磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C 的異源表達和應用

林美璇 周小滿 關鋒 崔文璟

（1. 江南大學生物工程學院，無錫 214122；2. 西北大學生命科學學院，西安 710069）

磷脂酶C 是一種可以水解磷脂的酶［1］，近年來對磷脂酶C 在油脂的酶法脫膠方面應用的研究非常廣泛［2］。磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（Phosphatidylinositol-specific phospholipase C，PIPLC）是眾多磷脂酶C 中的一類，可以特異性作用于磷脂酰肌醇（PI，PIP，PIP2）的磷酸二酯鍵，使之分解為結合在膜上的二酰甘油（Diacylglycerol，DAG）和水溶性磷酸肌醇（InsP，InsP2，InsP3）。PIPLC 普遍存在于原核生物和真核生物體內，其中來源于真核生物的PI-PLC 分子量通常為85-150 kD，在高等生物體內PI-PLC 在多種受體介導的信號轉導通路中扮演著重要的角色［3］。

大多數來源于原核生物體的PI-PLC 分子量為30-35 kD，來源于原核生物和真核生物體的PI-PLC的催化結構域極為相似，但催化結構域中不同的部分導致二者來源的PI-PLC對底物的作用略有不同［4］，其中微生物中的PI-PLC 可以直接專一作用于PI，而真核生物中的PI-PLC 作用時需要Ca2+等調節因子的輔助且還可以作用于底物磷脂酰肌醇4，5-二磷酸酯（PIP2）［5］。PI-PLC 在蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌等微生物中表達量較高。值得一提的是來自蠟狀芽孢桿菌的PI-PLC的晶體結構顯示該酶由具有TIM 桶型結構的單個結構域組成，其與哺乳動物PI-PLC 的催化結構域非常相似［6］，與人類致病性寄生蟲布魯斯錐蟲產生的糖基磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（GPI-PLC）有很高的序列相似性，與其它大多數微生物來源的PI-PLC 不同的是，來自致病菌蠟狀芽孢桿菌的PI-PLC 并不作為毒力因子［7］。

糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白（Glycosylphosphatidylinositol-anchored protein，GPI-AP）普遍存在于細胞表面，蛋白通過GPI 錨固定在細胞膜上。GPI 錨主要結構為一分子磷酸乙醇胺、一分子磷脂酰肌醇以及一個聚糖核心［8］。目前已經在哺乳動物細胞中鑒定出150 多種GPI-APs，這些蛋白在哺乳動物的生長發育過程中起著重要作用，而這些蛋白錯誤的翻譯后修飾可能會引發多種疾病［9］。由于PI-PLC 可以作用于磷脂酰肌醇，可以將GPI-APs 從細胞膜上釋放出來［10-11］，因而PI-PLC 也被應用于對細胞表面GPI-APs 的研究和鑒定。另外，有證據表明，寄生蟲表面存在大量GPI-APs，其中一些GPI-APs 與寄生蟲感染宿主細胞這一過程密切相關［12］，因此利用PI-PLC 替代抗生素來抵抗寄生蟲具有廣闊的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒與細胞系 大腸桿菌DH5α 感受態、大腸桿菌BL21 感受態購于天根生化科技（北京）有限公司；表達質粒pGEX-6P-1 由本實驗室保藏。膀胱癌細胞KK47 由美國華盛頓大學SI Hakomori 院士惠贈。

1.1.2 酶及相關試劑 高保真聚合酶2×Phanta Max Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內切酶BamH I、EcoR I 購于NEB；DNA marker、solution I 購自日本TaKaRa 公司；質粒小量提取試劑盒購于Magen（美基）生物；DNA片段純化試劑盒、膠回收試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司；氨芐青霉素、紅霉素購自上海生工生物工程有限公司；Protein marker 購于賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）；p-nppc 購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；GST 標簽蛋白純化試劑盒購于碧云天試劑公司；CD59 抗體購于美國SantaCruz Biotechnology 公司；HRP 標記二抗、ECL 發光試劑購自碧云天公司，其它試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 PI-PLC 基因的合成 以NCBI 數據庫報道的來源于蠟狀芽孢桿菌的PI-PLC 基因（GenBank：M30809.1）為模板，根據大腸桿菌的密碼子偏好性進行優化后，由北京擎科新業生物技術有限公司完成基因合成。

