氨基酸定點突變提高靈芝蛋白LZ-8 熱穩定性的研究

孫熙麟 蔣振彥 劉志屹 戴璐 孫非 黃偉

（1. 吉林大學藥學院，長春 130021；2. 吉林大學再生醫學科學研究所，長春 130021）

LZ-8（Lin Zhi-8）是從靈芝孢子中分離純化出來的一種具有免疫調節和抗腫瘤活性的同源二聚體蛋白質［1］，臨床前研究證實LZ-8 能夠有效抑制荷瘤小鼠體內肺癌和肝癌的生長［2-4］，具有極高的成藥潛質。目前，人們已經在畢赤酵母體內重組表達了具有生物學活性的LZ-8 分子，并實現了LZ-8 分子中試規模的表達和純化［5］。然而，在LZ-8生產過程中，由于機械破碎、攪拌、錯流式膜過濾等操作的存在，不可避免造成蛋白質溶液局部升溫，引發蛋白質解折疊乃至變性，嚴重影響了最終產物的效價和均質性。因此，提高LZ-8 分子熱穩定性，對于生產出質量可靠，適用于臨床新藥申報的LZ-8 分子，具有重要現實意義。

隨機或定點突變是改善蛋白質熱穩定性的常規方法，它們的基本原理都是使用新的氨基酸取代蛋白質特定位置氨基酸，通過改變蛋白質內部相互作用進而增強蛋白質穩定性［6-7］。隨機突變需要構建大量隨機突變體，再根據突變體的熱穩定性狀況，篩選出熱穩定性改善的突變體［8］。而定點突變是基于蛋白質結構和功能關系，通過理性計算和分析待突變氨基酸位點，再通過定點或定點飽和突變技術改造蛋白的一種方法［9-12］。基于理性計算的定點突變技術在改善蛋白質熱穩定性方面有著廣泛應用，在脂肪酶Lipase5、米根霉α-淀粉酶、胰蛋白酶等［13-15］分子上均有成功實例。因此，本項研究將選用基于理性計算的定點突變技術改善靈芝免疫調節蛋白LZ-8 的熱穩性。

1 材料與方法

1.1 材料

LZ-8 蛋白質原液由長春鉆智制藥有限公司提供，純度≥99.0%；畢赤酵母X33 菌株和pGAPZα-LZ-8 質粒為本實驗室自行保存樣本；Muta-directTM定點突變試劑盒購自于北京賽百盛基因技術有限公司；胎牛血清（Bioin，以色列）、MEM 培養基（BI，以色列）購自于上海逍鵬生物科技有限公司；WST-1 試劑盒購自于日本同仁化學研究所。

1.2 方法

1.2.1 軟件及數據分析 從RCSB 網站（http：//www.rcsb.org/）下載LZ-8 晶體結構文件3F3H.pdb，采用分子動力學計算軟件NAMD（Version 2.9）模擬升溫過程中LZ-8 全原子運動軌跡，具體參數：（1）模擬體系構建：采用CHARMM 力場，選用TIP3P 八面體水分子盒模型，將蛋白質分子置于10 ? 的水溶劑箱內，加入Na+平衡電荷；（2）能量最小化：用sander 模塊進行3000 步能量最小化，執行最陡下降法500 步后轉位共軛梯度法，以消除不合理的能量勢壘；（3）加熱：對系統加熱使其從0 K 升溫至303 K、313 K 和323 K，并在保持體積不變的狀態下運行50 ps 帶有位置限制的動力學，將非鍵相互作用閾值設為8 ?，使用弱耦合的算法來控制溫度；（4）平衡：在常壓條件下系統分別處在303 K、313 K 和323 K條件下，進行500 ps 的分子動力學模擬，以平衡系統；（5）動力學模擬：恒溫恒壓系統下進行分子動力學模擬，所用步長為2 fs，以每1000 步采集一次能量與坐標信息。分析動力學模擬過程中結構的均方根偏差值（Root mean square deviation，RMSD），再選擇RMSD 值平衡階段的數據，計算每個氨基酸的均方根漲落值（Root mean square fluctuation，RMSF），形成軌跡文件，最后通過VMD 軟件分析該模擬軌跡，計算不同環境溫度下LZ-8 分子的穩態構象。將LZ-8晶體結構文件3F3H.pdb 輸入到軟件PyMOL（Version 2.3）中，根據氨基酸殘基B-Factor 數值的不同，以不同顏色標示各氨基酸殘基，藍色表示該氨基酸穩定性最高，紅色表示穩定性最差。

1.2.2 LZ-8 分子定點突變 以本實驗室已構建質粒pGAPZα-LZ-8 為模板，采用PCR 法對LZ-8 的核酸序列進行F8W 和R9K 雙位點突變。設計PCR 點突變 引 物：M-f（5′- TCCGACACCGCTTTGATATGGAA GTTGGCATGGGAC-3′）和M-r（5′-GTCCCATGCCAA CTTCCATATCAAAGCGGTGTCGGA-3′），按 照MutadirectTM定點突變試劑盒的操作說明，使用MutadirectTM酶對模板質粒進行全長PCR，MutazymeTM酶再消化模板質粒，剩余PCR 擴增的全長突變質粒轉化DH5α 感受態細胞，挑取若干克隆，小量提取質粒測序，將測序正確的突變質粒擴增后，按照文獻［16］報道的方法，轉化酵母X33 菌株，再進行LZ-8 突變體蛋白質的表達和純化。

