屎腸球菌纖維素結合域谷氨酸脫羧酶構建及其酶學性質

楊勝遠，林謙，賴麗萍，黃婷婷

1(嶺南師范學院 化學化工學院，廣東 湛江，524048) 2(玉林師范學院 生物與制藥學院，廣西 玉林，537000)

谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.15)可專一地催化L-谷氨酸(L-glutamic acid,L-Glu)α-羧基脫羧作用，在γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)生物合成和手性物質DL-谷氨酸(DL-glutamic acid，DL-Glu)拆分方面發揮著重要作用[1-3]。由于乳酸菌的安全性較好，便于在發酵食品中應用，乳酸菌GAD受到了極大關注，已發現Lactobacillusbrevis[4]、Lactobacillusfutsaii[5]、Lactobacillusrhamnosus[6]、Lactobacillussakei[7]、Streptococcussalivariusssp.thermophilus[8]、Pediococcuspentosaceus[9]、Enterococcusfaecium[10]和Lactobacillusplantarum[11]等微生物均具有GAD。然而，由于乳酸菌生長易受其代謝產生的乳酸抑制，生長緩慢，GAD產量低，難以滿足生產需要。為了降低GABA合成和DL-Glu拆分成本，一些學者對GAD進行了固定化研究，以期重復利用GAD。已有文獻報道利用多孔硅球[11]、殼聚糖、戊二醛[12]、羧基化磁性微球[13]、細菌纖維素[14]和金屬親和樹脂[15-16]對不同來源GAD進行了固定化，然而，從固定化成本、固定化酶強度、固定化載體安全性、固定化酶活力等工業應用角度綜合考量，現有方法尚有待完善，所以研發工藝簡單、成本低和環境友好的固定化方法仍是酶工程領域的重要課題。

纖維素來源豐富，價格低廉，化學惰性，對大多數蛋白質非特異性親和力低，是一種優質的載體。大多數纖維素降解酶包含3個結構域：纖維素結合結構域(cellulose-binding domain，CBD)、柔性連接區域和催化結構域[17-19]，因此可利用CBD能與纖維素特異和不可逆結合的特性，將CBD開發為親和標簽，構建融合蛋白，實現與纖維素親和吸附的目的[19-23]。要實現這一目標，CBD融合酶的構建、高效表達以及有效維持或改善原天然酶的酶學特性是該技術的關鍵。

不同種類的酶結構存在差異，甚至是同一種酶，其結構也可能因來源不同而差異顯著。例如，Lactococcuslactissubsp.lactisGAD只有一個亞基，亞基分子量約為54 kDa[24]；Streptococcussalivariusssp.thermophilusGAD具有2個亞基，亞基分子量約為46.9 kDa[25]；而EscherichiacoliGAD含有6個相同的亞基，分子量約為53 kDa[26]。由此可見，雖然通過構建CBD融合酶實現酶的固定化已有報道，但是由于酶的結構差異性，CBD融合酶能否構建成功、融合酶的活性以及酶學性質是否會發生改變等方面尚存在極大不確定性。由此可見，該項技術尚未成熟，亟需更多研究進行補充和完善。

前期研究已表明，屎腸球菌(E.faecium)具有較高GAD活性，在GABA生物合成方面具有較好的開發利用前景[10]。本實驗主要對E.faecium纖維素結合域谷氨酸脫羧酶(CBD-GAD)的構建、純化及其酶學性質進行探討，以期為纖維素親和固定化E.faeciumGAD提供理論和應用依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E.faeciumGDMCC 60203作為專利菌種保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，是嶺南師范學院綠色生物制造研究室從泡菜中分離獲得，是本實驗GAD基因gadB來源菌株。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5ɑ由玉林師范學院生物與制藥學院林謙博士提供，用于CBD-GAD融合酶的表達。E.coliGDMCC 60445作為專利菌種保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，為本實驗自行構建的可表達CBD-GAD融合酶的重組菌株。

