]將NCBI上公布的各類乳酸菌的全基因組進行了KEGG數據庫比對，結果發現絕大多數乳酸菌含有Leloir途徑，而乳酸菌中T6P途徑存在種屬差異。其中，已公布全基因組的11株乳酸乳球菌全部含有完整的Leloir途徑，但只有3株菌含有編碼T6P途徑的基因，且基因位于質粒上，存在菌株差異性。然而這種差異跟菌株的分離源是否存在一定的聯系，目前尚需進一步確認。

此外，菌株DYNDL34-3和DYNDL50-3分離自乳源(表1)，但在以乳糖為單一碳源的培養基中基本不利用乳糖(圖4)，β-半乳糖苷酶和P-β-半乳糖苷酶活力(圖5)也很低，推測菌株基因組中不存在編碼酶的相關基因或基因未被誘導表達。對這2株菌的全基因組進行KEGG數據庫比對，結果顯示2株菌基因組中只含有編碼β-半乳糖苷酶和Leloir途徑的基因，缺乏編碼P-β-半乳糖苷酶和T6P途徑的基因(數據未公布)，由此可知2株菌的β-半乳糖苷酶在乳糖培養基中未被誘導表達。而DYNDL34-3和DYNDL50-3能在其自身分離源中生長，推測可能是環境中其他乳酸菌水解乳糖生成了半乳糖和葡萄糖，2株菌利用Leloir途徑代謝環境中的半乳糖得到生長。

2.4 T6P途徑對乳酸球菌半乳糖代謝的影響

NEVES等[19]利用13C核磁共振發現乳酸乳球菌MG1363中Leloir途徑的代謝中間產物半乳糖-1-磷酸和葡萄糖-1-磷酸有積累現象，且葡萄糖磷酸變位酶活力有限，而該酶是半乳糖通過Leloir途徑代謝的關鍵酶。WU等[18]通過HPLC測定干酪乳桿菌的發酵液，發現乳糖利用多且半乳糖積累少，而干酪乳桿菌基本不表達β-半乳糖苷酶，因此推斷菌株利用T6P途徑比利用Leloir途徑積累的半乳糖少。

利用HPLC對10株乳酸乳球菌、保加利亞乳桿菌LbK1和嗜熱鏈球菌StK1在MRS-乳糖培養基中培養12 h后的發酵液中半乳糖含量進行測定，結果如圖6所示。

N.D.表示未檢測到半乳糖圖6 不同菌株在MRS-乳糖培養基中培養12 h后培養基中殘余半乳糖含量Fig.6 Residual galactose content of different strains in MRS-lactose broth after 12 h cultivation

從圖6可以看出，保加利亞乳桿菌LbK1和嗜熱鏈球菌StK1的發酵液中積累了大量半乳糖，而利用T6P途徑代謝半乳糖的乳酸乳球菌發酵液中半乳糖積累很少。乳酸乳球菌中乳糖利用最多的DSCAB2M1菌株的發酵液中乳糖含量在12 h內下降7 213 mg/L，保加利亞乳桿菌LbK1的乳糖含量下降9 083 mg/L，而2株菌發酵液中的半乳糖含量分別為344和4110 mg/L，可知保加利亞乳桿菌代謝乳糖出現嚴重的半乳糖積累現象。對于殘余乳糖含量相差不多的乳酸乳球菌DYNDL66M43、DYNDL21-2、DSCAB12M2、DSCAB11M15和嗜熱鏈球菌StK1，4株乳酸乳球菌的半乳糖含量都小于300 mg/L，而嗜熱鏈球菌StK1的半乳糖含量高達2 281 mg/L。此外，利用Leloir途徑代謝半乳糖的FSDHZ-D8-L3和FJNDD18M8的半乳糖含量也分別達到290和272 mg/L。綜上，利用Leloir途徑代謝乳糖的LbK1、StK1、FSDHZ-D8-L3和FJNDD18M8都出現嚴重的半乳糖積累現象，而利用T6P途徑代謝半乳糖的乳酸乳球菌菌株無半乳糖積累現象。WU等[18]認為T6P途徑代謝半乳糖涉及的酶促反應少，而Leloir途徑代謝半乳糖涉及的反應多且復雜。NEVES等[19]從生物能量學的角度論述了PTS是碳水化合物從胞外轉運到胞內最有效的方式。TAMARA等[20]也認為乳糖最有效的轉運方式是PTS。因此，乳酸乳球菌利用T6P途徑代謝半乳糖更加高效。

