C 類花器官特征基因AGAMOUS（AG）調控植物花分生組織維持與終止研究進展

位明明 曾霞 安澤偉 胡彥師 黃肖 李維國

（中國熱帶農業科學院橡膠研究所 國家橡膠樹育種中心 農業部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海口 571101）

花器官發育是指植物花原基發育為成熟的花器官過程，即花原基發育成花萼、花瓣、雄蕊和心皮等4 輪結構的過程，該過程是一個多階段的發育過程，起始于花分生組織的啟動，接著是花分生組織特征的決定和維持、花原基形成、花器官特征識別，以及花分生組織干細胞活性終止和花器官成熟。花發育作為高等植物世代交替中最引人注目的生理過程，一直以來都是植物遺傳學研究領域跟蹤的熱點之一。了解植物成花調控過程，可以人為控制植物開花時間，加快選育種進程。

關于植物花器官發育理論最經典的莫過于Coen 等［1］提出的花器官發育“ABC”模型，以及Theissen 等［2］進一步完善提出的花器官發育“ABCDE”模型。植物花器官發育“ABCDE”模型認為花原基發育成具有四輪結構的花器官過程是由A、B、C、D 和E 這5 類花器官特征基因控制，其中A 類基因控制萼片和花瓣的發育；B 類基因控制雄蕊和花瓣的發育；C 類基因控制心皮和雄蕊的發育；D 類基因控制胚珠的發育；E 類基因與其他4類基因協同調節花器官發育過程，參與所有花器官結構的形成。

進一步研究發現在植物花器官發育5 類特征基因中，除A 類基因中的AP2 以外，其余花器官特性基因幾乎都屬于MADS-box基因家族［3］。鑒于被子植物在進化過程中DNA 片段或全基因組重復已獨立發生了多次，且不同物種中MADS-box基因的拷貝數存在較大差異，導致許多平行同源基因發生了亞功能化［4］。因此，MADS-box基因家族最顯著的特征是在不同植物花發育過程中其家族成員之間的作用差異較大。前人通過對不同物種中MADS-box基因家族的功能進行比較分析發現，在不同植物開花時間控制、花分生組織維持、花器官決定、輪裂區形成、果實成熟、胚胎發育及營養器官發育等方面MADS-box基因家族成員具有不同的調控功能［5-7］。如MIKCc型MADS-box基因家族成 員SOC1（SUPPRESSOR OF OVERESPRESSION OF CONSTANS1）、FLC1（FLOWERING LOCUS C）、AGL24（AGAMOUS-LIKE GENE 24）、MAF1/FLM（MADS AFFECTING FLOWERING） 及SVP（SHORT VEGETATIVE PHASE）基因在植物開花調控中起重要作用［8-10］；AP1（APETALA 1）、FUL（FRUITFUL）及CAL（CAULIFLOWER）基因在花分生組織決定 中 起 重 要 調 控 功 能［11］；SEP1-3（SEPALLATA 1-3）、AP3（APETALA 3） 及PI（PISTILLATA） 基因在花器官形成中具有重要調控作用［12］；TT16（TRANSPARENT TESTA16）基因在種子色素沉積與胚胎發育方面具有重要調節作用［13-14］。總之，在植物花發育及生殖發育過程中不同MADS-box基因家族之間通過相互作用，從而構成一個復雜的基因表達調控網絡來系統調控從花原基分化到花器官形成的整個生殖發育過程。

在調控植物花器官發育的5 類特征基因中，近年來諸多研究表明C 類功能基因AGAMOUS（AG）在花器官發育中扮演著重要的角色，它們在植物花發育和干細胞維持及終止發育過程的基因調控網絡中具有核心功能。本文綜述了近年來AG 基因在植物花發育中的核心功能、AG基因與其他遺傳因子相互作用的反饋調節途徑、尤其是AG 基因家族、表觀遺傳因子（MicroRNAs，miRNAs），以及其他調控因子之間相互作用調控花器官分化的基因調控網絡的結構和功能，旨在為進一步認識植物花發育及干細胞調控提供文獻依據。