層析硅膠G薄板，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠；γ-氨基丁酸(質量分數≥99%)、5′-磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate, PLP)、異硫氰酸苯酯(phenylisothiocyanate，PITC)，美國Sigma公司；乙腈、乙酸、三乙胺(均為色譜純)，美國TEDIA公司；氨芐青霉素(美國藥典級)，生工生物工程(上海)有限公司；細菌基因組提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒康,世紀生物技術公司；TransStart FastPfuDNA聚合酶，全式金生物技術公司；TaqDNA聚合酶、pMD19 Simple T載體、In-fusion HD基因克隆試劑盒，大連寶生物工程公司。其他試劑為市售生化試劑或分析純試劑。

載體pRPOCB為自行構建的E.coli質粒，主要在pUC57質粒中插入了脅迫誘導型啟動子PrpoS、cbm3(來自Clostridiumthermocellum的家族Ⅲ纖維素結合域)編碼序列和T7終止子序列。

引物efa-1、efa-2、Infu-13、Infu-22、Infu-24和Infu-27均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

LB培養基參照文獻[27]配制，略有改變。胰蛋白胨10 g/L、酵母粉 5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 6.0。

PSB(peptone-sucrose-beef extract)培養基參照文獻[10]配制，略有改變。蛋白胨15 g/L、牛肉膏10 g/L、蔗糖12.5 g/L、乙酸鈉6 g/L、L-谷氨酸一鈉(monosodium glutamate，MSG)10 g/L、吐溫-80 1.0 g/L，pH 7.0。

上述培養基按照配方配制，分裝于規格為250 mL三角瓶，每瓶120 mL，121 ℃滅菌20 min，臨用前加入240 μL 50 mg/mL氨芐青霉素。

再生無定形纖維素(regenerated amorphous cellulose，RAC)參照文獻[28]制備。

1.2 儀器與設備

1200 Series高效液相色譜儀(配置G1354A四元梯度泵、G1316A 柱溫箱、G1314B可變波長紫外檢測器、Chemstation工作站)，美國安捷倫公司；HZQ-F100恒溫振蕩培養箱，金壇市精達儀器制造有限公司；TGL16M臺式高速冷凍離心機，鹽城市凱特實驗儀器有限公司；SHA-2冷凍水浴恒溫振蕩器，江蘇省金壇市三和儀器有限公司；AUW120電子分析天平，日本Shimadzu公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子液的制備

E.faeciumGDMCC 60203種子液制備：從4 ℃保藏的菌種斜面挑取1環，接入PSB培養基中，37 ℃靜置培養12 h，然后按體積分數1%的接種量再次接入PSB培養基，37 ℃靜置培養12 h。

E.coliDH5ɑ和E.coliGDMCC 60445種子液制備：吸取-25 ℃甘油保藏的菌種1 mL，接入LB培養基，37 ℃，120 r/min振蕩培養12 h。

1.3.2E.faeciumCBD-GAD重組大腸桿菌的構建

1.3.2.1E.faecium的gadB基因克隆

采用細菌基因組提取試劑盒，按照其說明書提取E.faecium基因組DNA，具體方法為：取E.faeciumGDMCC 60203種子液5 mL，4 ℃、8 500 r/min離心15 min，收集菌體，加入180 μL酶解緩沖液重懸菌體，37 ℃保溫30 min，再依次加入20 μL蛋白酶K和200 μL緩沖液GL，旋渦振蕩混勻, 56℃保溫30 min，然后加入200 μL無水乙醇，旋渦振蕩混勻，即為細胞酶解液。將細胞酶解液加入到已裝入收集管的吸附柱，以12 000 r/min離心1min，棄收集管中的廢液，按此相同的加液、離心、棄廢液操作，依次分別用500 μL緩沖液GW1、500 μL緩沖液GW2洗滌吸附柱。將經離心脫液的吸附柱置于室溫數分鐘，以徹底晾干，然后將吸附柱置于一個新的1.5 mL離心管中，向吸附柱中間懸空部位加入100 μL緩沖液GE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心1 min，收集離心管中的DNA溶液即為E.faeciumGDMCC 60203基因組DNA，于-20 ℃保存備用。

