丙氨酸轉氨酶修飾對大腸桿菌L-色氨酸合成的影響

孟帥帥 黃欽耿 吳松剛 劉峰

（福建師范大學生命科學學院 工業微生物教育部工程研究中心，福州 350117）

L-色氨酸（L-Trp）作為人和動物體所必需的3種芳香族氨基酸之一，廣泛應用于醫藥、食品、飼料和化工領域［1-2］。L-Trp 的生產方法主要包括化學合成法、轉化法及微生物發酵法。由于化學合成法和轉化法存在工藝復雜、副產物多、得率較低及成本較為昂貴等缺點，如今通常采用微生物直接發酵法來實現L-Trp 的生產。大腸桿菌作為氨基酸發酵的重要平臺微生物，在氨基酸發酵工業中有著極其重要的地位。大腸桿菌細胞可直接利用葡萄糖合成L-色氨酸，從葡萄糖出發，經過碳中心代謝過程，包括各種磷酸化系統（Phosphotransferase system，PTS）、糖酵解過程（Embden meyerhof parnas，EMP）以及磷酸戊糖途徑（Hexose monophosphate pathway，HMP），合成L-色氨酸的前體物磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）和4-磷酸-赤蘚糖（4-phosphate-D-erythrose，E4P），之后經過芳香族氨基酸共有的7 步莽草酸途徑合成分支酸，最后由分支酸經芳香族氨基酸的分支代謝途徑合成L-色氨酸［3-4］。其中，丙酮酸不僅作為色氨酸合成重要的前體物，同時也是細胞合成L-丙氨酸的直接供體。在發酵過程中L-丙氨酸大量合成，丙酮酸的消耗勢必增加，使得前體物DAHP 的合成較少，L-色氨酸的積累也受到影響。

微生物體內L-丙氨酸的生物合成是比較容易實現的，其含量也較為豐富［5-6］。但是，在氨基酸發酵生產中L-丙氨酸的大量合成不僅會造成碳源的過度消耗，過量的積累還會對發酵液中目標產物的純化以及回收帶來困難［7-8］。大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌都是產L-Trp 的代表性微生物。在谷氨酸棒桿菌中，研究人員通過敲除合成L-丙氨酸的關鍵酶來提高L-纈氨酸以及L-絲氨酸等氨基酸的產量［7-9］。Marienhagen 等［7］分析了谷氨酸棒桿菌中與L-丙氨酸合成相關的兩種轉氨酶：AlaT 和AvtA，通過敲除活性最高的轉氨酶AlaT 來減少L-丙氨酸的含量以及增加L-纈氨酸在胞外的積累。但與谷氨酸棒桿菌相比，大腸桿菌在L-丙氨酸的合成過程中具有更復雜的丙氨酸轉氨酶，不僅包括已被鑒定的丙氨酸轉氨酶AlaA、AlaC 和纈氨酸-丙酮酸氨基轉移酶AvtA 在內最主要的3 種丙氨酸轉氨酶，還包括另外8 種潛在的轉氨酶可能合成L-丙氨酸［10-12］。目前在大腸桿菌中還鮮見L-丙氨酸合成調控下的L-色氨酸的相關研究。

本研究以大腸桿菌E. coliFS-T0 為出發菌，利用Red 重組技術分別修飾不同丙氨酸轉氨酶基因，構建系列L-丙氨酸轉氨酶突變工程菌株，并探究各基因修飾后各工程菌在細胞生長、L-丙氨酸含量以及L-色氨酸產量等方面的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 大腸桿菌E. coliFS-T0 由實驗室前期通過代謝工程手段及多輪化學誘變獲得的多類芳香族氨酸類似物抗性（5-甲基色氨酸、5-氟色氨酸和對氟苯丙氨酸抗性）的高產L-色氨酸工程菌株。本研究基因修飾所用質粒pKD46、pKD13 和pCP20由工業微生物教育部工程研究中心保藏，具體菌株見表1。