1 植物花分生組織的維持和終止調控

一般來說植物花發育過程可分為開花決定、花的發端和花器官發育3 個階段。開花決定作為植物營養生長向生殖發育轉變的起始過程，首先要經歷頂端花芽向花序分生組織的轉變，接著由花分生組織分化出花器官。花器官作為被子植物特有的生殖器官，由4 種不同類型的花器官構成，即萼片、花瓣、雄蕊和心皮，這些花器官由花分生組織發育而來，而每一個花分生組織的中心區域都含有少數多能干細胞和未分化的干細胞［15］。

在開花決定階段，花分生組織在其側面的外周區域產生花原基，通過調節花原基中干細胞的數量和位置來確保花分生組織的穩定性，并允許干細胞在花器官發生前不斷積累［16］。為形成適當數目的花器官，花分生組織不僅要維持一定的干細胞活性，其干細胞增殖率還必須與花器官形成率相協調［17］，即花分生組織在發育過程中表現一定的動態平衡。花分生組織的這種動態平衡是由花分生組織終止調控程序所決定。如果花分生組織終止過早，干細胞就無法產生準確數目的花器官；相反，延遲或無花分生組織終止調控過程會導致植物生殖器官的衰竭和雄性不育［18］。因此，花分生組織終止調控對于下一代的物質分配至關重要。

然而，與莖尖分生組織發育過程存在明顯不同的是，花分生組織在細胞增殖與花器官起始過程中不僅表現出一個動態平衡，而且在花器官發育的某一特定階段，花分生組織的遺傳調控程序還必須被終止［19-20］，隨后花分生組織才能形成4 類不同的花器官。因此，在花發育及生殖發育過程中，花分生組織發育過程是被限定的，一旦花分生組織產生了所有的花器官原基，它就會在心皮發育過程中被消耗掉，干細胞活性就此終止［21］，這一精確的終止過程使得花分生組織形成諸如雌蕊的生殖器官［22-23］。如在雙子葉植物花器官發育的第6 階段，當不同雌蕊群沿花序軸內外側及近花序軸生長，導致花序軸中央凹陷區形成時，花分生組織的發育終止必須完成［24］。總之，在開花決定階段，花分生組織必須經歷平衡與拮抗這2 種連續發生的調節過程：即生殖細胞的自我更新以維持其增殖活性；花分生組織的維持和終止，以及對外周細胞的招募以形成花器官［25-26］。成功的花分生組織決定能夠確保植物正常的生殖發育和生命周期進程。因此，花分生組織的維持和終止在植物器官發生和世代交替中起著至關重要的作用。

2 C 類花器官特征基因AGAMOUS（AG）調控植物花發育研究進展

2.1 C類花器官特征基因AGAMOUS（AG）的結構、種類及表達特征

AG 基因屬于MADs-box 基因家族，其編碼的轉錄因子屬于一類 MADS 結構域家族蛋白，該基因序列從 5′端到 3′端依次可分為5 個區域：N 末端、M 區（編碼約57 個氨基酸的MADS-box 區）、I 區（Intervening region）、K 區及C 末端［27］，其中M 區高度保守，其編碼的MADS 蛋白結構域可以結合靶DNA；I 區和K 區相對保守，能夠調節蛋白質與蛋白質間的相互作用，是轉錄因子的結構特征序列；C末端則特異性較強，具有2 個相對保守的AG Ⅰ區和AG Ⅱ區［28］，是AG基因的標志性序列。