1.2.2 PI-PLC 基因的克隆 利用Snap Gene 軟件以合成的基因片段為模板設計基因擴增引物P1（5′-CGGGATCCATGGCAAGCAGCGTTAA-3′ 下 劃 線處為BamH I 酶切位點）和P2（5′-GGAATTCCTCGA GTTCTTTAATCAGGCTT-3′下劃線處為EcoR I 酶切位點）。引物合成由北京擎科新業生物技術有限公司完成。

以合成基因為模板，以P1/P2 為引物進行PCR擴增。擴增體系如下：1 μL PI-PLC 合成基因，上游引物和下游引物各5 μL，2×Phanta Max Master Mix 25 μL，滅菌的雙蒸水14 μL。PCR 擴增條件為：95℃預變性30 s；95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸1 min，29 個循環后72℃延伸5 min。利用瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產物進行分析，利用DNA片段純化試劑盒對擴增的PI-PLC 產物進行純化。

1.2.3 重組大腸桿菌表達載體的構建 提取表達質粒pGEX-6P-1，利用限制性內切酶BamH I 和EcoR I對純化后的目的基因和表達質粒pGEX-6P-1 在37℃條件下進行酶切處理，純化回收，利用solution I 于16℃金屬浴中連接3 h。將連接產物轉化至E.coliDH5α 感受態細胞，利用含有氨芐抗性的LB 固體培養基平板進行篩選，挑取平板上帶有氨芐抗性的單菌落，利用質粒pGEX-6P-1 測序引物進行菌落PCR，選取擴增出與目的基因大小相同片段的轉化子擴大培養，將重組子的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序正確的質粒命名為pGEX-6P-1-PI-PLC，提取測序正確的質粒并將其轉化于E.coliBL21（DE3）中，將轉化子保存于-80℃甘油管中。

1.2.4 重組大腸桿菌的誘導表達、純化及SDSPAGE 凝膠電泳檢測 將重組大腸桿菌pGEX-6P-1-PI-PLC/DE3 及對照于氨芐抗性LB 培養基37℃、200 r/min 條件下過夜培養。以5%接種量將重組菌轉接至20 mL 氨芐抗性LB 培養基，37℃、200 r/min 條件下培養至菌液長至OD600nm為0.6-0.8 時，加入誘導劑IPTG 于16℃進行誘導（終濃度0.1 mmol/L），12 h 后將收集到的菌液以6000 r/min 離心10 min 收集菌體，用4 mL 濃度為Tris-HCl（pH7.2）緩沖液重懸菌體，冰浴破碎至菌體澄清，14000 r/min、4℃離心15 min，收集上清液。

根據GST 純化試劑盒說明書對PI-PLC 進行純化，把純化液加入10 kD 離心管，6000 r/min 離心10 min 對目的蛋白進行除鹽、濃縮。取30 μL 純化液，加入5×loading buffer，100℃水浴加熱10 min。用5%濃縮膠、10%分離膠進行SDS-PAGE 電泳分析，鑒定目的基因是否表達。

1.2.5 PI-PLC 比酶活的測定 由于PI-PLC 可以水解甘油磷脂結構類似物對硝基苯酚磷酸膽堿（p-NPPC）產生對硝基苯酚（有色基團），對硝基苯酚在410 nm 處有最大吸收峰，可以用p-NPPC 為底物測量PIPLC 酶的酶活［13］。首先繪制對硝基苯酚標準曲線：用濃度為25 mmol/L Tris-HCl（pH7.2）分別配置8 nmol/mL、12 nmol/mL、20 nmol/mL、40 nmol/mL、60 nmol/mL 濃度的對硝基苯酚，取200 μL 上述溶液并利用酶標儀測量其在410 nm 處的吸光值。

在含有濃度為25 mmol/L 的Tris-HCl（pH7.2）、10 mmol/L 濃度的p-NPPC 的反應體系中加入20 μL發酵酶液，37℃條件下反應30 min 后立即用酶標儀測量反應液在410 nm 處的吸光度，通過吸光值計算反應產生的對硝基苯酚進而計算PI-PLC 酶的活性。酶活定義為：在pH7.2、37℃的條件下，每分鐘水解p-NPPC 產生1 nmol 的對硝基苯酚所需的酶量為1 個酶活力單位（U）。

