一株異養硝化-好氧反硝化皺褶念珠菌（Diutina rugosa）的分離及脫氮特性

杜全能 朱文娟 蘭時樂

（湖南農業大學生物科學技術學院，長沙 410128）

隨著集約化、規模化養殖業的發展，養殖廢水中殘餌、糞便的增加導致水體富營養化加劇。氮元素作為養殖水體中的污染物，主要以氨氮（NH4+-N）、亞硝氮硝氮的形式存在。氨氮亞硝氮的存在對水生動物存在一定的危害。氨氮對水生動物的鰓Na+/K+-ATP酶［1］、組織結構［2-3］、血清抗氧化系統［4-5］、腸道微生物菌群［6］等均存在影響，同時亞硝酸鹽氮作為硝化和反硝化過程中的中間產物，對水生動物的生長、免疫指標［7］、抗氧化指標［8］等也存在較大的影響。嚴重制約了養殖業的發展，可見養殖廢水中氮的去除變得也更加重要。

目前，在處理養殖廢水中，生物法是最常見、最有效的方法。傳統的生物脫氮，認為自養硝化和厭氧反硝化是兩個獨立的過程。由于自養硝化速率低和厭氧反硝化相分離，這種生物處理方法顯得耗時。自1983 年，Robertson 等［9］發現異養硝化-好氧反硝化菌以來，具有該功能的菌群得到廣泛的關注。近年來，一些研究發現不動桿菌屬（Acinetobactersp.）［10-12］、假單胞菌屬（Pseudomonassp.）［13］、克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）［14］具有高效異養硝化-好氧反硝化的能力。本研究從水產養殖池塘中采集養殖水體污泥樣品，分別以氨氮、亞硝氮和硝態氮為唯一氮源富集并篩選出一株具有異養硝化-好氧反硝化能力的酵母菌DW-1，通過形態學觀察、26S rDNA 序列分析，以及系統發育樹構建對菌株DW-1進行鑒定，初步探討碳源種類、C/N、培養溫度、轉速、初始pH 值對該菌在異養硝化-好氧反硝化能力的影響，以期為皺褶念珠菌DW-1 在養殖含氮廢水生物處理中的推廣應用奠定良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種分離樣品 菌種分離樣品取自湖南農業大學東湖水產養殖池塘污泥，裝入滅菌玻璃廣口瓶中，立即帶回實驗室進行菌種富集和分離。

1.1.2 培養基 （1）液體種子種子培養基（YPD）：酵母提取粉 10 g、蛋白胨 20 g、葡萄糖 20 g、H2O 1 L。115℃，30 min 滅菌。（2）平板分離培養基：K2HPO47 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、（NH4）2SO40.247 g、FeSO4·7H2O 0.05 g、CH3COONa 3.6 g、H2O 1 L。121℃，25 min 滅菌。（3）BM 培養基：K2HPO47 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、（NH4）2SO40.247 g、FeSO4·7H2O 0.05 g、CH3COONa 3.6 g、H2O 1 L。121℃，25 min 滅菌。（4）反硝化培養基1：K2HPO47 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NaNO20.2 g、FeSO4·7H2O 0.05 g、CH3COONa 3.6 g、H2O 1 L。121℃，25 min 滅菌。（5）反硝化培養基2：硝酸鉀10 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、H2O 1 L。121℃、25 min 滅菌。

1.1.3 主要試劑和藥品 K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、FeSO4·7H2O、CH3COONa、NaNO2、KNO3、NaCl、NaOH、磺胺、N-（1-萘基）-乙二胺二鹽酸鹽、磷酸、酒石酸鉀鈉、過硫酸鉀（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；牛肉膏、蛋白胨（BR，上海盛思生化科技有限公司）；瓊脂（BR，北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.4 主要儀器設備 立式恒溫培養箱（ZQPL-200，天津市萊波特瑞儀器設備有限公司）；恒溫振蕩培養箱（ZQLY-180N，上海知楚儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（SP-752，上海光譜儀器設備有限公司）；高壓滅菌鍋（G154DWS，至微儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（LD-9123A，上海龍躍儀器設備有限公司）；分析天平（AL204，奧豪斯儀器（上海）有限公司）；高速冷凍離心機（GR-21G，上海趙迪生物科技有限公司）；DNA 電泳槽（DYCP-31DN，北京六一儀器廠）；穩壓電泳儀（DYY-5，北京六一儀器廠）；凝膠成像儀（FR980，上海復日科技儀器有限公司）；PCR 儀（2720 thermal cycler，Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選分離

