燃料乙醇發酵技術研究進展

郭振強 張勇 曹運齊 劉云云 趙于 吳藹民

（1 陜西科技大學機電工程學院，西安 710021；2 華南農業大學林學與風景園林學院，廣州 510642）

木質纖維素類生物質是地球上儲量豐富、分布廣泛的可再生資源，主要包括農作物秸稈、林業廢棄物、動物排泄物等。其主要由纖維素（約占干物質重的30%-50%）、半纖維素（20%-40%）和木質素（10%-25%）3 大部分組成。另外，還含有少量的膠體物質［1］。纖維素和半纖維素都以聚糖形式存在，纖維素主要由六碳糖聚合而成，而半纖維素則主要由戊碳糖聚合形成。利用木質纖維素類生物質生產燃料乙醇，通常需要經過預處理以打破其致密結構，再將聚糖水解轉化為單糖，最后利用釀酒酵母將單糖發酵轉化為乙醇。

目前，木質纖維素類生物質生產乙醇的全過程包括原料收集和預處理、酶解糖化、發酵及產物分離。為使纖維乙醇與傳統燃料形成相競爭的價格，需要對燃料乙醇整個生產過程進行優化以降低成本。其中，糖化發酵工藝因直接關系到后續乙醇產率，受到研究學者的廣泛關注和研究。目前，已有多種工藝先后被提出和應用在乙醇生產過程中，本文綜述了5 種主要糖化發酵工藝的優缺點，包括直接發酵技術、分步糖化發酵技術（Separate enzymatic hydrolysis and fermentation，SHF）、同步 糖 化 發 酵技 術（Simultaneous saccharification and fermentation，SSF）、 同 步 糖 化 共 發 酵 技 術（Simultaneous saccharification and Co-fermentation，SSCF）和聯合生物加工技術（Consolidated bioprocessing，CBP），以及其目前的研究現狀及發展趨勢，嘗試為木質纖維素類生物質高效轉化燃料乙醇產業化發展提供新的思路。

1 直接發酵技術

生物質直接發酵技術，主要基于纖維分解細菌來發酵纖維素。據浙江博聯營養工程科學研究所［2］報道，其研究者們分離得到了一種可以直接轉化纖維素為乙醇的高純富集物。該富集物能降解稻草、麥稈等生物質產生乙醇，但是其降解天然纖維素原料產乙醇的能力相對較弱（不到30%）。直接發酵技術的優點在于工藝簡單，成本低，但是乙醇產率不高，還會產生其他副產物，如有機酸等。針對這一問題，Saddler 等［3］利用熱纖梭菌（Clostridium thermocellum） 和 熱 硫 化 氫 梭 菌（Clostridium thermohydrosulphuricurn）對預處理后底物進行混合菌發酵，乙醇的產量可以達到70%，同時副產物有機酸也大幅度減少。熱纖梭菌可以分解纖維素，若單獨用來發酵纖維素，則乙醇的產率較低，大約為50%，混合菌發酵大大提高了產物乙醇的濃度。直接發酵技術的關鍵在于高效發酵微生物的篩選。

2 分步糖化發酵技術（SHF）

SHF 法也叫水解發酵二段法，其為傳統的纖維乙醇生產方法。SHF 過程中纖維底物先經過纖維素酶的糖化，降解為可發酵單糖，然后再經酵母發酵將單糖轉化為乙醇。SHF 法主要優點是酶水解和發酵過程分別可以在各自的最適條件下進行，纖維素酶水解最適溫度一般在45-50℃，而大多發酵微生物的最適生長溫度在30-37℃。SHF 法主要缺點是水解主要產物葡萄糖和纖維二糖會反饋抑制纖維素酶對底物的降解過程。即葡萄糖和纖維二糖的積累會對纖維素酶的活力產生抑制作用，最終導致酶解發酵效率降低。有文獻研究報道，當纖維二糖濃度達到6 g/L 時，纖維素酶的活力會下降60%。產物葡萄糖主要是對β-葡糖苷酶會產生較大的抑制作用。此外，因酶解過程溫度較高，發酵過程需要對發酵罐進行冷卻，因此設備比較復雜，投資較大。為了克服水解產物的抑制，必須不斷將其從發酵罐中移出。因SHF 法的優點比較突出，因此其應用也比較廣泛，有研究用分批補料SHF 法水解生物質，得到了近70 g/L 的乙醇，主要是由于酶解過程得到了很高的糖濃度，酵母細胞也在其最優的生長條件下進行發酵過程［4］。

