核酸切割酶在病原微生物檢測中的研究進展

王昕 朱龍佼 許文濤，3 翟晨 王書雅 黃蔚霞

（1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2. 中國農業大學食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100083；3. 農業部農業轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083；4. 中糧營養健康研究院有限公司 營養健康與食品安全北京市重點實驗室老年營養食品研究北京市工程實驗室 北京市畜產品質量安全源頭控制工程技術研究中心，102209）

病原微生物是一種可以導致動物、植物和人類疾病的微生物。常見的病原微生物包括瘧原蟲、人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli，簡稱E.coli）和沙門氏菌等［1］。食源性疾病每年造成數百萬人住院甚至死亡，極大地危害人類和動植物的健康，造成巨大的經濟損失。為了預防這種食源性病病暴發和盡量減少其持續流行所造成的影響，需要開發一種快速、靈敏及低成本的檢測方法在食源性病病出現的早期階段準確地識別致病病原體。雖然現在有很多病原體的檢測方法，但幾乎都無法同時滿足以下5 個要求：高特異性（只檢測目標細菌）；高靈敏度（能檢測到單個活細菌細胞），短時間出結果（幾分鐘到幾個小時）；操作簡單（不需要冗長的取樣過程和使用專門的設備）及較低成本。例如，傳統的病原微生物檢測方法需要較為復雜的步驟［2］，包括分離培養及一系列生化測試，且檢測時間很長（通常是5-7 d 乃至更長時間），所以不能很好地應用于現場快速測試［3］。而基于PCR 和抗體的技術雖然提供較短的時間（幾小時到幾天），但需昂貴的試劑和復雜的設備［4-6］。因此，亟待開發新的病原微生物檢測方法以滿足實際需求。

近年來，生物傳感器因其快速、靈敏及高特異性的特性已逐漸被用于病原微生物檢測［7］。生物傳感器是一類通過生物活性物質間特異性識別產生的生物信息元素結合適當的理化換能器（如氧電極、光敏管、場效應管及壓電晶體等）及信號放大裝置構成的分析工具或系統［8］。迄今為止，抗體因其在生物傳感器中具有高親和力和高特異性而成為應用最廣泛的生物識別元素。然而，但抗體存在如篩選過程復雜，價格昂貴，易變性失活和相對嚴苛的檢測環境要求缺點［9］。例如，現在市面上的顯色或者層析表征的微生物快速檢測產品，其顯色或者層析的方法原理基于抗體的免疫學技術。如酶免疫檢測（Enzyme immunoassay，EIA）法，分為均相法及非均相法，其分類依據為檢測中抗原體反應是否需要對酶標記物進行分離結合及游離。非均相法是目前常用的酶免疫檢測方法，其代表方法為酶聯免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技術，固相載體吸附抗體或抗原后進行免疫酶染色，待底物顯色后對有色產物進行定量或定性分析，從而確定樣品中是否含有目標微生物及其數量［10］，檢測迅速，但試劑昂貴和設備的復雜；免疫層析技術（IC），其原理為利用毛細管作用，在條狀纖維所制膜上（含有相應配體）使樣品泳動，目的在于使樣品與膜上特定區域配體結合，利用酶促顯色反應或直接著色標記物獲得直觀結果［11］，該方法目前已開發出針對性的試紙條應用于食品微生物檢測中，快速但無法進行定量檢測；免疫熒光（Immunofluorescence，IFT）法，在抗體或抗原上標記熒光色素，待相互結合后于熒光顯微鏡下利用熒光反應觀察結果［12］，此方法也需要昂貴的試劑，而且所用熒光色素對待檢樣品中目標微生物活性造成影響；酶聯熒光免疫法（Enzyme-linkedfluorescent immunoassay，ELFIA），將酶免疫與熒光免疫結合，利用合適的熒光底物代替生色底物后進行酶免疫分析，可有效擴大檢測范圍及減少試劑使用量，但試劑昂貴和設備復雜［13］。因此，仍需要探索新的具有高度特異性和克服的微生物抗體缺點的生物識別元件來進行微生物檢測。已有研究表明，核酸切割酶作為一種新型分子探針正好可以很好地克服微生物抗體的缺點［14］。