1.2.1.1 菌株的富集 取10 g 養殖池塘污泥加入100 mL 的富集培養基中（加入適量的破玻璃珠），置于30℃、170 r/min 搖床中培養72 h。

1.2.1.2 菌株初篩 取 10 mL 富集液加入 90 mL 的無菌水中振蕩15 min 后，采用 10 倍稀釋法稀釋成10-1-10-8，分別取 0.1 mL 不同梯度的菌懸液涂布于硝化和反硝化固體培養基平板上，倒置于30℃恒溫培養箱中培養，待固體平板上長出單菌落后，挑取不同的單菌落進行分離純化并編號。

1.2.1.3 菌株復篩 將分離純化的菌種分別接種于種子培養基中，于 30℃、170 r/min 培養24 h 后，將種子液按1%（V/V）接種于硝化培養基和反硝化液體培養基1 中，置于30℃、170 r/min 的搖床中振蕩培養 48 h，測定 NH4+-N、NO2--N 的含量。

大跨度鋼結構玻璃采光頂施工技術應用于本工程，1#～4#樓與6#樓之間為商業步行街，商業步行街全部為鋼結構玻璃采光頂，玻璃采光頂有橢圓型和圓弧型兩種組成，投影面積約為1500m2。該玻璃頂短跨為18m、24m，距地面高度為20m。采用此施工技術玻璃采光頂造型美觀、施工進度快、周期短、現場焊接量減少近一半；可以減少施工現場階段對構件的測控工作，減少對焊縫的檢測量，在加工廠焊接，可提高焊接質量及精度，是值得推廣的一項施工技術。本鋼結構玻璃采光頂：整體材料采用矩形管，架體安裝采用分條分塊吊裝的方式。

按 1%（V/V）接種于反硝化培養基2 中，置于30℃恒溫培養箱中，靜止培養 24 h 后觀察產氣情況。

1.2.2 菌株形態觀察 將保存的菌株，在PDA 固體培養基平板上進行劃線，并倒置于30℃恒溫培養箱中靜止培養24 h 后，觀察其菌落形態，并進行簡單染色觀察其菌體形態特征。

1.2.3 菌株的鑒定 用YPD 培養基培養菌株DW-124 h 后，采用上海生工生物工程DNA 提取試劑盒（SK8257）進行DNA 提取。以提取的基因組DNA為模板，擴增26S rDNA 基因片段。正向引物序列：NL1：5′- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′，反向引物序列：NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。PCR 擴增反應體系為25 μL，包括10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1 μL、Taq 酶 0.2 μL、正向引物（10 μmol/L）0.5 μL、反向引物（10 μmol/L）0.5 μL，加雙蒸水定容至25 μL。PCR 反應條件：94℃預變性 4 min，94℃變性 45 s；55℃退火 45 s；72℃延伸 1 min；72℃延伸 10 min；4℃保存。測序由上海生工生物工程有限公司完成。通過BLAST 程 序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）將26S rDNA 序列與GenBank 數據庫中的序列進行比對，并提交給 GenBank。采用 NJ 法，用MEGA7.0.26 構建系統發育樹。