2.5 T6P途徑代謝的影響的乳酸乳球菌對嗜熱鏈球菌半乳糖

從10株乳酸乳球菌中選取6株具有代表性的菌株分別與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進行復配，測定12 h后發酵液中殘余乳糖和半乳糖的含量，結果如圖7、圖8所示。

圖7 復配菌株在MRS-乳糖培養基中培養12 h后培養基中殘余乳糖含量Fig.7 Residual lactose content of co-culture strains inMRS-lactose broth after 12 h cultivation

圖8 復配菌株在MRS-乳糖培養基中培養12 h后培養基中殘余半乳糖含量Fig.8 Residual galactose content of co-culture strains inMRS-lactose broth after 12 h cultivation

從圖7、圖8中可以看出，嗜熱鏈球菌StK1單菌培養時，發酵液中乳糖含量在12 h內下降6 694 mg/L，與E207、DSCAB12M2復配時，發酵液乳糖含量在12 h內分別下降6 791和6 399 mg/L，而半乳糖含量僅為1 002和802 mg/L，半乳糖積累現象明顯減弱。由此推斷，利用T6P途徑代謝半乳糖的乳酸乳球菌與嗜熱鏈球菌StK1復配之后積累的半乳糖含量明顯低于嗜熱鏈球菌單菌培養時積累的半乳糖量。此外，對于保加利亞乳桿菌LbK1而言，這種利用T6P途徑減弱半乳糖積累的現象存在菌株差異性。LbK1和E207、DSCAB12M2混合培養12 h后發酵液中乳糖含量分別下降9 653和7 224 mg/L，而半乳糖含量分別為4 038和1 024 mg/L，可知LbK1和E207復配半乳糖積累嚴重。WU等[18]論述了利用T6P途徑代謝半乳糖的干酪乳桿菌分別與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌復配時半乳糖積累的情況，發現干酪乳桿菌與嗜熱鏈球菌組合可以減弱半乳糖積累，而與保加利亞乳桿菌復配時半乳糖含量明顯大于保加利亞乳桿菌單菌培養時半乳糖的含量。由此可見，這種利用T6P途徑減弱半乳糖積累的作用在菌株之間存在差異性。

3 結論

通過對不同的乳酸乳球菌菌株在以乳糖為單一碳源環境下的生長、產酸和乳糖代謝情況以及β-半乳糖苷酶和P-β-半乳糖苷酶的活力進行了測定，發現不同菌株的乳糖代謝能力存在顯著性差異。2種乳糖水解酶活力差異影響了各菌株半乳糖代謝的差異性，其中P-β-半乳糖苷酶水解乳糖產生的半乳糖-6-磷酸進入T6P途徑代謝，而β-半乳糖苷酶水解乳糖生成的半乳糖進入Leloir途徑代謝。測定乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的12 h發酵液中的半乳糖含量，發現Leloir途徑代謝半乳糖出現積累現象，而利用T6P途徑代謝半乳糖可減輕半乳糖積累情況。將可以利用T6P途徑代謝半乳糖的乳酸乳球菌分別與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌復配，發現與嗜熱鏈球菌復配時半乳糖積累現象得到明顯減弱，而與保加利亞乳桿菌復配時半乳糖積累減弱的現象存在菌株差異。

如何降低發酵乳制品中乳糖、半乳糖含量的問題備受關注，而通過乳酸菌代謝有效降低發酵乳制品中乳糖、半乳糖的含量一直是潛在的研究方向。利用含有P-β-半乳糖苷酶和T6P途徑的乳酸乳球菌可以顯著降低發酵乳制品中的乳糖且半乳糖積累較少，但在與其他傳統發酵劑復配時情況較為復雜，有待進一步的研究。