利用BCA 法繪制標準蛋白濃度曲線并測定純化后酶的蛋白濃度，進而計算出比酶活。

1.2.6 誘導表達條件的初步優化 此實驗在方法1.2.4 的基礎上通過改變誘導時間、誘導劑IPTG 濃度、誘導試劑、接種量等單因子進行誘導表達條件優化。根據方法1.2.5 測定單位體積發酵液的酶活，每個因素做3 個平行。

1.2.7 細胞培養與處理 KK47 細胞在含10%體積分數胎牛血清、1%體積分數青霉素和鏈霉素的RPMI1640 培養基中，37℃、5%體積分數CO2環境下培養。

細胞生長至80%融合度后，用生理鹽水清洗細胞，加入200 μL PI-PLC 純化液37℃處理1 h，處理后用PBS 緩沖液清洗細胞表面。

1.2.8 PI-PLC 處理細胞并用Western blot 技術進行檢測 用RIPA 緩沖液（1%體積分數NP-40、0.5%體積分數脫氧膽酸鈉、1%體積分數SDS、0.1%體積分數PMSF）裂解細胞，BCA 法測定樣品蛋白濃度進行定量，SDS-PAGE 電泳，轉膜，3%體積分數胎牛血清蛋白封閉，CD59 抗體（用PBS 1 ∶1000稀釋）4℃雜交過夜，PBST 洗膜后加入適量HRP 標記的二抗室溫溫育1 h，進行ECL 顯色。

1.2.9 流式檢測 將細胞分為陰性對照組（細胞用4%質量分數多聚甲醛固定，用二抗孵育）、PI-PLC處理組（細胞用4%質量分數多聚甲醛固定，用100 μL PI-PLC 純化液于37℃條件下處理30 min，孵育CD59 抗體，孵育二抗）、未用PI-PLC 處理組（細胞用4%質量分數多聚甲醛固定，孵育CD59 抗體，孵育二抗）流式細胞術分析PI-PLC 對細胞表面的CD59 的酶切情況。

2 結果

2.1 目的片段與基因表達載體的獲得與鑒定

根據NCBI 數據庫中來源于蠟樣芽孢桿菌的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C 基因成熟肽部分為模板，根據大腸桿菌密碼子的偏好性對基因進行密碼子優化，并合成優化序列。以合成基因為模板，利用PCR 對目的基因進行擴增，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，發現在1000 bp 處有明顯條帶（圖1-B）。

圖1 基因表達載體pGEX-6P-1-PI-PLC 的構建

2.2 基因表達載體的構建

利用重組質粒的酶切位點BamH I 和EcoR I 來鑒定目的基因PI-PLC 是否在質粒上正確連接。提取質粒并酶切處理后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現一條1000 bp 左右目的基因片段和一條5000 bp左右的載體片段，與預期相符，結果如圖1-A 所示。載體測序結果正確。

2.3 PI-PLC在大腸桿菌中的表達

將重組質粒轉入大腸桿菌感受態表達菌株BL21（DE3）中，根據1.2.4 的方法誘導大腸桿菌表達PIPLC。構建的重組菌成功表達出分子量約為61 kD 帶有GST 標簽蛋白的重組蛋白（圖2）。

2.4 利用GST標簽蛋白純化PI-PLC

使用GST蛋白純化試劑盒對目的蛋白進行純化，利用SDS-PAGE 對純化結果進行檢測。發現目的蛋白主要存在于誘導后的重組菌裂解液上清中，純化過程中目的蛋白損失較少，得到的目的蛋白純度較高（圖2）。