AG基因編碼的氨基酸序列屬于植物特有的MIKC 型C 類MADS-box基 因［29］。 在 花 器 官發育ABC 模型中，C 類功能基因可以分為AG 和PLE 兩個亞家族［30］。如在擬南芥基因組中，AG、SHATTERPROOF1（SHP1）、SHATTERPROOF2（SHP2）和SEEDSTICK（STK）4個基因屬于AG亞家族，其中SHP1和SHP2以前也被稱作AGAMOUS-LIKE 1（即AGL1）和AGAMOUS-LIKE 5（即AGL5），SKT 以前則被稱為AGAMOUS-LIKE 11（即AGL11）。系統發育學分析表明SHP1，SHP2和STK屬于AG進化系［31］，推測在數億年的進化過程中，AG 基因可能由于環境或其他偶然因素的改變導致其產生新的拷貝，使得AG 基因在后續的演化過程中產生功能分化，從而形成兩個具有特異功能的亞家族來共同承擔原C 類功能基因的功能。

目前已在諸多物種中克隆到AG同源基因。對不同物種中AG同源基因的時空表達模式和功能進行分析，結果顯示AG 同源基因的表達模式不僅具有一定的組織特異性，且功能相近。如OsMADS3和OsMADS58 作為水稻基因組中AG 同源基因的代表，兩者主要在花分生組織中特異表達，參與了水稻花分生組織決定過程［32］；RhAG 作為玫瑰中AG同源基因的代表，在雄蕊發育中顯著高調表達，沉默玫瑰中AG的同源物RhAG 可以導致其花瓣數量增加［33］，表明RhAG 與擬南芥中AG 的同源物一樣，主要參與雄蕊發育；楊樹中AG和STK基因的功能相對保守，沉默AG 和STK 的同源基因會改變其花器官特性，進而影響到楊樹花器官確定性、胚珠分化和種毛發育［34］。總之，盡管AG基因在裸子植物和被子植物分化之前就已出現，然而序列分析和基因表達特征表明，這些同源基因在序列特征上雖有一定差異，但功能相近，表明在數億年的進化過程中AG同源基因的功能相對保守。

2.2 C類花器官特征基因AG調控花分生組織維持及終止發育過程

在調控植物花發育過程的眾多MADS-box基因家族之間，諸多研究證實C 類花器官特征基因AGAMOUS（AG）在花分生組織干細胞活性的維持及終止調控中具有重要調控功能［35-36］。目前，在模式植物擬南芥中部分調控花分生組織發育終止的轉錄因子已被初步鑒定出來。前人研究發現植物C 類花器官特征基因AG 編碼的MADS 轉錄因子家族成員，在花分生組織發育的終止調控過程中，以及雄蕊與雌蕊的花器官決定中起著核心調控作用［37-38］。在花器官發育第6 階段，AG基因通過抑制分生組織維持關鍵基因WUSCHEL（WUS）的表達，以時空特異的方式關閉花序分生組織細胞維持程序。在早期花序分生組織發育過程中（花器官發育第3 階段）WUS基因的表達能夠激活AG基因的表達。當WUS基因的表達量開始下降時，AG基因處于活化狀態［39-40］。如在ag基因突變體植株中，WUS基因在花器官發育第6 階段后仍處于活躍表達狀態，而WUS基因的高調表達能夠誘導花分生組織發育過程產生不確定性，使得ag基因突變體植株在第4 輪花器官形成后其花序分生組織發育過程不被終止，花發育過程表現出不確定性，導致突變體植株的花器官出現一個只含萼片和花瓣，以及數量不確定的輪軸，產生“花嵌花”的表型［41-42］。

進一步研究發現AG基因在時空上抑制WUS基因的表達是由2 條不同的基因調控通路所控制，其一AG基因通過招募PCG 蛋白（Polycomb Group protein，PCG）對WUS基因位點進行必要的組蛋白H3K27 甲基化修飾；其二AG 基因在時空上抑制WUS基因的表達過程部分是通過對C2H2 鋅指蛋白KNUCKLES（KNU）基因的激活來實現［43］。如在knu突變體中，WUS基因在花器官發育第6 階段之后的雌蕊中仍然呈現出持續高調表達趨勢［44］。總之，前人研究表明AG基因能直接激活KNU基因的表達，該過程需要PcG 復合體的驅逐效應，導致細胞周期依賴的KNU基因誘導感應［45］，而對KNU基因激活的精確控制則有助于確定花分生組織終止的時間。