1.2.3 HeLa 細胞生長抑制實驗 用含10%胎牛血清的MEM 培養基對本實驗室凍存的HeLa 細胞株進行常規復蘇和傳代培養，按照1×104個/孔的細胞密度接種96 孔板，待細胞貼壁后，加入含2%胎牛血清MEM 培養基倍比稀釋的LZ-8 或LZ-8 突變體，每個蛋白質濃度設置3 個復孔，37℃、5% CO2條件下培養24 h 后，選用WST-1 試劑測定細胞活力，450 nm 波長處讀取吸光度，取復孔均值，應用Prism（Version 6.0）軟件計算LZ-8 及LZ-8 突變體抑制HeLa 細胞生長的IC50值。

1.2.4 樣品熱力學參數測定 差示量熱掃描分析儀MicroCal VP-DSC（通用電氣醫療，美國）測定LZ-8和LZ-8 突變體相變溫度Tm和相轉變焓值ΔH，實驗參數：LZ-8 或LZ-8突變體樣品溶于0.01 M PBS緩沖液（pH7.2-7.4），終濃度1 mg/mL，進樣體積500 μL，加熱范圍25-55℃，加熱速度1℃/min。采集原始數據，應用Origin 軟件分析樣品各熱力學參數。

1.2.5 統計分析 計量資料以x-±s表示，采用t檢驗進行組間比較。

2 結果

2.1 分子動力學軟件模擬不同溫度下LZ-8穩態構象

采用NAMD 軟件計算系統溫度從0 K 升高至303 K（30℃）、313 K（40℃）和323 K（50℃）時LZ-8 單體全原子運動軌跡，VMD 軟件模擬出LZ-8單體在30℃、40℃和50℃三個溫度下的穩態構象（圖1）。在系統不斷升溫過程中，LZ-8 分子N-端α螺旋結構變得不再穩定，當系統溫度上升到323 K（50℃）時，α 螺旋不但出現解螺旋，還發生顯著空間位移，提示N-端α 螺旋為LZ-8 分子的溫度敏感區域。

圖1 不同溫度下LZ-8 的穩態構象

2.2 溫度因子B-factor預測LZ-8上熱敏感的氨基酸位點

溫度因子B-factor 常被用于反映氨基酸殘基在蛋白質中的構象狀態，B-factor 數值越高，模糊度越大，相應部位的構象就越不穩定或柔性越強。PyMOL 軟件根據B-factor 的不同，對氨基酸殘基進行色彩標記。隨著B-factor 數值逐漸增大，標記顏色逐漸由藍色、綠色、黃色轉變至橙色和紅色。根據溫度因子B-factor的預測，LZ-8 存在3 組溫度敏感位點（圖2），它們分別是：（1）N-端α 螺旋上第8 和第9 位氨基酸；（2）β4 片層和β5 片層之間LOOP 環上第63-71 位氨基酸；（3）β7 片層上的第103 和104 位氨基酸。其中，N-端α 螺旋是B-factor 和NAMD 分子模擬預測的共同溫度敏感區域，于是我們將待突變氨基酸位點定位到這一區域。

圖2 B-factor 預測LZ-8 的溫度敏感區域

2.3 LZ-8突變位點的選擇和設計

如圖2 所示，在LZ-8 分子N-端α 螺旋上，第8 位和第9 位氨基酸殘基B-factor 數值高于其它位置氨基酸殘基，推測它們比其它氨基酸殘基對溫度更為敏感，于是，選擇第8 位和第9 位氨基酸殘基進行雙位點突變。已知，LZ-8 分子N-端α 螺旋結構的完整性對維持LZ-8 生物學活性至關重要，兩個LZ-8 單體分子通過各自N-端α 螺旋交互作用，形成有活性的二聚體分子，當N 端α 螺旋結構破壞或喪失時，LZ-8 生物學活性消失［17］。為確保LZ-8 雙位點突變后N-端α 螺旋結構保持不變，于是按照氨基酸殘基極性相同，結構相似的原則，將第8 位苯丙氨酸（F）替換為色氨酸（W），將第9 位精氨基酸（R）替換為賴氨酸（K）（圖3）。

圖3 LZ-8 氨基酸雙位點突變示意圖

2.4 LZ-8及LZ-8突變體抑制HeLa細胞生長

LZ-8 具有抑制腫瘤細胞生長的活性，為檢測LZ-8 突變體是否保留了原LZ-8 分子的生物學活性，我們對LZ-8 和LZ-8 突變體同時進行了HeLa 細胞的生長抑制實驗，結果（圖4）顯示，LZ-8 突變體與LZ-8 具有一致的抑制腫瘤生長活性，兩者作用HeLa 細胞24 h 的IC50值分別為2.407 μg/mL 和2.238 μg/mL，表明氨基酸F8W 和R9K 雙位點突變沒有對LZ-8 結構和生物學活性產生顯著影響。