根據NCBI中的E.faecium基因組序列，設計和合成引物efa-1和efa-2,用于擴增谷氨酸脫羧酶基因gadB：

efa-1: 5′-ATGTTATACGGAAAAGATAATCAAGAA G-3′

efa-2: 5′-TTAGTGAGTAAAGCCGTACGTTTTCAC-3′

以基因組DNA為模版，以efa-1和efa-2為引物，使用TransStart FastPfuDNA聚合酶擴增，PCR程序為：95 ℃、2 min；95 ℃、20 s，50 ℃、30 s，72 ℃、55 s，循環33次；72 ℃、5 min。擴增結束后，在反應體系中加入1 μLTaqDNA聚合酶，72 ℃、20 min，使PCR產物3′端得到突出的堿基A。電泳切膠，用DNA膠回收試劑盒回收PCR產物，與pMD19 Simple T載體連接，轉化E.coliDH5α感受態細胞，挑取單菌落，提取重組質粒pMD-EfagadB，委托生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.3.2.2 CBD-GAD融合酶表達載體及重組大腸桿菌的構建

設計和合成引物Infu-13、Infu-24、Infu-22和Infu-27：

Infu-13: 5′-GTTTGGGGTAAAGAACCGGGATCC ATGTTATACGGAAAAGATAATCAAGAAG-3′

Infu-24: 5′-GCCCTCGAGGAATTCTTAGTGAGTAAAGCCGTACGTTTTCAC-3′

Infu-22: 5′-GAATTCCTCGAGGGCTCTTCCAG-3′

Infu-27: 5′-GGATCCCGGTTCTTTACCCCAAACC-3′

以Infu-13和Infu-24為引物，以pMD-EfagadB作為模板，通過PCR擴增gadB基因，電泳切膠，回收純化gadB基因；以Infu-22和Infu-27為引物，以pRPOCB質粒作為模板，通過PCR擴增制備線性化的載體，電泳切膠，回收純化目的片段。使用TransStart FastPfuDNA聚合酶擴增，PCR程序為95 ℃、2 min；95 ℃、20 s，54 ℃、30 s，72 ℃、105 s，循環33次；72 ℃、5 min。

將gadB基因與線性化載體pRPOCB用In-fusion HD基因克隆試劑盒進行拼接，構建重組質粒pRPOCB-EfagadB。反應體系為：2 μL In-fusion酶、1 μLgadB基因、2 μL 線性化載體、5 μL ddH2O，總計10 μL。離心30 s，50 ℃連接15 min。

將pRPOCB-EfagadB重組質粒轉化E.coliDH5α感受態細胞。挑取單菌落，提取質粒后，用BamH I、EcoR I雙酶切質粒，進行電泳檢測。轉化了重組質粒pRPOCB-EfagadB的E.coliDH5α菌株即為E.coliGDMCC 60445。

1.3.2.3 CBD-GAD融合酶的表達

將20 mLE.coliGDMCC 60445接于LB液體培養基，于37 ℃、120 r/min振蕩培養9～10 h，再取1 mL培養液轉接到120 mL LB培養基，37 ℃振蕩培養24 h作為發酵液。

1.3.2.4 CBD-GAD融合酶的提取與固定化

將120 mLE.coliGDMCC 60445發酵液于4 ℃、8 500 r/min離心15 min，收集菌體，加入30 mL生理鹽水，攪拌分散洗滌菌體，再次離心收集菌體，然后加入pH 8.0、50 mmol/L Tris-HCl緩沖液10 mL，在冰水浴中以400 W功率，超聲波破碎細胞(工作5 s，冷卻5 s，全程50 min)。將細胞破碎液于8 500 r/min、 4 ℃離心15 min，上清液即為CBD-GAD融合酶粗酶液。

稱取0.8 g RAC濕質量與8 mL CBD-GAD粗酶液混合，30℃、50 r/min振蕩15 min，濾出液體，然后采用40 mL pH 8.0、50 mmol/L Tris-HCl緩沖液分5次洗滌固形物，再采用40 mL pH 4.8、0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液分5次洗滌固形物，濾除洗滌液，即可獲得RAC固定化CBM-GAD(RAC-CBD-GAD)。