3 同步糖化發酵技術（SSF）

為了克服SHF 工藝的缺點，Gauss 等［5］研究人員早在1976 年就提出了同時糖化和發酵技術，即在同一容器中同時進行酶解和發酵過程。即纖維素酶解糖化過程、乙醇轉化過程二者同時進行，此方法可以使酶水解得到的葡萄糖立即被發酵微生物利用轉化為乙醇，有效降低了酶解過程中葡萄糖對纖維素酶的產物抑制作用，減少了纖維素酶的用量，并且縮短了反應周期，同時反應器數量的減少，降低了投資成本。由于酶解產生的葡萄糖被釀酒酵母及時代謝轉化為乙醇，反應體系中葡萄糖濃度維持在較低水平，產物乙醇的存在使發酵過程處于厭氧環境，染菌機率大大減小。因此，提高了乙醇產率。SSF 技術路線，如圖1 所示。

SSF 工藝主要的缺點是酶解糖化與發酵的溫度不協調，不能同時滿足二者反應的最佳溫度條件，使糖化和發酵兩步反應分別不能在微生物的最佳狀態下進行。為了克服SSF 技術溫度不一致的缺點，研究者們通過改變工藝來強化酶解發酵過程。主要的改進工藝有預酶解同步糖化發酵技術（Delayed simultaneous saccharification and fermentation，DSSF）、循環溫度同步糖化發酵（Cycling temperature simultaneous saccharification and fermentation，CTSSF）、變溫同步糖化發酵（Temperature-shift simultaneous saccharification and fermentation，TS-SSF）以及同步水解分離發酵（Simultaneous saccharification，filtration and fermentation，SSFF）等，因為以往的SSF 技術采用的是等溫方式，所以這些改進使得纖維素酶的水解效果明顯增強。預酶解同步糖化發酵，即將纖維原料在高溫條件下先酶解一段時間后，再降溫進行SSF，其結合了SHF 法的優點使纖維素酶先在其最佳溫度條件下降解底物，在反應初期起到降低體系黏度的作用。常春等［6］以蒸汽爆破的玉米秸稈為主要原料，研究了不同SSF技術對乙醇得率的影響，結果發現，采用預酶解的SSF 技術，其乙醇的產量是54.31%，較傳統的SSF技術，乙醇產量提高了5.96%，乙醇濃度也從2.76 g/L提高至3.10 g/L。

CTSSF 法由Chen（陳赫茲）等［7］提出，其先將木質纖維素底物在42℃下酶水解15 min，然后將系統溫度調節至37℃，目的是進行同步糖化發酵過程，反應時間為10 h，將此過程進行重復，接下來發酵72 h，與相應的37℃等溫SSF 技術相比，乙醇產量提高了50%左右。Kang（康玄宇）等［8］采用TS-SSF 技術，使用耐高溫的克魯維酵母 CHY1612，在溫度為45℃、底物濃度為16%（W/V）時，對原料進行同步糖化發酵24 h，然后再將溫度降低至35℃，繼續同步糖化發酵48 h，反應結束后乙醇濃度達到40.2 g/L，與溫度為45℃時的等溫SSF 過程比較，乙醇產量提高了約54.5%。Ishola 等［9］提出了一種SSFF 技術，即在溫度為50℃條件下，原料在水解罐中糖化24 h，然后經過錯流方式經過膜過濾將固液分離，含糖的水解液流到發酵罐中，在30℃進行發酵，發酵后醪液再用泵使其回到水解罐中，其中的酶和酵母可進行循環利用。