表1 本實驗使用的菌株

1.1.2 引物 根據GenBank 中大腸桿菌E. colistr.K-12 substr. MG1655 的 基 因alaA、alaC和avtA序列信息，利用Red 重組的方法敲除菌株E. coliFS基因組中alaA、alaC和avtA基因，分別設計含同源臂序列的敲除引物，設計如下（下劃線部分為目的基因序列，其余為同源臂序列）：F1-（5′-AT GTCCCCCATTGAAAAATCCAGCAAATTAGAGAAT GTCGTGTAGGCTG GAGCTGCTTC-3′），R1-（5′-TT ACAGCTGATGATAACCAGAAAGGAAACGCGCG AACT TCTGTCAAACATGAGAATTAA-3′）、F2-（5′-ATGGCTGACACTCGCCCTGAACGTCGCT TTA CGCGCATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′），R2-（5′-AGCGAACATGCGTATCAC CATAGTCGCCAAAG CCAATCCCTGTCAAACATGAGAATTAA-3′）以及F3-（5′-ATGACA TTCTCCCTTTTTGGTGACAAATTTACCCGCCACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′），R3-（5′-TTAGTGACTTTCAGCCCAGGCTCTTTCTATCTC TTCCGCCTGTCAAACATGAGAAT TAA-3′）。同 時 設計鑒定引物如下：F1-F-（5′-ATGTCCCCCATTGAAAAATCCAGC-3′），R1-R-（5′-TTACAGCTGATGATAACCAGAAAGG-3′）、F2-F-（5′-TAAACCGTCGGCACG GAACATCGC-3′），R2-R-（5′-TTAGCTACGGCTGA GCACGC-3′）以及F3-F-（5′-ATGAC ATTCTCCCTTT TTGG-3′），R3-R-（5′-TTAGTGACTTTCAGCCCA GG-3′）。

1.1.3 主要試劑和儀器 PrimeStar DNA 聚合酶和PCR 試劑：TaKaRa 寶生物公司產品；引物合成、質粒小量提取試劑盒、sanPreP 柱式膠回收DNA 試劑盒、胰蛋白胨和酵母粉，瓊脂糖，L-阿拉伯糖等：生工生物工程（上海）股份有限公司產品；其余試劑均為國產或進口分析純級別。

電轉儀：Eppendorf 2510，艾本德中國有限公司；PCR 儀：ABI 產品；高效液相色譜儀：LC-2030C，島津中國；紫外分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.1.4 培養基和培養條件 LB 培養基（g/L）：酵母粉 5，胰蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂粉 20。

SOC 培養基（g/L）：蛋白胨 20，酵母粉 5，葡萄糖 3.9，NaCl 0.58，KCl 0.185，MgCl20.95。

發酵培養基（g/L）：葡萄糖20，酵母浸膏11，L-苯丙氨酸0.75，L-酪氨酸0.60，硫酸銨3，檸檬酸鈉0.25，硫酸鎂3，磷酸氫二鉀0.65，磷酸二氫鉀0.35，七水硫酸亞鐵0.02，氯化鎂0.05。

上述培養基pH 值均需調至7.0，篩選所需的卡那霉素和氨芐青霉素終濃度為50 μg/mL 和100 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 PCR 片段的制備 以質粒pKD13 為模板、含同源臂的序列為引物進行PCR 擴增，反應條件為：95℃預變性 1 min；94℃變性 40 s，57℃退火 1 min，72℃延伸 1.5 min，35 個循環；72℃延伸 10 min，之后用DpnI 酶對PCR 產物進行處理，膠回收后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證。

1.2.2 含pKD46 電轉化感受態的制備 將含有pKD46 質粒的菌株接種于終濃度為100 μg/mL 的氨芐青霉素LB 培養基中，30℃過夜培養。取0.5 mL至含50 mL LB 培養基中（含100 μg/mL 的氨芐青霉素），30℃，250 r/min 培養至OD600=0.15-0.2，加入終濃度為10 mmol/L 的L-阿拉伯糖誘導劑。待細胞OD600在0.7 左右時，菌液于4℃預冷30 min，6000 r/min 離心10 min，棄上清。之后用預冷的10%的甘油重懸離心洗滌2 次。收集后的細胞進行后續試驗或者-80℃保存。

1.2.3 電轉化 取上述PCR 產物10 μL 加至感受態細胞中，混合后加至電轉杯，于1800 V，25 μF，200 Ω 條件下進行點擊。電擊后迅速加入800 μL 的SOC 培養基，37℃，100 r/min 培養約1.5 h 后取200 μL 涂布于含卡那霉素抗性的平板上，篩選含卡那霉素重組子的陽性轉化子。

1.2.4 抗性基因及pCP20 質粒的消除 將pCP20 質粒電轉入含卡那霉素抗性的重組子中，30℃復蘇1.5 h 后，涂布于含氨芐青霉霉素的平板上，30℃培養。使用驗證引物篩選陽性轉化子，之后將陽性轉化子接種于LB 培養基中，30℃培養3 h 后42℃過夜培養，取少許菌液劃線分離并對單菌落就行抗性檢測，從而得到已消除pCP20 的重組菌株。