核酸切割酶是一類具有酶活性的功能核酸［15］，可通過富集配體系統進化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術（體外篩選技術是一種從隨機單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質高度親和的核酸適體）得到，與靶物質有很高的特異性響應［16-17］。從核酸的隨機序列文庫中分離出來后［18］，以不同的靶標以及各種各樣的結合條件在序列庫中進行篩選［19］。

指數富集（SELEX）相對于蛋白酶、核酸切割酶不僅具有很高的催化活性，且穩定性好、易于修飾、合成價格便宜、對環境影響小。核酸切割酶在靶物質存在的情況下可水解RNA 底物磷酸二酯鍵［20］，以適當的理化換能器進行信號輸出，如熒光法［21-23］、電化學法［22］及比色法［24］等。然而，這些方法大部分需要對核酸切割酶或底物鏈進行標記或修飾，增加了檢測成本與操作復雜程度。此外，實際樣品中的復雜基質容易引起較高的背景信號而影響檢測的靈敏度。所以，將核酸切割酶介導的生物傳感體系與相對成熟的等溫信號放大技術結合，建立簡便、高靈敏度的檢測新方法無疑成為了一種趨勢。

1 微生物介導的核酸切割酶介紹

核酸切割酶是一種DNAzymes（又稱脫氧核酶），是具有催化活性的單鏈DNA 分子。DNAzymes 在自然界中不存在，但可以通過SELEX 技術從隨機序列的核酸文庫（ssDNA 或RNA）中分離出來。目前為止，關于DNAzymes 催化的各種化學反應已有報道。尤其是“核酸切割酶”，其活性高度依賴于給定的化學或生物刺激，所以可以結合配體反應的DNAzymes設計生物傳感器。同時作為DNA 分子，核酸切割酶能與DNA 擴增完全相容，最終提高檢測靈敏度［25］。據此綜述了幾種生物傳感器，對其中的核酸切割酶與微生物的結合原理進行分類總結，并闡述近年來微生物介導的核酸切割酶的發展，以期為實現微生物快速檢測提供方法依據。

微生物切割酶是通過體外SELEX 篩選技術獲得可以特異性識別微生物樣品中靶標的一類核酸。SELEX 技術5 個步驟：組合、分離、洗脫、擴增和調節。首先將1013-1015個隨機序列的核酸文庫與靶分子一起孵育，然后分離結合的ssDNA 或RNA。洗脫和收集復合物，通過聚合酶鏈反應（PCR）擴增生成用于下一循環的ssDNA 或RNA。對于每個靶標，進行6-20 個連續循環后測序以獲得所需的微生物切割酶［26］，然后分析序列得到共有基序，并對應于靶特異性結合篩選所需的最小序列［27］。SELEX 技術選擇的微生物切割酶不僅可以與具有高親和力和特異性的分子結合，還能進行化學修飾，通過調控其結合特性以捕獲更多的目標分析物，可更好地應用于病原微生物檢測［28］。

但是由于病原微生物構成復雜，所以實際應用中微生物切割酶SELEX 篩選多采用完整的細胞作為靶標，但這種靶標通常會出現靶位點多、不易篩選出高特異性的核酸切割酶等問題。為了解決這些問題，在正篩選同時增加使用兩種或多種同源微生物細胞進行負篩選，以得到針對目標微生物的具有高特異性的切割酶［29-33］。DNAzyme 選擇和特異性是通過使用細胞外粗混合物（Calcium-enriched mixture，CEM）作為陽性選擇步驟中的靶標和來自一種或多種非預期細菌的CEM 作為靶標進行的［34］。SELEX技術的優勢在于：第一，以來自細菌病原體未純化的生物樣品作為衍生配體響應切割酶的靶標，以此確保復雜生物樣品中所選切割酶的功能；第二，雙重篩選具有更好的特異性（圖1）。Cao 等［30］以金黃色葡萄球菌作為靶標，同時使用鏈球菌和表皮葡萄球菌進行負篩選，結果證明負篩選能很大程度地提高篩選特異性。