圖2 利用SDS-PAGE 鑒定重組蛋白的誘導表達和純化

2.5 誘導表達條件的初步優化及比酶活測定

誘導時長、接種量、誘導時機、誘導時誘導劑濃度的不同對單位體積發酵液酶活的影響如圖3 所示。根據1.2.6 的方法改變不同單一變量并測定單位體積發酵液酶活的變化從而確定最佳誘導表達條件。不改變其他條件，選取發酵時長分別為12 h、24 h、36 h、48 h，當誘導時長為24 h 時單位體積發酵液的酶活達到最高值1039.77 U/mL（圖3-A）；保持其他條件不變，分別選取發酵液接種體積分數1%、3%、5%、7%、9%，當發酵液接種體積分數為5%時，單位體積發酵液的酶活最高，可以達到1807.67 U/mL（圖3-B）；不改變其他條件，菌體在600 nm 下吸光值分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 時開始誘導，當菌體在600 nm 下吸光值為0.5，單位體積發酵液的酶活最高，可以達到900.67 U/mL（圖3-C）；保持其他條件不變，誘導劑濃度分別選取0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、0.7 mmol/L、0.9 mmol/L，當誘導劑濃度為0.3 mmol/L 時，單位體積發酵液的酶活最高，為1353.28 U/mL（圖3-D）。綜合上述結果，本研究以接種體積分數5%接種，待菌體生長OD600nm達到0.5，以0.3 mmol/L 濃度IPTG 誘導24 h為最佳誘導表達條件。

在最佳條件下發酵PI-PLC 并純化，純化后酶的質量濃度為0.52 mg/mL，20 μL 純化酶液含有酶活為14 U，經計算比酶活為1322.5 U/mg。

圖3 誘導表達條件的初步優化

2.6 用PI-PLC處理膀胱癌細胞

CD59 是一個典型的GPI 錨定蛋白，普遍存在于哺乳動物細胞表面，可以通過檢測CD59 的表達情況衡量PI-PLC 對GPI 錨定蛋白的酶切效果，實驗設計如圖4-A 所示。將培養過夜的膀胱癌細胞KK47經PI-PLC 酶液處理后，提取細胞蛋白，經SDSPAGE 和Western blot 檢測，結果（圖4-B）顯示經PI-PLC 酶處理后，細胞樣品中GPI 錨定蛋白CD59的表達明顯減少。同樣，將酶切處理的細胞上樣至細胞流式儀，可以明顯觀察到經酶切處理細胞的GPI 錨定蛋白CD59 的表達顯著減少（圖4-C）。由此證明本文表達的PI-PLC 可有效地將GPI 錨定蛋白從細胞膜上釋放下來。

3 討論

國外對磷脂酶C 的基因序列、結構、功能、酶學性質及應用等相關研究開始較早，對細菌來源的磷脂酶C 在不同體系內的克隆表達和其在工業和醫學方面的應用也有報道［14-15］。相比較而言，國內對細菌來源的磷脂酶C 尤其是磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C 的研究較少，主要集中在磷脂酶C 在油脂脫膠、飼料抗蟲等方面的應用研究。2016 年，湯先澤［16］對磷脂酰肌醇進行了異源表達，并對其粗酶液的抗雞球蟲效果進行了初步分析；2019 年，鄒全等［17］對磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C 和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C 在枯草芽孢桿菌中進行表達，并利用其粗酶液對兩種酶的酶學性質進行了分析并應用于油脂脫膠，然而，對磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C 的純化及其酶活性研究較少。同時，GPI 錨定的形式可以使細胞膜表面結合更多蛋白［18］，其中哺乳細胞中的一些細胞粘附分子、淋巴細胞分化抗原、補體調節蛋白等具有一定功能性的蛋白通過GPI 錨定的形式存于細胞膜表面［19］，這些蛋白和哺乳動物的很多生理過程息息相關［20］，然而對GPI 錨定蛋白的研究還遠遠不夠。磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C 可以專一作用于GPI 錨定蛋白的磷脂酰肌醇的磷酸二酯鍵，進而使GPI 錨定蛋白從細胞膜上釋放下來。表達和純化高效的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C，從而將其更好地應用于對GPI 錨定蛋白的研究與鑒定中，可為研究GPI 錨定蛋白的生物學功能等提供有效幫助。由于本實驗中PI-PLC 來源于蠟狀芽孢桿菌，其結構與哺乳動物體內切割GPI 錨定蛋白的酶結構具有相似性，且不作為毒力因子［21］，因此后續工作可把磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C 在細胞生物學實驗中進行應用。

圖4 利用PI-PLC 處理膀胱癌細胞表面的CD59

4 結論

本實驗實現了來源于蠟樣芽孢桿菌的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C 基因在大腸桿菌BL21（DE3）中的可溶性表達。最終該帶有GST 融合標簽的重組磷脂酶C 在最佳誘導表達條件下發酵并純化后的質量濃度為0.52 mg/mL，比酶活為1322.5 U/mg。實驗結果表明，所獲PI-PLC 可將GPI 錨定蛋白從細胞表面釋放下來。