以上技術雖對SSF 過程進行了改善，但都存在成本問題，其中DSSF 技術結合了SHF 和SSF 二者的優點，相對其他技術，操作方便，成本低，是高效SSF 法發展的方向。CTSSF 與TS-SSF 技術利用溫度變化可以在一定程度上解決水解和發酵最適溫度之間的差異，然而溫度變化也會導致水解酶和發酵酵母失活，但是為了最大限度提高乙醇的產量，采用CTSSF 和TS-SSF 技術也是可取的。SSFF 技術最大的特點就是可以實現發酵微生物的循環利用，一定程度上可節約成本，但是又存在過濾膜的成本問題。

圖1 同步糖化發酵過程示意圖

4 同步糖化共發酵技術（SSCF）

為了充分利用底物、提高乙醇產率，己糖與戊糖共發酵工藝（SSCF）技術正得到越來越多的關注和研究。木質纖維原料降解過程半纖維素產生的戊糖和纖維素產生的六碳糖在同一反應體系中進行發酵生產乙醇，此過程需要能夠代謝戊碳糖的發酵菌株［10］。SSCF 工藝減少了水解過程的產物反饋抑制作用，而且該技術融入了戊糖的發酵過程，提高了底物利用率和乙醇產率。目前，工業乙醇生產所用的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）只能代謝葡萄糖而不能代謝木糖，Olofsson 等［11］通過基因工程手段在釀酒酵母中插入木糖還原酶（XR）和木糖醇脫氫酶（XDH）或者插入能夠編碼木糖異構酶（XI）的基因，實現了木糖的代謝過程。Olofsson等［12］利用麥草水解液進行SSCF 過程，發現溫度對SSCF 過程有重要的影響，當溫度為32℃時發酵菌株TMB3400 能代謝利用的木糖量要比在37℃條件下的多，原因是當低溫時，葡萄糖的釋放速率會減緩，更有利于木糖的降解。

此外，為了使系統的葡萄糖的濃度保持在較低的水平，可以采用分批補料的方式，通過增加菌種的接種量，可促進其對木糖的發酵以及提高乙醇產量。Erdei 等［13］研究了麥稈同步糖化共發酵產乙醇時的分批補料過程，與一次加料相比，補料過程乙醇產量平均升高了13%左右。

戊糖、己糖共發酵關鍵技術還是在發酵菌株的篩選，目前通過基因工程構建高效共發酵的工程菌被大量研究，也取得了積極的進展，但其大規模、商業化應用的研究報道還比較少。對于滿足SSCF工業化生產要求的木糖乙醇發酵菌株目前報道較少，TMB3400 是迄今唯一一株已報道的工業化發酵戊糖的釀酒酵母。

5 聯合生物加工技術（CBP 法）

木質纖維素類原料生物轉化過程主要障礙是纖維素酶的生產效率低、成本較高［14］。木質纖維原料降解為單糖葡萄糖的過程需要外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等多種酶的協同作用［15］。當前，實驗室使用的纖維素酶主要的缺點是酶活力不高、單位纖維素轉化所需的酶量過高，導致酶解效率較低。因此，需要持續改進提高菌株產酶和酶活力技術。由于商業用纖維素酶的價格比較高，纖維素酶的成本占纖維乙醇生產的主要部分。為了減少發酵過程中的生產成本，聯合生物加工工藝（Consolidated bioprocessing，CBP）應運而生。

CBP 工藝是在單一或組合微生物群體作用下，將纖維素酶和半纖維素酶的生產、纖維素酶水解糖化、戊糖和己糖發酵產乙醇過程整合于單一系統的生物加工過程［16］。該工藝流程簡單，操作方便，在微生物高效代謝作用下將底物一步法轉化為乙醇，有利于降低整個生物轉化過程的成本。