1.2.5 搖瓶發酵培養 種子培養：在冷凍管中分別取少許出發菌株和改造后菌株接種于LB 斜面中，培養約15 h 后，用無菌生理鹽水洗下接種于裝有50 mL 種子培養液的500 mL 三角瓶中，35℃，250 r/min培養12 h。

搖瓶發酵培養：將上述培養好的種子液以10%的接種量接種于含30 mL 的發酵培養基的250 mL 的三角瓶中，37℃，250 r/min 培養約40 h。

1.2.650 L 罐補料分批發酵 種子罐培養工藝：將1.2.5 中培養好的種子液以0.5%的接種量接種于裝有10 L 發酵培養基的30 L 的種子罐中，罐溫35℃，初攪拌300 r/min，溶氧（DO）自然下降后通過攪拌控制在20%-50%，OD600≥10（約13 h），移種。

發酵罐培養工藝：以20%的移種量將上述種子罐中的種子液轉入含有25 L 發酵培養基的50 L 發酵罐中，初攪拌300 r/min，通氣比為1∶0.8，生物量（OD600）在10 之前罐溫控制在35℃（大約6 h），之后升溫至37℃培養，全過程通過流加25%的氨水控制pH 在7.0 左右，調節攪拌控制溶氧在15%-35%，并在發酵過程中流加70%的葡萄糖維持發酵液中葡萄糖濃度在5.0-10.0 g/L。發酵過程中每隔2 h 取樣檢測殘糖及菌體生物量。發酵結束前2 h 停止流加葡萄糖，整個發酵周期約50 h。

1.2.7 發酵產物檢測分析 利用分光光度計在600 nm 下測定菌體濃度；SBA-40D 生物傳感分析儀測定葡萄糖的含量；氨基酸的含量采用HPLC 法測定［13-14］。

2 結果

2.1 alaA、alaC和avtA基因缺失株的構建

利用Red 重組技術，以pKD13 質粒為模板含同源臂的序列為引物，分別擴增出與alaA、alaC和avtA基因同源、中間為卡那霉素抗性且在卡那霉素兩端含FRT 位點的片段。轉化后使用驗證引物及測序的方法驗證其與目標長度一致，篩選轉化后的陽性轉化子。

pCP20 屬溫度敏感型質粒，具有氯霉素和氨芐青霉素抗性，同時在30℃下可產生翻轉酶重組酶FLP，FLP 重組酶可與FRT 位點結合，在FLP 重組酶的作用下FRT 位點自身發生同源重組，從而消除抗性基因及一個FRT 位點，在溫度升至42℃時pCP20 質粒自行丟失。pCP20 質粒消除抗性基因及其丟失后使用驗證引物及測序結果篩選陽性轉化子，結果經DNAMAN 軟件比對后與實際序列一致，表明已經對E. coliFS 的alaA、alaC和avtA各基因成功敲除，敲除后菌落PCR 結果如圖1。

2.2 搖瓶發酵過程中各組分變化情況

為了驗證各丙氨酸轉氨酶的修飾對工程菌生產L-色氨酸的影響，對出發菌株及各修飾后的工程菌進行搖瓶初步實驗。利用高效液相色譜以及分光光度計等方法對各工程菌中各組分變化情況進行比較分析。

結果（表2）顯示，從最大生物量來看，除3種丙氨酸轉氨酶全部缺失的工程菌E. coliFS-T7 的生長受到較強抑制外，其它各工程菌株與出發菌株的細胞濃度基本一致，說明單獨或任意兩種丙氨酸轉氨酶的缺失對于菌體的正常生長代謝不會造成明顯影響；在L-丙氨酸的積累和L-色氨酸的合成方面，各丙氨酸轉氨酶缺失工程菌相比于出發菌株L-丙氨酸的積累均有所降低、L-色氨酸的合成均有所提高，其中L-丙氨酸的積累中工程菌E. coliFS-T4 和E.coliFS-T7 最為明顯，分別減少了91.0%和97.2%，而對于L-色氨酸的合成工程菌E. coliFS-T4 產量最高，可達6.08 g/L，相比于原始菌提高了26.7%，而L-丙氨酸積累最少的E. coliFS-T7 工程菌僅能合成5.36 g/L 的色氨酸。實驗結果表明，敲除AlaA 和AlaC 兩種L-丙氨酸轉氨酶對工程菌株的生長和發酵生產L-色氨酸最為有利。