1.3.2.5 RAC-CBD-GAD活性測定

為了避免E.coli受自身基因組表達的E.coliGAD的影響，本實驗通過測定RAC-CBD-GAD活性以評價CBD-GAD融合酶的表達情況。

將0.2 g RAC-CBD-GAD與10 mL pH 4.8、0.25 mol/LL-Glu溶液(溶于0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液，含0.2 mmol/L PLP)混合，40 ℃、80 r/min水浴振蕩反應30 min，立即吸取0.5 mL反應液與0.5 mL無水乙醇混合以終止反應， 8 500 r/min離心15 min，取上清液定性和定量測定GABA。

GABA定性檢測：將上清液用蒸餾水適當稀釋后，采用薄層層析(thin-layer chromatography, TLC)進行鑒定；展開劑為正丁醇∶冰乙酸∶水(體積比6∶1∶1)，且含3 g/L茚三酮；發色溫度90 ℃。

GABA定量檢測：參照文獻[29]采用HPLC進行測定。取100 μL標準溶液或樣品液注入1.5 mL的錐形離心管，加入50 μL乙腈-水-三乙胺-PITC(體積比7∶1∶1∶1)，混勻，室溫放置1 h，加入150 μL流動相A-流動相B(體積比80∶20)，旋渦混合器振蕩1 min，然后加入600 μL正己烷，旋渦混合器振蕩1 min，最后靜置10 min。用注射器吸取下層溶液，經0.22 μm濾膜過濾備測。HPLC色譜條件為：色譜柱ZORBAX Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長254 nm；進樣量20 μL，柱溫25℃；采用流動相A與流動相B(體積比80∶20)以0.6 mL/min線性等梯度洗脫。流動相A：pH 5.6、0.1 mol/L乙酸鹽緩沖液，1 L緩沖液中分別含三乙胺0.5 mL、乙酸0.7 mL和乙腈 5.0 mL。流動相B：體積分數為60%的乙腈溶液。

RAC-CBD-GAD活力單位定義為：測定條件下1 min生成1 μmol GABA所需要的酶量為1個酶活單位(U)。以單位質量RAC-CBD-GAD所具有的GAD活力表示(U/g)。

1.3.2.6 重組E.coliGDMCC 60445的穩定性

吸取-25 ℃甘油保藏的菌種1 mL，轉接于不含氨芐青霉素的LB培養基，37 ℃、120 r/min振蕩培養12 h，再吸取1 mL培養液，轉接于不含氨芐青霉素的LB培養基，37 ℃、120 r/min振蕩培養12 h，重復轉接5次，然后吸取2 mL接入120 mL不含氨芐青霉素的LB培養基，37 ℃、120 r/min振蕩培養24 h。收集細胞，制備RAC-CBD-GAD并測定其活性。以含0.1 mg/mL氨芐青霉素的LB培養基按照同樣操作收集的細胞作為對照。

1.3.3 CBD-GAD融合酶的純化

按RAC與CBD-GAD粗酶液的質量體積比為1∶20的比例按上述方法進行固定化，將固定化酶RAC-CBD-GAD用pH 8.0、50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液充分洗滌，然后將每1 g RAC-CBD-GAD與20 mL乙二醇混合，靜置脫吸附10 min，濾出酶液，將酶液用超濾管以3 000 r/min進行離心超濾，再通過多次加入生理鹽水、離心超濾的循環操作去除乙二醇，即可獲得基本不含乙二醇的CBD-GAD酶液。參照SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒說明書，采用SDS-PAGE電泳鑒定CBD-GAD，濃縮膠質量濃度5%，分離膠質量濃度8%，膠厚1.0 mm。蛋白質濃度參照Bradford法蛋白濃度測定試劑盒說明書進行測定。

1.3.4 CBD-GAD純酶的酶學性質研究

1.3.4.1 CBD-GAD活性測定方法

除特別說明外，CBD-GAD活性測定條件為：取1.5 mL pH 4.8、0.25 mol/LL-Glu溶液(溶于0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液，含0.2 mmol/L PLP)，加入1.5 mL CBD-GAD純酶，40 ℃水浴反應30 min，加入4 mL無水乙醇，混勻、終止反應，8 500 r/min離心15 min，取上清液適當稀釋后采用HPLC測定GABA含量。CBD-GAD活力單位定義為：測定條件下1 min生成1 μmol GABA所需要的酶量為1個酶活單位(U)。除對照組平均CBD-GAD活力為100%外，未設置對照組的實驗以活力最高的實驗組平均CBD-GAD活力為100%計算相對酶活(%)。