1.1 微生物切割酶結構

圖1 在正負篩選條件下選擇的RNA 切割DNA 酶［25］

如圖2 所示，微生物切割酶與它相互作用的RNA 底物通過形成兩個Watson-Crick 雙面綁定臂在結合靶標后可以輕松實現底物鏈斷裂（即RNA 切割核酸切割酶）［31］。核酸切割酶切割底物鏈產生兩個短片段，在各自的短鏈上進行化學修飾可以表征鏈分離，或者還可以通過凝膠電泳對裂解后混合物進行膠表征分析切割產物。

圖2 微生物介導的核酸切割酶結構［31］

1.2 微生物切割酶機制與產物

核酸切割酶一般分為全DNAzyme 及具有RNA切割位點的DNAzyme（rDNAzyme）。但現有的大多數文獻報道是基于RNA 切割DNAzyme 的研究，據此推測其原因如下：一是RNA 切割DNAzyme應該具有催化效率，因此生物傳感器的響應這些DNAzyme 進行工程改造的時間相對較短［35］；二是RNA 將含RNA 的底物鏈條分成兩部分，需要設置一種較為簡單的方式來耦合選擇信號的的生物傳感平臺。

首先核酸切割酶是金屬離子依賴性RNA 切割DNAzyme，用SELEX 技術從隨機序列DNA 庫中分離（圖3）［36］。這是因為帶有帶負電荷的糖-磷酸二酯骨架［14］和富含電子的核堿基的DNA 能很好地與帶正電的金屬離子相互作用［37］。

圖3 金屬離子依賴性的RNA 切割DNAzyme［36］

微生物依賴RNA 切割DNAzymes 也逐漸被發現，這些微生物切割酶可以被微生物樣品中極為復雜的靶標激活（圖4）［38］，其靶分子通常為病原微生物細胞表面的分子［39］，細胞的特異性蛋白裂解物［40］，或全細胞［26］。

這種DNAzyme 實現RNA 切割活性實質上是切割單個核糖核苷酸的磷酸二酯鍵，然后以2′-OH 基團裂解磷酸二酯作為親核試劑作用磷酸二酯中的5′-氧，靶分子作為輔因子嵌入DNA 序列導致兩次裂解片段，一個片段具有2′-3′環狀磷酸酯末端；另一個具有5′-OH 末端（圖5）［31］。

圖4 微生物介導的核酸切割酶的結構及切割過程的結構變化［38］

1.3 微生物切割酶的靶標

RFD-EC1 僅在大腸桿菌產生的CEM 存在時（CEM-EC）實現切割［41-42］，其序列為CACGGATCC TGACAAGGATGTGTGCGTTGTCGAGACCTGCGACCG GAACACTACACTGTGTGGGATGGATTTCTTTACAGT TGTGTGCAGCTCCGTCCGACTCTTCCTACCFRQGGTT CGATCAAGA。RFD-CD1 則針對艱難梭菌Clostridium difficile（C.difficle）未純化的分子反應混合物實現切割［43］，其序列為GATCTGAGTGGATTGGGGCCTGC GCGGAGTCGGGACTATT。

細菌病原體大腸桿菌分泌蛋白的檢測模型DNA索烴生物傳感器如圖6 所示［44］，借鑒RFD-EC1 得到其活性序列：ACTCTTCCTACCFRQGGTTCGATC。

ATP 特異性的變構RNA 切割DNAzyme pH6-ET4 及其同源靶標轉換成為肉眼可見的比色信號，RNA 裂 解 變 構DNAzyme 如圖7 所示［45］。阮 病 毒蛋白（PrPC）特異性的切割DNAzyme 與靶標結合，RNA 裂解莖環結構DNAzyme 如圖8 所示［46］。

1.4 微生物切割酶產物的表征

1.4.1 熒光表征 微生物切割酶應用在生物傳感器領域的表征方式除了最傳統的以核酸片段大小進行鑒定產物的凝膠電泳法表征方法之外，最常見的就是將核酸切割酶與具有熒光特性的物質結合，最終實現對靶標的熒光信號檢測［31］。首先，基于熒光的檢測實現高靈敏并且提供實時報告，然后將RNA 酶切DNAzyme 與熒光傳感器結合。RNA 切割DNAzymes 與底物形成兩個Watson-Crick 雙面綁定臂，切割底物鏈后產生兩個短片段脫離DNAzyme。熒光團和猝滅劑在各自的鏈上分離，裂解后混合物產生熒光（圖9-1）。