采用聯合生物加工技術轉化纖維底物生產乙醇，目前發展有兩條途徑：一是直接發酵技術，即在生產乙醇的過程中，使用雙功能的既能產纖維素酶也能發酵葡萄糖產乙醇的單一菌株（如熱纖梭菌），利用其末端產物乙醇代謝途徑的改進以使菌株全功能改進提高終產物乙醇得率；二是利用基因工程技術，在能夠發酵乙醇的真菌表達系統或細菌表達系統中，向里面導入異源纖維素酶系統，目的是為了讓其能夠在預處理后的纖維底物上生長和發酵。目前，發展適合CBP 的微生物酶系統主要有3 個策略，即天然策略、重組策略和共培養策略。

5.1 天然策略

天然策略是指將一些厭氧微生物改造，目的是為了能讓其適應CBP 生產的要求。在自然界中存在一些微生物，能直接將生物質轉化為乙醇，如念珠菌、梭狀芽孢桿菌、尖孢鐮刀菌、鏈孢霉菌等。其原理是這些菌株既能在有氧環境下工作，也能在無氧環境中生存，即有氧條件下的主要活動是產生纖維素酶，來降解纖維素進而生產可溶性糖，而在厭氧條件下進行的是代謝生產活動。目前，一些具有耐高溫性質和有著更強的產酶和產乙醇能力的真菌和嗜熱微生物，成為近年來研究熱點。表1 總結了不同微生物降解纖維底物的情況［17-23］。

熱纖梭菌是研究最多的嚴格厭氧嗜熱菌，主要機理是通過胞外纖維素酶復合體快速水解纖維素，野生型菌株乙醇產率可達理論值的10%-30%［24］。當前，通過熱纖梭菌生產乙醇存在的主要問題在于［25］：乙醇的產率較低、產物乙醇對微生物有很大的毒性等。尖孢鐮刀菌是一種分布非常廣泛的絲狀真菌，研究發現尖孢鐮刀菌具有完整的纖維素酶和半纖維素酶系統，可以代謝己糖和戊糖來生產乙醇。但是目前對尖孢鐮刀菌的研究集中在防止植物枯萎病方面，對其所產纖維素酶方面報道較少。里氏木霉為一種好氧的絲狀真菌，其具備完整的降解纖維素的酶系。里氏木霉所分泌的胞外纖維素酶是一種由內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組成的復合纖維素酶，其具有酶活力高、穩定性好、適應性強等優點，是目前應用最為廣泛的纖維素酶［26］。

另外，使用具備雙功能的單一菌種，即既能夠產纖維素酶又能夠發酵乙醇，目前主要研究方向在高活性產酶菌株的篩選及發酵工藝條件的優化，高活力單一菌株的獲取是利用CBP 技術轉化生物質原料的關鍵。

表1 用于木質纖維素類生物質生產乙醇的微生物

5.2 基因重組策略

重組策略是通過基因重組的方法表達一系列的外切葡聚糖酶和內切葡聚糖酶等纖維素酶基因，使微生物能以纖維素為碳源，將來源于纖維素的糖類大部分或完全發酵生產乙醇，其目的是為了快速改良細胞的表型，改良后的細胞，有3 大優勢：一是能增強微生物合成活性產物的能力；二是能激活沉默基因的表達，進而產生新的化合物；三是能增強微生物對底物的利用率以及耐受性［27］。目前，用于表達外源纖維素酶和半纖維素酶基因產乙醇的微生物主要包括大腸桿菌、畢赤酵母、釀酒酵母等［28-29］。近年，重組策略方面的研究取得一定的成果。據報道，不同菌種編碼的糖苷水解酶、木聚糖降解酶和阿拉伯糖降解酶的基因已經被導入釀酒酵母，目的是使其能利用纖維素、半纖維素、纖維二糖、木聚糖和阿拉伯糖等碳源，并產生乙醇。