1.3.4.2 pH對CBD-GAD的影響

pH對CBD-GAD反應活性的影響：分別以pH 4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2和5.4的0.25 mol/LL-Glu溶液(溶于0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液，含0.2 mmol/L PLP)作為底物進行酶活測定。

pH對CBD-GAD穩定性的影響：將CBD-GAD酶液分別與pH 3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6 的0.05 mol/L乙酸鹽緩沖液按體積比1∶1混合，于40 ℃保溫5 h，然后對處理后的CBD-GAD酶液進行酶活測定。

1.3.4.3 溫度對CBD-GAD的影響

溫度對CBD-GAD反應活性的影響：分別在40、45、50、55、60、65和70 ℃下進行酶活測定。

溫度對CBD-GAD穩定性的影響：將CBD-GAD酶液與pH 4.8、0.05 mol/L乙酸鹽緩沖液按體積比1∶1混合，分別于-25、-20、-7、4、40、50、60和70 ℃保溫3 h，然后室溫下放置1 h，再取處理后的CBD-GAD酶液進行酶活測定。以4 ℃處理組為對照。

1.3.4.4 CBD-GAD底物特異性

分別取pH 4.8的0.25 mol/LL-Glu、D-Glu、L-Asp溶液1.5 mL，加入0.5 mL CBD-GAD酶液，快速混勻，于40 ℃水浴反應2 h，然后100 ℃保溫10 min終止酶活，4 ℃、8500 r/min離心15 min，用HPLC測定L-Glu、D-Glu、L-Asp含量，測定方法參照上述HPLC測定GABA的方法。以121 ℃滅活10 min的CBD-GAD酶液進行同樣操作作為對照。

以底物濃度的平均變化率[(實驗組濃度-對照組濃度)/對照組濃度×100%]對反應活性進行比較。根據試驗過程存在系統誤差，將底物的平均變化率絕對值≤5%判定為陰性(-)，變化率絕對值>5%判定為陽性(+)。

1.3.4.5 CBD-GAD動力學常數

分別以pH 4.8的0.4、0.8、1.2、2.4、3.6、4.8、6.4、9.6、12.8、19.2、25.6、51.2、76.8、89.6、102.4、128、153.6、204.8 mmol/LL-Glu溶液作為底物進行酶活測定，選擇呈一級反應關系的底物濃度和反應速度，采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法計算GAD的Km和Vmax。

1.3.4.6 GABA對CBD-GAD活性的影響

以含0.1 mol/L GABA的0.25 mol/LL-Glu混合溶液為底物進行酶活測定，同時以不含GABA的0.25 mol/LL-Glu溶液作為對照。

1.4 數據分析

所有實驗均為3個平行，結果以“平均值±標準偏差”表示。采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件以獨立樣本t檢驗進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 E.faecium CBD-GAD重組大腸桿菌的構建

2.1.1gadB基因克隆

以E.faeciumGDMCC 60203的基因組DNA為模板，擴增出的產物為大小1.4 kb(圖1)。測序結果表明，該基因與Enterococcussp. JK29的gadB基因(1 401 bp，GenBank登錄號：KM649684)100%一致。

M-Marker；1-PCR產物圖1 PCR擴增E. faecium GDMCC 60203 gadB基因的電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of gadB gene by PCRamplified from E. faecium GDMCC 60203

2.1.2 CBD-GAD融合酶表達載體及重組大腸桿菌的構建

將E.faeciumGDMCC 60203的gadB基因與pRPOCB線性化載體拼接后，得到pRPOCB-EfagadB重組質粒(圖2)，該重組質粒包含了脅迫誘導型啟動子PrpoS、E.coli中 5′-非翻譯區和來自編碼C.thermocellum家族3纖維素結合域的序列cbm3和E.faeciumLNSF2 GAD的基因gadB。從序列推斷，用BamH I、EcoR I雙酶切重組質粒，應切出3 723 bp、1 407 bp兩條帶，對酶切產物進行電泳，電泳結果(圖3)與理論推斷一致，表明重組質粒pRPOCB-EfagadB構建成功。