2.3 C類花器官特征基因AG與生長素協同調控花序分生組織終止與雌蕊形成過程

花分生組織終止及雌蕊形成過程中生長素動態平衡同樣起著至關重要的作用［46］。然而，與生長素動態平衡相關的基因通常在植物生長發育的各個階段都表達，這就要求在花器官發育過程中生長素的動態平衡必須以組織特異性或階段特異性的方式被精細調整。前人研究表明生長素的動態平衡有助于產生對于生長發育具有重要作用的生長素極大值。不僅已知的生長素載體PIN-FORMED 家族能夠影響生長素的極大值，而且其他一些跨膜蛋白也能夠影響生長素的極大值［47］。如TORNADO2（TRN2）基因編碼一個跨膜蛋白，該基因通常在柱頭中高調表達，導致柱頭中出現生長素極大值；而在trn2 功能缺失突變體中生長素的極大值卻出現在葉片中［48］，表現十分異常。

為了弄清AG基因與生長素動態平衡在花分生組織終止中的協同作用關系，前人對AG基因下游不依賴于KUN基因的花分生組織終止調控通路進行深入探究，揭示出一個花器官特征因子AG 與生長素動態平衡相關基因之間協同調控花分生組織終止與雌蕊發育的分子調控通路［49］。如在擬南芥花分生組織終止調控過程中，AG基因能夠直接激活其下游靶基因CRABS CLAW（CRC）的表達，而CRC基因能通過抑制TRN2基因的表達，在隨后的雌蕊形成過程中產生適當的生長素極大值，用以降低花分生組織活性，從而實現對花分生組織終止過程的精細調控。

進一步對AG基因下游靶基因CRC與KNU基因的功能進行深入分析，結果表明CRC與KNU基因的突變都能擾亂植物花分生組織發育的確定性。如前人對crc與knu基因的雙突變體植株表型進行鑒定，結果發現在crc與knu基因的雙突變體植株中花分生組織發育過程表現出強烈的不確定性［50］，而crc基因突變體植株的部分表型能被生長素運輸抑制劑所恢復［47］，表明CRC與KNU這2 個關鍵基因在花分生組織終止及雌蕊發育中具有重要調控功能。此外，在其他多種被子植物crc 同源基因突變體植株中，花序分生組織的發育過程同樣都表現出強烈的不確定性［51］，表明在植物進化過程中CRC基因可能具有保守的、普遍存在的功能。

總之，前人研究證實花器官特征因子AG及其靶基因CRC與KNU能夠協同調控植物花分生組織的終止過程。在該過程中AG基因的2 個靶基因CRC與KUN能夠協同調控并抑制WUS 基因的表達，而CRC基因則能通過抑制TRN2基因的表達來控制花分生組織的確定性。因此，AG-WUS 與AG-KUNWUS 調控通路可能在確定花分生組織的終止時間方面起著核心作用［52］。進一步研究發現由這兩個非同源基因觸發的協同效應被認為是由多個或不同的調控通路中斷引起的［53］。

2.4 C類花器官特征基因AGAMOUS（AG）與表觀遺傳因子協同調控花分生組織終止與雌蕊形成過程

開花決定和干細胞活性，以及花分生組織的維持和終止過程亦受到不同類型的花器官同源蛋白基因及表觀遺傳因子之間的協同調控。在開花決定、花分生組織維持及終止調控過程中染色質重塑因子可以通過與特定目標基因的關聯和結合，實現花器官特征基因的時空特異性表達。前人研究發現動植物中普遍存在的多梳蛋白抑制復合物PRC2（Polycomb Repressive Complex 2，PRC2）能通過介導染色體H3K27 三甲基化（H3K27me3）形成異染色質，從而抑制基因表達，在基因的組織特異性表達中起關鍵作用［54］。PRC2、CURLY LEAF（CLF）、及Swinger（SWN）基因作為植物中已知的主要甲基轉移酶［55］，能夠催化染色體的H3K27me3 水平，且PRC2 留下的抑制性H3K27me3 標記能被PRC1 識別，后者可以單泛素化組蛋白H2A［56］，從而抑制基因表達。