圖5 DNAzyme 實現RNA 切割原理圖［31］

圖6 rD2C1，DP1 和DP2 的序列［44］

圖7 “pH6-ET4”的構象，一種ATP 依賴性變構DNAzyme［45］

圖8 莖環結構的序列［46］

1.4.2 擴增放大型表征 事實上，生物傳感器只依靠受體-配體相互作用不足以在極低濃度下檢測目標分析物，如人類的早期疾病診斷或檢測痕量的污染毒素或食物和水中的病原體。為了有更好的靈敏性和穩定性以適應真實樣品檢測［47-48］，Li 團隊［31］認為這種生物傳感方法應該有更強大的釋放信號的機制：使用擴增策略。例如，RCA 能在短時間等溫擴增大量DNA 分子［49］并且不需要特殊設備［25］。RCA 反應通過DNA 聚合酶復制環狀模板［50］，需要使用phi 29 聚合酶，DNA 引物和環狀模板，然后將DNAzymes 與環狀模板（圖9-2-B）或引物（圖9-2-C）混合起來就可以發生擴增：當環狀DNA 模板被設計為互補序列時，RCA 反應將產生大量與環狀模板互補的串聯重復長單鏈DNA［51］（圖9-2-A）。

設計兩個單鏈DNA 環拓撲連接在一起，由于強連接雙鏈體擁有顯著的拓撲約束，DNA 組裝防止每個組件環充當模板RCA。但是，當其中一組分環被設計成RNA 切割DNAzyme 的底物，DNAzyme 可使該環線性化，從而消除拓撲結合并啟用RCA（圖9-3）。這個設計用來進行大腸桿菌靈敏檢測［45］。

切割DNAzymes 和RCA 也可組裝成交叉放大系統編碼MgZ 的模型［31］。兩個DNA 復合物都包含相同的圓形模板，但是線性DNA 分子不同（圖9-4-A）［52］。線性復合物I 上的DNA 分子完全互補圓形模板作為RCA 引物。線性的復合物II 上的DNA 分子僅與圓形模板部分互補，并且設計為具有兩個功能：它被DNAzymes 切割并進一步通過phi29 DNA 聚合酶后進行RCA，產生了串聯重復的MgZ 單元。然后產生的MgZ DNAzymes 結合并裂解復合物II 中的底物，裂解產物隨后轉化為RCA 的引物（圖9-4-B）。這種新的放大系統被稱為“DNAzymes 反饋擴增（DFA）”。DFA 成功實現了microRNA（miR-21）和細菌病原體（大腸桿菌）超靈敏檢測，檢測限比傳統RCA 方法提高3-6 個數量級。對于miR-21 檢測，microRNA 本身用作復合物I 中的引物。對于大腸桿菌檢測，使用修飾的復合物，其中線性DNA 分子被設計成為大腸桿菌特異性DNAzyme：RFD-EC1，RFD-EC1 為復合物I 提供所需的引物，使DNA 擴增完全依賴于大腸桿菌的存在（圖9-4-C）。