1.2.4 菌株DW-1 除氮特性的研究 采用單因素試驗法，改變BM 培養基中的碳源種類、C/N、初始pH、溫度、轉速等，考察其對菌株DW-1 脫氮性能的影響。碳源種類：選取蔗糖、丁二酸鈉、酒石酸鈉、檸檬酸鈉分別替代乙酸鈉作為碳源，探究碳源對菌株DW-1 除氮性能的影響；C/N 比：固定氨氮的濃度為52.29 mg/L，以乙酸鈉作為唯一碳源，分別將C/N 比調節為10、15、20、25、30；初始pH值：使用5 mol/L 的HCl 或NaOH 溶液調節培養基初始pH 為2、4、6、8、10；培養溫度：將培養溫度設置為 20、24、28、32 和 36℃；為：將培養碳源，130 r/min、150 r/min、170 r/min、190 r/min、210 r/min。接種量為1%（V/V），裝量為100 mL /300 mL 三角瓶。重復3 次。

1.2.5 測定方法 氨氮、亞硝酸鹽氮、總氮的測定參照《水和廢水監測分析方法》［15］。氨氮（NH4+-N）測定采用納氏試劑法、硝酸鹽氮（NO3--N）測定采用紫外分光光度法、總氮（TN）采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法。

2 結果

2.1 菌株的分離鑒定

從富集培養基中分離出20 株具有異養硝化-好氧反硝化能力的菌株，通過復篩和產氣試驗，從中篩選出1 株具有對氨氮和亞硝氮去除率較高的菌株，命名為DW-1。其在PDA 培養基上的菌落形態特征為（圖1）：圓形，乳白色，表面濕潤，不透明；顯微形態特征為：橢圓形，出芽生殖，具有典型的酵母菌細胞特征。經26S rDNA 序列分析，菌株DW-1 序列全長為504 bp，其26S rDNA 序列與Diutina rugosa（登錄號MG228369.1）有100%的序列相似性（圖2）。結合形態學特征和分子生物學分析，初步鑒定菌株DW-1 為皺褶念珠菌DW-1（Diutina rugosaDW-1）。

圖1 DW-1 菌株平板菌落形態特征

圖2 基于26S rDNA 序列同源性構建DW-1 菌株的系統發育樹

2.2 碳源種類對菌株DW-1除氮特性的影響

圖3 不同碳源條件下菌株DW-1 除氮特性

2.3 不同C/N對菌株DW-1除氮特性的影響

探究了5 種不同的C/N 對菌株硝化和反硝化能力的影響，結果（圖4）表明，在C/N 為10-30 存在顯著影響（P＜0.05）。隨著C/N 的增加，氨氮和總氮的去除率也隨之增加。當C/N 為25：1 時，氨氮和總氮的去除率最高，分別為88.30%和50.31%。但當C/N 大于25：1 后，氨氮和總氮去除率均有所下降。原因為C/N 過低，培養基中氮素含量高，導致微生物生長繁殖所需碳素營養的供應受到限制；而C/N 過高，培養基中碳素含量高，影響碳素的利用以及改變菌株的代謝途徑甚至抑制細胞中氨氮加氧酶、羥胺氧化酶、硝酸鹽還原酶或亞硝酸還原酶的活性，從而影響氨氮和總氮的去除。

圖4 不同C/N 條件下菌株DW-1 除氮特性

2.4 不同pH對菌株DW-1除氮特性的影響

如圖5 所示，不同的pH 值對菌株DW-1 氨氮和總氮的去除率有顯著影響（P＜0.05）。在pH值為5-8之間，氨氮去除率均高于80%；但培養基pH值高于7，氨氮和總氮去除率均有所下降。當培養基pH 值為6.0時總氮去除率最高，達到56.79%；而氨氮去除率中最高的pH 值為7.0，達到88.71%，且pH 對亞硝酸鹽的積累并無顯著的影響（P＞0.05）。

圖5 不同pH 值條件下菌株DW-1 除氮特性

2.5 不同溫度對菌株DW-1除氮特性的影響

溫度對菌株D. rugosaDW-1 氨氮和總氮去除率存在顯著性差異（P＜0.05）。從圖6 結果可以看出，菌株DW-1 在20-36℃之間均能去除解氨氮和總氮，且氨氮和總氮去除率隨著溫度的升高而升高。當培養溫度為32℃時，氨氮和總氮去除率分別為89.59%和50.72%。當培養溫度超過32℃后，菌株對氨氮和總氮的去除率下降。主要原因是由于溫度的升高，游離氨的濃度增加，進而提高了硝化和反硝化速率，且溫度對菌株DW-1 積累亞硝氮無顯著性影響（P＞0.05）。