在木質纖維素生物質水解時，會產生副產物如羥甲基糠醛等，這些副產物會抑制發酵菌株釀酒酵母的生長和代謝。Cheng 等［30］通過基因組重排技術，增強了釀酒酵母菌株對木質纖維素類生物質水解過程副產物5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl-furfural，HMF）的耐受性，從而使菌株的發酵水平顯著提高。

重組策略所遇到的問題有：外源基因共表達會對細胞產生毒害、外源基因很難在宿主菌種做到精確與高效的表達及一些分泌蛋白不能正確折疊［31］等。

5.3 共培養策略

纖維素糖化液含有多種糖分，如半乳糖、阿拉伯糖、麥芽糖、乳糖、木糖及葡萄糖等，使用單一的微生物很難使其完全被代謝利用，而利用共培養法能提高底物的利用效率。所謂共培養策略有兩層含義：一是指發酵液中存在的不同類型的微生物，利用不同類型的糖類底物，如將僅能利用己糖的熱纖維梭菌與能利用戊糖的微生物進行共培養，可避免不同生物間的碳源競爭，實現乙醇產量最大化；二是指存在不同特性的微生物相互協作，加強發酵效果。

Miyazaki 等［32］將纖維素分解菌與溶血厭氧菌共發酵，既能協同作用，又能從容器中去除氧氣，為強化CBP 生物處理過程提供了一種新的氧缺失過程模型。Shrestha 等［33］用白腐菌黃孢菌用白腐菌黃孢菌及釀酒酵母進行固態發酵，在37℃下混合菌降解纖維原料3 d，結果顯示釀酒酵母與黃孢酵母共培養可以使每100 g 底物的乙醇產量提高3 g。

建立共培養體系需要考慮諸多條件，如培養基，生長條件，以及菌株間的代謝互作關系等，因而共培養體系過程的建立極為復雜，主要問題在于如何協調建立經濟高效、完備功能和過程調控的穩定共培養系統。

5.4 CBP技術展望

在使用木質纖維素類生物質生產燃料乙醇的過程中，通過基因工程將異源纖維素酶系統導入到一些生長較快研究較為成熟的真菌表達系統或細菌表達系統中，是當前CBP 法生產燃料乙醇的主要研究方向。該方法生產燃料乙醇，可以有效節省生產時間，節約生產原料，符合未來生物質能源發展的趨勢。近年來，研究者們積極開發出基因改良的各種發酵菌種，使得預處理后的生物質可以得到高效的轉化率。在今后的發展中，研究者們將進一步完善基因技術對發酵菌種的改良，使得此項技術能在工業生產中大規模使用。因此，基因技術在木質纖維素類生物質生產燃料乙醇的使用中有著廣闊的前景。

6 總結與展望

近年來，木質纖維素類生物質生產燃料乙醇的發酵工藝取得了重大進展，其中SSF 工藝相對其他發酵技術有著明顯的優勢，主要表現在節約設備投資、節省反應時間、降低纖維素酶的用量以及提高乙醇生產效率等方面。將SSF 技術應用到高濃度底物酶解體系是獲得高濃度乙醇緩解高糖抑制的有效措施。而隨著分子生物學技術的不斷發展，通過基因工程對發酵菌株性能進行改良的CBP 技術的研究已成為研究熱點。在生物質轉化過程中，使用能產纖維素酶且能發酵產乙醇的雙功能單一菌株，可以有效提高發酵菌株的底物代謝能力，獲得高的乙醇產量，并且縮短了反應時間，該技術的不斷革新是未來生物質能源發展的趨勢。近年來，研究者們積極開發出經基因改良的各種發酵菌種，有效提高了生物質的轉化效率。隨著技術的不斷進步，高效轉化菌株的開發將使該方法有望在工業生產中實現大規模的應用，其發展前景十分廣闊。