前人研究證實AG基因的組織特異性表達亦受到CLF基因的抑制，CLF 可能形成一種類似于PRC2 的復合物（CLF-PRC2）來抑制AG基因在營養器官中的表達。與此觀點一致的是，在擬南芥整個葉片發育過程中AG基因座都攜帶彌散的H3K27me3位點［57］。在AG 基因組織特異性表達過程中，一方面PRC2 可能直接或間接地作用于基因組位點；另一方面PRC2 可能通過與其他DNA 結合蛋白的相互作用來識別靶基因位點，如AG 基因可以與WUS 基因位點的CArG 盒相結合，從而招募PRC2 和AS1-AS2 異二聚體來促進PRC2 與BP 和KNAT2基因的結合［58］。進一步對AG基因組織特異性表達所需的DNA 序列進行分析，結果顯示AG基因本身的啟動子不足以賦予其組織特異性，需要其內含子2 中的增強子序列來抑制AG基因在擬南芥幼苗期表達，該基因的內含子2 序列能夠編碼若干長鏈非編碼RNA（lncRNA），表明AG基因的表達亦受到長鏈非編碼RNA（lncRNA）的調控［59］。

目前，植物體內發現的LncRNAs 可分為3大類：長基因間的非編碼RNA（LincRNA）、內含子非編碼RNA（incRNA）和天然反義轉錄物（NATS）［60］。前人通過對AG 基因內含子2 的序列特征進行分析，從中鑒定出4 個incRNAs，并提供證據表明AG-incRNA4 可能與CLF基因相互作用，與CLF 基因一起共同擔當抑制因子的作用，從而招募CLF-PRC2 復合物來抑制AG基因的表達［61］。此外，AG-incRNA4 還能招募PRC2 到AG-incRNA4 的啟動子區域來下調AG基因自身的表達。相反，CLF或AG-incRNA4 的缺失會導致AG 基因的去阻遏和H3K27me3 標記的減少，表明與CLF 相關的AGincRNA4 是AG 基因活性抑制所必需的［62］。同樣，在其他花器官特征基因的抑制表達過程中也存在類似的機制，非編碼RNA 可能有助于PRC2 結合其靶基因位點。如一個擬南芥incRNAs-COLDAIR 已經被證實在春化后能通過招募PRC2 基因來抑制FLC 基因的表達［63］。盡管目前關于AG基因內含子序列的作用機制仍然未知，但對于AG基因表達抑制機制的研究結果可能會對將來其他植物MADS-box基因的組織特異性表達研究有所啟發，并提供有關真核生物中LncRNAs 作用機制的更多信息。

3 展望

花分生組織維持及終止對于下一代的資源分配至關重要，成功的花分生組織決定是確保植物生殖發育正常和生命周期進程的前提。以往對植物干細胞調控機制的研究主要集中在莖尖分生組織，該分生組織在植物整個生命周期都能維持其干細胞種群。相反，花分生組織在發育過程中不僅要經歷干細胞命運的基因編程終止，而且這一過程還必須與其他花發育程序相協調，如花器官形成和果實發育。因此，同時，花分生組織對于理解干細胞的維持和終止，以及干細胞活動與其他發育過程之間的相互作用也提供了一個良好模型。從實際應用角度來看，由于花序干細胞終止與心皮原基的形成有關，調整花分生組織干細胞終止時間可能會影響果實大小［64］。