圖9 微生物切割酶產物的表征原理圖

2 微生物切割酶介導的光學傳感器

2.1 RNA裂解熒光DNAzymes傳感器

Li 等建立了RNA 裂解熒光DNAzymes（RNAcleaving fluorescent DNAzymes，RFDs）的體外篩選程序；RFDs 作為分析工具的作用機理如圖10-1［53-56］。RFDs 催化一個嵌合在底物的單獨的核糖核苷酸接合點（R）裂解，由于R 被熒光團（F）和猝滅劑（Q）包圍，所以裂解時F 和Q 分離，熒光強度的顯著增加。用于細菌檢測的RFDs 是從目標微生物中篩選得到的高特異性的切割酶（過程可能需要數月或數年才能完成）。這些特殊的RFDs 會在特定細菌環境或培養基中留下的原始細胞外混合物（CEM）的情況下“發光”（圖10-1），而RFD 僅在大腸桿菌產生的CEM 存在時（CEM-EC）實現切割［14］，所以這個E.coli傳感RFD，命名為RFD-EC1，同時實驗確認RFD-EC1 對來自其他細菌的CEMs 沒有反應。同樣的方法，獲得了一個RNA 裂解熒光DNAzyme（RFD），可以識別C.difficle。這種DNAzyme 即RFD-CD1 不僅與其他細菌沒有交叉反應，同時對艱難梭菌具有高度的菌株特異選擇性。RFD-CD1 也是由體外選擇方法偶聯消減交叉反應的負篩選獲得［57］。

Didar 和Yousefi 等［58］組裝了一種傳感器材料，這種材料可用于食品包裝，能在特定的情況下針對靶細菌產生熒光信號從而實現監測微生物污染的各類食品，同時無需從包裝中取出樣品或傳感器。該傳感器是通過共價連接大腸桿菌特異性RNA 切割熒光的微陣列DNAzyme 探針（RFD-EC1）在透明的環烯烴聚合物（COP）薄膜（圖10-2）。實驗結果證明了（RFD-EC1）-COP 表面是特異性的，在各種pH 條件下（pH 3-9）能穩定14 d 甚至更長時間，并且在肉和蘋果汁中的大腸桿菌的檢測限低至103CFU/mL。發達國家的包裝實時監測病原體生物傳感器檢測易腐食品有很高的準確性。這些傳感器努力減輕食源性疾病對公共衛生的負面影響，將來有希望為降低食源性疾病發病率作出重大貢獻。

另外，RFDs 還用于特異性識別腫瘤細胞，與傳統的檢測方法相比，RFDs 檢測過程簡單、耗時短、且特異性高。如圖10-3 所示，He 等［59］構建的RNA-cleaving DNAzymes 熒光切割核酶用于特異性識別乳腺癌細胞MDA-MB-231，同樣DNAzyme 特異性識別并結合乳腺癌細胞MDA-MB-231，與DNAzyme形成特定的二級結構，激活DNAzymes 切割活性，釋放熒光基團產生熒光信號，MDA-MB-231 的檢測限為0.5 μg/mL。另外，結果表明該RNA-cleaving DNAzymes 熒光探針的定向切割作用有望用于乳腺癌的診斷和治療。

2.2 變構DNAzyme（allostericDNAzyme）傳感器

有學者通過使用RCA、PNA 和DiSC2（5）［46］，將變構RNA 切割DNAzyme 及其同源靶標轉換成為肉眼可見的比色信號［60-66］。如圖10-4 所示。3 個關鍵設計實施：RNA 裂解變構DNAzyme，RCA，以及基于比色報告機制肽核酸（PNA）和有機染料在靶標存在的情況下，變構酶切割一種特殊的含RNA 的底物并釋放出一種可用于phi 29 DNA 聚合酶的DNA 分子引發RCA 反應的引物，用于產生α 長ssDNA 分子。因為PNA 分子與其互補DNA 序列形成高度穩定的雙鏈體結構，藍色的DiSC2（5）結合DNA/PNA 雙鏈體后顏色變化為紫色［67-71］，所以檢測RCA 產物與PNA 和DiSC2（5）（3，3′-二乙基硫代二羰基菁）互補雜交后顏色變化。

2.3 索烴（Programming a topologically constrained DNA nanostructure in to a sensor）傳感器

Liu 等［44］設計的DNA 納米結構使用機械互鎖拓撲結構連接各個DNA 組件形成強連接雙鏈體。這種結構的存在也構成了一個顯著拓撲約束的組件環。實驗確認具有強連接雙鏈的DNA 索烴可防止組分環作為RCA 的擴增模板。但是，通過使用含有RNA 的DNA 索烴具有強連接雙鏈體，實驗表明促發RNA 切割DNAzyme 可以使一個組分環線性化，從而實現RCA（圖10-5）。本研究中DNA 索烴生物傳感器是應用于細菌病原體大腸桿菌分泌蛋白的檢測限為10 個細胞/mL，為將來機械互鎖DNA 納米結構的進一步應用建立了一個新的平臺。