圖4 LZ-8 及LZ-8 突變體對HeLa 細胞的生長抑制曲線（n=3）

2.5 LZ-8突變前后的熱力學參數

差示掃描量熱法通過測量以恒定速率加熱時與分子熱變性相關的熱能改變來表征分子的熱穩定性。相變溫度Tm和相轉變焓值ΔH是表征分子穩定性的兩個重要參數，Tm值越大，表示蛋白質分子解折疊的溫度越高，ΔH值越大，表示蛋白質分子解折疊的能壘越高，蛋白質分子越穩定。LZ-8 在生產及使用時均以溶液的形式存在，因此，我們應用差示掃描量熱法對溶于PBS 緩沖液的LZ-8 和LZ-8 突變體進行了熱力學參數分析（表1）。結果顯示，LZ-8突變體較LZ-8 相變溫度Tm上升0.92℃，相轉變焓值ΔH提高23.14 kJ/mol，兩者均顯示出統計學差異，因此，氨基酸F8W 和R9K 的雙位點突變改善了LZ-8 的熱穩定性。

表1 LZ-8 及LZ-8 突變體的熱力學參數（n=3，x-±s）

3 討論

蛋白質熱穩定性一直是制藥業和酶工程領域研究熱點所在，目前，蛋白質理性設計被廣泛用于提高蛋白質的熱穩定性［18-20］。根據提高蛋白質熱穩定性機制不同，蛋白質理性設計可采用如下幾種實施策略，如同源比對策略［21］、脯氨酸效應設計策略［22］、SCHEMA 模擬法［23］和溫度因子設計策略［24］等。為精確定位LZ-8 溫度敏感氨基酸位點，該項目選擇了分子動力學模擬和溫度因子預測兩種實施策略相結合的方法，進行待突變氨基酸位點的選擇和設計。文中分子動力學模擬了LZ-8 在3 個溫度節點下的穩態構象，通過觀測整體構象在升溫過程中的動態變化來明確了LZ-8 分子溫度敏感區域，即N-端α 螺旋，再在該區域內借助溫度因子B-factor 進一步確定溫度敏感氨基酸位點。這與其它應用分子動力學模擬直接預測溫度敏感氨基酸位點的同類研究不同，其它研究多使用單一溫度下模擬的分子穩態運動軌跡，計算被研究分子每個氨基酸的RMSF 值，再根據RMSF 值的大小判斷氨基酸構象的穩定性，這一算法通常會得到數量較多的候選突變位點，還需結合分子已有結構和功能數據進一步縮小候選突變位點范圍［13］。因此，在結構和功能數據不夠完善的情況下，使用本文的“兩步走”策略更為適宜。

明確氨基酸突變位點后，需要選擇適宜的氨基酸對其進行替換。定點飽和突變是選擇適宜突變氨基酸的方法之一，在該方法中研究人員需要針對待突變氨基酸構建由其它19 種氨基酸分別取代的突變體文庫，再根據蛋白質性能指標對文庫內蛋白質進行目標篩選［25］。雖然該技術在富馬酸酶、脂肪酶/酯酶、細菌肽酶等［26-28］分子中成功實現了分子性能改善，但實驗耗費的人力和物力仍是實際工作中需慎重考慮的因素。此外，研究人員還可以通過蛋白質虛擬飽和突變軟件對目標突變體進行篩選，但該方法需要專門的軟件，并且軟件算法和參數設置不同，計算結果存在一定差異。本研究采用類似氨基酸策略，在LZ-8 的N-端α 螺旋內，選取與待突變氨基酸：第8 位苯丙氨酸和第9 位精氨酸，極性相同、結構類似的色氨酸（F8W）和賴氨酸（R9K）進行氨基酸替換，獲得了溫度穩定性提高LZ-8 突變體。較比苯丙氨酸和精氨酸，色氨酸的強疏水性，以及賴氨酸的高穩定性是新突變體熱穩定提高的潛在原因。誠然，在本研究中沒有構建F8W 和R9K 單獨突變的突變體，因此尚無法從實驗角度判別F8W 和R9K 各自給LZ-8 熱穩定性帶來的影響，這部分工作有待后續實驗進一步證實。

4 結論

分子動力學模擬和B-factor 因子的聯合預測能夠有效定位LZ-8 分子的溫度敏感區域。按照氨基酸極性相同，結構相似的原則，對LZ-8 分子N-端α螺旋進行的F8W 和R9K 雙位點突變，在保證LZ-8突變前后N-端α 螺旋結構及抗腫瘤生物學活性不變的前提下，有效提高了LZ-8 分子熱穩定性，有利于LZ-8 的生產、運輸和存儲。