圖1 alaA、alaC 和avtA 各基因敲除后菌落PCR 結果

表2 各基因敲除菌搖瓶發酵性能比較

2.3 工程菌E. coli FS-T4 50L罐的補料分批發酵

從搖瓶發酵試驗結果得知，所修飾的各工程菌中，缺失AlaA 和AlaC 的兩種L-丙氨酸轉氨酶的工程菌E. coliFS-T4 的產色氨酸能力最高。因此，為了檢驗其在高密度發酵中的產酸能力，以出發菌株E.coliFS-T0 為對照，在50 L 罐中對菌株E. coliFS-T4進行補料分批發酵實驗，發酵過程代謝曲線見圖2。工程菌株E. coliFS-T4 最高可積累L-色氨酸41.9 g/L，糖酸轉化率可達20.5%，分別較出發菌株提高了13.8%和5.1%。在細胞生長和耗糖方面，發酵0-6 h，溫度控制在35℃，出發菌株與丙氨酸轉氨酶缺失工程菌均處于發酵環境適應期，細胞增長較慢，但耗糖速率有一定差別，工程菌E. coliFS-T4 的耗糖速率明顯更高；發酵6 h 后，溫度升至37℃，二者工程菌均進入對數生長期，菌株E. coliFS-T4 在發酵12 h 時開始進行補糖，32 h 時菌濃達到最大值，最大菌濃OD 可達90.2，相比于出發菌株工程菌E.coliFS-T4 補糖時間和菌株生長至最大菌濃時間均提前了4 h，最大菌濃也與出發菌株基本一致，說明AlaA 和AlaC 兩丙氨酸轉氨酶的缺失對菌株的正常代謝生長并未有明顯影響。在L-色氨酸生產方面，0-16 h，酸值較低，二者產酸基本一致；發酵16 h 后，工程菌E. coliFS-T4 L-色氨酸的積累速率明顯加快，在46 h 時產酸達到最高值，相比于出發菌株達到最大酸值提前了2 h，隨著發酵時間的進行，二者工程菌L-色氨酸的積累量分別在48 h 和50 h 時降低，因此，發酵在50 h 終止。

圖2 E. coli FS-T4 工程菌株在50 L 罐中的補料分批發酵

3 討論

關于與L-丙氨酸合成途徑相關的轉氨酶及其敲除后對其它產物的影響已經在谷氨酸棒桿菌中取得一定的研究進展［9，15］。在谷氨酸棒桿菌中，合成L-丙氨酸的轉氨酶為AlaT 和AvtA。Marienhagen 等［7］分析了谷氨酸棒桿菌中與L-丙氨酸合成相關的轉氨酶在酶學和細胞水平及對產物形成等方面產生的差異，敲除活性最高的轉氨酶AlaT 使得胞外L-丙氨酸的積累量減少了80%，同時增加了L-纈氨酸的產量。Zhu 等［8］對谷氨酸棒桿菌的丙氨酸轉氨酶全部敲除并引入乙酰羥酸合成酶的減毒突變體，獲得了一株高產的L-絲氨酸生產菌株且副產物L-丙氨酸和L-纈氨酸的積累分別降低了87%和60%。盡管在谷氨酸棒桿菌中已經證實，減少L-丙氨酸的合成能夠增加諸如L-纈氨酸、L-絲氨酸等氨基酸的合成，但與谷氨酸棒桿菌不同的是大腸桿菌具有更復雜的L-丙氨酸轉氨酶酶系［8，10］。在谷氨酸棒桿菌中，谷氨酸棒桿菌缺失某一種（如AlaT）或缺失全部的L-丙氨酸轉氨酶都可以獲得L-丙氨酸含量大幅減少及目標產物產量明顯提高的工程菌株。而與谷氨酸棒桿菌相比，大腸桿菌在缺失任意一種甚至兩種（除缺失ΔAlaAΔAlaC 外）的L-丙氨酸轉氨酶所獲得的工程菌在L-丙氨酸含量及目標產物產量方面并沒有顯著變化。盡管L-丙氨酸轉氨酶AlaA、AlaC 和AvtA 全部缺失的菌株E. coliFS-T7 發酵過程中L-丙氨酸含量最低，但其在目標產物L-色氨酸的產量方面卻表現平平。因此，在大腸桿菌中還鮮見L-丙氨酸合成調控下的L-色氨酸的相關研究。