將pRPOCB-EfagadB重組質粒轉化E.coliDH5α，獲得了攜帶CBD-GAD融合酶表達載體的重組E.coliGDMCC 60445。

2.1.3 CBD-GAD融合酶的表達

RAC對CBD具有特異性吸附性能，采用RAC對E.coliGDMCC 60445的CBD-GAD進行吸附固定化，避免了E.coli自身基因組所表達的GAD的影響。經采用TLC對RAC-CBD-GAD的轉化產物進行檢測，圖4顯示存在與GABA標準品遷移率一致的斑點，HPLC定量分析表明RAC-CBD-GAD活力為(349.54±33.47) U/g，結果表明E.coliGDMCC 60445可高效表達具有GAD催化活性的CBD-GAD。

圖2 表達載體pRPOCB-EfagadB示意圖Fig.2 Map of the expression vector pRPOCB-EfagadB

M-Marker；1-pRPOCB-EfagadB的BamH I和EcoR I酶切產物圖3 pRPOCB-EfagadB酶切產物電泳圖Fig.3 Electrophoretic map of the digestion products ofpRPOCB-EfagadB

1- GABA標準品;2-RAC-CBD-GAD轉化反應液;3-L-Glu標準品圖4 RAC-CBD-GAD轉化液薄層層析圖譜Fig.4 Thin-layer chromatography of the conversionliquid of RAC-CBD-GAD

2.1.4 重組E.coliGDMCC 60445的穩定性

對含氨芐青霉素抗性標記的重組菌，通常需要在培養基中添加氨芐青霉素以防止重組菌丟失質粒。然而，氨芐青霉素價格昂貴，安全性差，工業應用成本高、風險大。經對E.coliGDMCC 60445穩定性進行測試，實驗組RAC-CBD-GAD活力為(347.93±27.63) U/g，與對照組(329.29±10.37) U/g無顯著性差異(P>0.05)。結果表明，連續轉接培養5批次，E.coliGDMCC60445性能穩定，未受氨芐青霉素影響。

2.2 CBD-GAD融合酶的純化

由于RAC對CBD具有特異性吸附性能，因此只需對RAC-CBD-GAD充分洗滌以去除未吸附的雜蛋白，然后采用乙二醇進行脫吸附處理，即可實現CBD-GAD純化。圖5顯示，純化后的CBD-GAD酶液在SDS-PAGE電泳圖上呈現單一蛋白質條帶，說明CBD-GAD已經達到了電泳純。CBD-GAD純酶的比酶活為(50.57±4.44) U/mg。

1-蛋白質Marker;2-CBD-GAD粗酶液;3，4-脫吸附CBD-GAD圖5 CBD-GAD融合酶的SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE electrophorogram of fusion enzymeCBD-GAD

根據電泳分離膠的濃度和蛋白質Marker分子量分布情況，選擇SDS-PAGE電泳分子量分布較均勻的條帶(15～100 kDa)的相對遷移距離與蛋白質分子量標準的對數值繪制標準曲線(圖6)，由曲線計算可知CBD-GAD的相對分子量為74.02 kDa，與CBD-GAD理論分子量71.52 kDa基本相符。電泳結果也表明CBD-GAD融合酶在E.coliGDMCC 60445中獲得成功表達。

圖6 SDS-PAGE測定GAD分子量Fig.6 Molecular weight of GAD on SDS-PAGE

2.3 CBD-GAD純酶的酶學性質

2.3.1 pH對CBD-GAD的影響

圖7-a顯示，當反應pH小于4.6，CBD-GAD活力隨pH增加而增強；當反應pH為4.6，CBD-GAD活力最強；當反應pH大于4.6， CBD-GAD活力隨反應pH增加而逐漸下降，但在pH 4.6～5.2范圍內下降較為平緩，CBD-GAD活力差異不顯著(P>0.05)。結果表明，CBD-GAD在pH 4.6～5.2可保持90%以上的活性，適宜反應pH范圍較寬，最適反應pH值為4.6。從圖7-b可見，pH值小于4.8，CBD-GAD隨pH降低失活越嚴重，在pH 4.8～5.6相對較穩定，40 ℃保溫5 h仍可保持90%以上活力，在pH 4.8最穩定。

a-pH對CBD-GAD催化反應活性的影響；b-pH對CBD-GAD穩定性的影響圖7 pH對CBD-GAD的影響Fig.7 Effect of pH on CBD-GAD