然而，目前對于C 類花器官特征因子AG 與其他遺傳因子協同調控花分生組織維持及終止發育過程的分子機制研究尚處于起始階段然。迄今，在生長素介導的花分生組織終止調控通路中僅鑒定出一個生長素感知相關轉錄因子ARF3，進一步研究發現ARF3 介導的生長素感知效應能夠控制包括雌蕊形成在內的大量生長素相關事件［65］，在花分生組織終止調控過程中ARF3 能直接綁定到WUS基因的啟動子近端區域來抑制其表達［66］，推測ARF3 可能在CRC-TRN2 調控通路的下游起作用。

盡管前人研究證實AG基因與生長素的局部功能在花分生組織終止及雌蕊形成過程中起著至關重要的作用，并揭示出一個花序分生組織終止相關的時空調控通路，但目前對于AG基因與生長素介導的花序分生組織終止及雌蕊形成的分子調控機理仍存在許多未知問題，如AG基因如何精確的改變花分生組織細胞種群的活性；生長素在花分生組織終止時可能發揮的功能仍不清楚；生長素抑制WUS基因表達導致下游調控通路中斷，對于這些下游調控通路的功能尚未完全了解等［67］。

在AG基因參與調控花分生組織維持與終止的分子機制研究方面仍存在以下幾個主要問題，如AG基因如何通過特定復合物以時間和空間特定方式進行調節；花發育過程中AG基因介導的多聚體復合物如何在特定位點組裝；AG基因如何協調內在發育進程與外在環境因子之間的交叉對話，以及AG基因、激素信號因子和染色質因子如何以穩健與不同效應的方式協調和匯聚產生一個強大的遺傳網絡用于調控花分生組織維持與終止及雌蕊形成等花發育過程［68-69］。盡管諸多研究結果證實，擬南芥和番茄之間都存在保存的花分生組織終止機制，表明其他被子植物中也可能使用類似的過程來調控花分生組織終止［70］。然而，目前對于植物中AG基因的作用位點及調控模式依然模糊不清，進一步弄清AG基因介導的靶基因作用位點及調控模式將為控制植物花分生組織干細胞維持到雌蕊形成轉變過程的轉錄級聯調控提供新見解。隨著技術的進步，借助于染色質免疫沉淀（chip）和高通量DNA 測序（chip-seq）技術將有助于識別花發育過程中受AG基因等主效轉錄因子綁定的基因組區域及位點。

此外，前人研究表明花器官決定和干細胞活性亦受到不同類型的花器官同源蛋白轉錄因子、激素合成基因、信號分子及表觀遺傳因子（調節下游元件）之間的協同調控。一種同源蛋白可以通過形成高階復合物與上千個靶位點相結合。花器官同源蛋白基因、轉錄因子、激素和表觀遺傳因子可以聚集在一起調節多種常見下游基因的表達，從而執行復雜的發育過程。這些過程涉及花器官特征確定，花器官形成與分化，以及其他重要的花發育過程，包括花分生組織的維持和終止，花器官模式和邊界形成，以及配子體發育。如AG基因的表達亦受到其他花器官特征因子LEAFY（LFY）、APETALA1（AP1）、以及APETALA2（AP2）基因的協同調控［71-73］。其他一些TFs，如SUPERMAN（SUP），CRABS CLAW（CRC），PERIANTHA（PAN）和ULTRAPETALA（ULT）也能在較小的程度上，以部分冗余的方式調節花分生組織的維持和終止［74-77］，對于它們之間如何通過相互作用來協同調控植物花器官分化及花分生組織維持和終止發育過程仍然未知，需要進一步深入探索其內在的分子調控機制。總之，進一步剖析AG基因控制花分生組織維持及終止發育過程的基因調控網絡的結構和功能，將為植物花分生組織干細胞維持到雌蕊形成轉變過程的轉錄級聯調控提供新見解。