目前已經證實負責L-丙氨酸合成的3 種最主要的L-丙氨酸轉氨酶分別是AlaA、AlaC 和AvtA，盡管這些酶在任意一種存在的情況下都能實現最佳生長，但AvtA 與另外兩種酶的活性卻存在顯著差異，其中AlaA 和AlaC 具有更高的通向L-丙氨酸合成的通量效率且二者活性的總和占據了大腸桿菌中總的L-丙氨酸轉氨酶活性的90%，缺失其中任何一種的情況下都能夠促進另外一種酶的表達［5，10］。因此，由于AlaA 和AlaC 二者L-丙氨酸轉氨酶的互補作用，在單獨敲除其中任何一種時，L-丙氨酸含量并不會大幅降低。Kim 等［10］研究發現在大腸桿菌體內當以丙酮酸作為碳源時可能還會存在其它幾種轉氨酶可以促進L-丙氨酸的合成。本實驗搖瓶結果也驗證了這一點，在3 種酶全部缺失的情況下，盡管菌體生長明顯受到影響且其最大生物量與親本菌株相比大幅下降，但還會有少量的L-丙氨酸產生（約占3%）。然而盡管如此，搖瓶結果也表明在缺乏這3種最主要的轉氨酶的情況下，工程菌的生長明顯受到了抑制，其最大生物量也僅為親本菌株一半。因此，AlaA、AlaC 和AvtA 三種酶的存在一起賦予了大腸桿菌L-丙氨酸合成的靈活性。即使對于AvtA 來說，在大腸桿菌體內表現出很低的L-丙氨酸轉氨酶活性且僅能夠積累少量的L-丙氨酸，但相對于3 種酶全部缺失而表現出巨大生長缺陷，單獨存在的AvtA 也能保證與親本菌株相比相似的生長速率和生物量。

氨基酸穩態維持并調節細菌微生物群中細胞氨基酸庫的平衡，丙氨酸通過可逆轉氨反應的途徑，從而連接關鍵的代謝網絡，如發酵（通過丙酮酸）和氮代謝（通過天冬氨酸和谷氨酸）［5-6，16-17］。在大腸桿菌體內合成L-丙氨酸的前體物是丙酮酸，同時也是細胞合成L-丙氨酸的直接供體。在發酵過程中L-丙氨酸的大量合成，丙酮酸的消耗勢必增加，使得前體物DAHP 的合成較少，L-色氨酸的積累也受到影響。因此，為了保證大腸桿菌工程菌正常生理代謝且最大化降低L-丙氨酸的積累，敲除AlaA 和AlaC 兩種L-丙氨酸轉氨酶，僅保留AvtA 一種酶。當AlaA 和AlaC 兩種酶被同時敲除后，與親本菌株相比，被修飾后的工程菌在保持其正常生長代謝不變的情況下，L-丙氨酸的濃度大幅降低且L-色氨酸含量明顯提高，表明L-丙氨酸的合成碳流被重新定向形成L-色氨酸。

本研究成功構建了兩種L-丙氨酸轉氨酶AlaA和AlaC 缺失的工程菌株E. coliFS-T4，該工程菌并非L-丙氨酸轉氨酶完全缺失型菌株，因此不需要額外添加L-丙氨酸就能保證菌株的正常生長代謝且一定程度地提高了目標產物L-色氨酸的產量，既節約了成本又避免了培養基的復雜化，也為后續工業化生產L-色氨酸提供了理論基礎及應用價值。丙氨酸作為細胞內氨基酸池的重要氨基供體，L-丙氨酸合成的減少也可能對其它代謝產物產生一定影響。因此，在后續的研究工作中，我們將通過轉錄組及代謝組學的手段對胞內相關酶的轉錄及主要產物進行分析以探究代謝修飾對其產生的影響，并以此為理論基礎有針對性的通過系統生物學的策略進一步提高L-色氨酸的產量。

4 結論

本研究以大腸桿菌工程菌E. coliFS 為出發菌株，利用Red 重組技術成功敲除與L-丙氨酸合成相關的兩個關鍵L-丙氨酸轉氨酶基因alaA和alaC，搖瓶結果顯示L-色氨酸產量可達6.08 g/L，提高了26.7%；丙氨酸含量0.16 g/L，降低了91.0%；最終菌體生物量與原始菌株基本一致。在50 L 罐中補料分批發酵試驗，結果顯示L-色氨酸產量及糖酸轉化率最高可達41.9 g/L 和20.5%，分別較出發菌株提高了13.8%和5.1%。L-丙氨酸的積累大幅下降的同時，L-色氨酸的含量大幅提高。