楊勝遠等[30]對E.faeciumGAD天然酶純酶的酶學性質研究表明，GAD最適反應pH為5.0，當pH偏離最適反應pH時，GAD活力快速下降，維持75%以上活力的pH范圍僅為4.8～5.2。由此可見，融合CBD后，在pH對GAD催化活性影響方面發生了較大變化。

2.3.2 溫度對CBD-GAD的影響

如圖8-a所示，CBD-GAD的最適反應溫度為60 ℃，在55～60 ℃范圍可保持90%以上的CBD-GAD酶活；當溫度高于65 ℃，酶活快速下降。圖8-b顯示，CBD-GAD在4～40 ℃相對較穩定，經pH 4.8、0.05 mol/L乙酸鹽緩沖液處理3 h后，仍可保持95%以上的酶活；冰凍處理(低于-7 ℃)和高于50 ℃處理對CBD-GAD穩定性影響較大，酶活損失較大，當溫度達到70 ℃，CBD-GAD基本完全失活。

a-溫度對CBD-GAD催化反應活性的影響；b-溫度對CBD-GAD穩定性的影響圖8 溫度對CBD-GAD的影響Fig.8 Effect of temperature on CBD-GAD

2.3.3 CBD-GAD底物特異性

由表1可見，CBD-GAD僅對L-Glu具有催化活性，對僅有一個-CH2差異的L-Asp和僅具有立體結構差異的D-Glu均無催化活性。結果表明CBD-GAD具有很強的底物專一性。

表1 CBD-GAD對不同氨基酸的催化反應活性Table 1 Catalytic activity of CBD-GAD for different amino acids

注：“+”為具有催化活性；“-”為不具有催化活性。

2.3.4 CBD-GAD動力學常數

從圖9可知，L-Glu濃度低于12.8 mmol/L時，反應呈一級反應；L-Glu濃度在12.8～76.8 mmol/L范圍內，反應呈混合級反應；L-Glu濃度高于76.8 mmol/L，反應呈零級反應；CBD-GAD催化反應沒有底物抑制現象。結果表明，CBD-GAD催化反應符合Michaelis-Menten的快速平衡學說。根據圖10計算CBD-GAD的Km和Vmax分別為10.58 mmol/L和3.83 μmol/(mL·min)。

圖9 L-Glu濃度對CBD-GAD催化反應速度的影響Fig.9 Effect of L-Glu concentration on the catalyticreaction rate of CBD-GAD

圖10 CBD-GAD動力學常數Lineweaver-Burk圖Fig.10 Lineweaver-Burk plot of the kinetic constantsof CBD-GAD

2.3.5 GABA對CBD-GAD活性的影響

由圖11可知，初始L-Glu底物溶液中添加 0.1 mol/L GABA的實驗組與不含GABA的對照組的CBD-GAD活性無顯著性差異(P>0.05)，說明CBD-GAD催化活性無產物抑制現象。

圖11 GABA對CBD-GAD活性的影響Fig.11 Effects of GABA on CBD-GAD activity

3 討論

本實驗通過以PrpoS作為啟動子，成功構建了可高效表達CBD-GAD的E.coliGDMCC 60445，該重組菌株在無氨芐青霉素LB培養基中性能穩定。構建的CBD-GAD對RAC親和性強，只經RAC一步純化即可獲得電泳純化CBD-GAD。與GAD天然酶相比， CBD-GAD對pH的依賴性得到了較大改善，酶的催化專一性未受影響，催化反應不受底物和產物抑制，酶學性質優良。通過構建CBD-GAD融合酶，利用纖維素可快速實現GAD固定化和純化，方法簡便、成本低，具有很好的推廣價值。