2.6 不同轉速對菌株DW-1除氮特性的影響

通過調節恒溫振蕩培養箱的轉速來調節溶氧量，以探究溶氧對菌株D. rugosaDW-1 氨氮和總氮去除率的影響。由圖7 結果可知，轉速在130-210 r/min 之間，對菌株氨氮和總氮去除率均無顯著影響（P＞0.05），而菌株D. rugosaDW-1 在130 r/min-210 r/min 之間，氨氮去除率在87.29%-95.01%，總氮去除率在45.09%-50.59%，且亞硝酸鹽的積累量均小于0.01 mg/L。

圖6 不同培養溫度條件下菌株DW-1 除氮特性

圖7 不同搖床轉速條件下菌株DW-1 除氮特性

3 討論

在碳源試驗中，菌株DW-1 只有在乙酸鈉作為唯一碳源時，才具有較高的異養硝化反硝化能力，這與Acinetobactersp.Y16［10］結果一致；而當蔗糖、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、酒石酸鈉分別作為唯一碳源時，菌株DW-1 的硝化能力較弱，且均在20%以下，與P. stutzeriHJ-7［16］以檸檬酸鈉為碳源具有最好的脫氮效果，P. putidaYH［17］在琥珀酸鈉作為唯一碳源時具有最高的脫氮率的試驗結果不同，但與Ren等［11］、Chen 等［12］試驗結論一致。可見不同的碳源對異養硝化好氧反硝化細菌除氮能力存在影響。

菌株DW-1 需要較高的C/N 才能進行硝化和反硝化，目前報道的大多異養硝化-好氧反硝化細菌在C/N=10-15 之間，具有最佳的除氮率［13，18］。而Huang 等［10］和Jin 等［19］發現一些菌株能夠在低碳氮比下進行異養硝化-好氧反硝化作用，但本菌株當C/N 為25：1 時，氨氮和總氮的去除率最高。

環境pH 值和培養溫度也是影響微生物消化和反硝化能力的主要因素。有研究表明，Vibrio diabolicusSF16［20］和Acinetobactersp.T1［12］在pH 值大于7.0 時氨氮去除率較好，但也有研究發現有些細菌只能在微堿性條件下進行硝化作用［9］，且大部分菌株均能夠在20-40℃之間進行硝化和反硝化作用［21-24］。本研究發現菌株DW-1 在微酸性、中性、微堿性和培養溫度20-36℃條件下均具有較強的硝化和反硝化能力。

好氧微生物生長和代謝都需要氧氣，氧氣濃度的高低主要影響微生物細胞中各種氧化酶系如過氧化氫酶、多酚氧化酶、細胞色素氧化酶等的活力。培養基中氧氣濃度主要通過提高搖床轉速和攪拌速率等實現。許多研究表明搖床轉速對菌株的硝化速率存在顯著性影響（P＜0.05）［10，25-26］，但本研究菌株DW-1 的硝化和反硝化速率與搖床轉速無顯著性差異（P＞0.05）。

4 結論

本研究在養殖污泥中篩選出一株具有異養硝化-好氧反硝化能力的酵母菌，經26S rDNA 序列分析結果，菌株DW-1 與D. rugosa（登錄號MG228369.1）比對有100%的序列相似性，確定DW-1 為D. rugosa，并命名為D. rugosaDW-1。在以乙酸鈉為唯一碳源，C/N 為25，pH 值為6、溫度為32℃、轉速為170 r/min 的情況下，菌株DW-1 具有最佳的氨氮降解率和總氮去除率，分別為94.94%、48.69%，而整個過程中亞硝氮積累量0.067 mg/L。