2.4 莖環結構酶傳感器

Xiao 等［46］采用莖環結構酶組裝的熒光傳感器檢測阮病毒蛋白（PrPC）（圖10-6）。在莖環結構的5′端修飾熒光體，3′端的3 個DNA 堿基G（鳥嘌呤）實現76.6%的熒光猝滅率。當阮病毒蛋白（PrPC）與莖環結構酶結合時構象發生改變，3′端的鳥嘌呤遠離5′端的熒光體，釋放熒光，從而完成對阮病毒蛋白的檢測。該莖環結構酶組裝的熒光傳感器的檢出限為0.3 μg/L。

3 結語與展望

核酸切割酶與生物傳感器結合不僅限于比色試驗。例如，Xiang 等［71］已經發現核酸切割酶與口袋大小的個人血糖儀（PGM）量化非葡萄糖的目標檢測物。該方法的核心特征是目標誘導的轉化酶釋放（一種可以將蔗糖轉化為葡萄糖的蛋白質酶）固定轉化酶/DNA 綴合物。DNA 可以是配體響應性核酸切割酶，如UO2

2+依賴性核酸切割酶：當存在UO22+時，DNAzyme 切割其與轉化酶綴合的底物，釋放的轉化酶轉向隨后是蔗糖轉化為葡萄糖，并可由PGM 檢測到。熒光結合核酸切割酶與生物傳感器結合后會不斷發現不同的RNA 切割DNAzymes，這擴展的PGM可以用作低成本家庭護理或便攜設備檢測一系列和醫學或環境相關的目標物。

另一種被大家所熟悉的家庭護理設備是簡單的家庭妊娠試驗條帶（HPT），一種用于檢測人絨毛膜促性腺激素（hCG）-a 懷孕荷爾蒙的側向流動裝置。2017 年，Du 等［72］提出使用HPT 檢測DNA 的想法：使用環介導的等溫擴增（LAMP）和可編程的立足介導的鏈交換，與含有hCG 的融合報告蛋白結合，完成信號轉導。這種商業化的妊娠試紙最終可以實現DNA 檢測。雖然尚未完全證明，但相信通過使用配體響應性RNA 切割DNA 酶，可以擴展該方法以進行其他靶標檢測。

圖10 微生物切割酶介導的光學傳感器

由于核酸切割酶高穩定性、可循環催化、易合成、易功能化修飾的優點，以及可特異性識別金屬離子、中性分子、細菌等輔因子的特性，核酸切割酶被廣泛用于金屬離子和生物分子的檢測。雖然已有研究實現EC1 DNAzyme 體系中切割FS28 產生熒光信號的核酸切割酶固定在3D DNA 紙張傳感器［73］，但是目前基于核酸切割酶的金屬離子和病原微生物等檢測體系的應用還是相當有限，而對于實際現場操作，批量市場化仍有很長的一段距離。同時DNA 天然性質是水溶性且生物相容，意味著其可被用于生物醫學和生物技術領域的內置應用［74］，但是實際應用于生物體內的檢測仍需進一步的探索與驗證。因此要提高檢測體系的抗干擾能力及提高核酸切割酶在生物體內的穩定性仍需更深入的研究工作。此外，雖然可修飾RNA 序列已較好地應用于病原感染診斷和腫瘤基因治療領域［75-76］，但是核酸切割酶在人類疾病的研究領域屬于起步階段，包括核酸切割酶如何導入細胞與表達；核酸切割酶引入細胞后的穩定性；核酸切割酶結構的設計，特別是選擇合適長度的側翼和底物以及如何提高核酸切割酶的活性等方面均有待進一步探索和解決。可以借助快速發展的水凝膠技術，現已證明捕獲微米級長鏈DNA 可被包埋在二氧化硅材料的大孔內，使其能更充分地與高分子量靶標如蛋白質相互作用［77］，將來會進一步利用水凝膠材料和核酸切割酶結合構建藥物遞送體系，以高效地傳遞基因藥物到達腫瘤組織。