產瓦倫西亞烯釀酒酵母的表達載體適配及發酵碳氮源優化

陳和鋒 朱晁誼 李爽

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣州 510006）

瓦倫西亞烯（Valencene）是一種天然倍半萜化合物，瓦倫西亞烯又稱巴倫西亞橘烯，是一種具有似柑橘香氣的黃色液體［1］。瓦倫西亞烯常見于各類柑橘果實的精油中，被廣泛應用于香水、香皂等工業制造上［2］，而且許多倍半萜類化工品如高附加值化合物圓柚酮（Nootkatone）也是通過瓦倫西亞烯氧化合成。除此之外，由于它具有水果香味，在商業上可被用作飲料和食品的添加劑，市場的需求量每年可達10000 kg，另外每年還有5000 kg 瓦倫西亞烯用于合成圓柚酮［3］，因而應用前景巨大。

目前工業上獲得瓦倫西亞烯的方法主要是以柑橘精油為原料，通過蒸餾、萃取等工藝分離出來，但是由于柑橘果實中瓦倫西亞烯的濃度較低（按重量計為0.2%-0.6%），從柑橘精油中分離獲得瓦倫西亞烯的過程較為繁瑣且費用較高［4］。此外，由于柑橘精油是通過將柑橘榨汁后余下的柑橘皮冷榨而獲得的，而我國柑橘一般是以鮮果消費為主，柑橘榨汁工業并不發達，故也缺少它的副產物——柑橘精油，這便使得瓦倫西亞烯十分稀缺，價格昂貴，從而使瓦倫西亞烯的應用受到了極大的限制。

為了滿足瓦倫西亞烯愈發增長的需求，利用基因改造優化過的微生物細胞生產瓦倫西亞烯成為經濟可行的方法，因為微生物細胞具有生產周期短、培養成本低廉且發酵產物易分離等優點，可以避免在植物萃取過程中帶來的高能耗、低產量及環境污染問題。而真菌中的模式生物釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）則是目前最常用的基因表達宿主之一，且因為釀酒酵母是第一個完成基因組測序的真核生物，易于進行基因敲除，遺傳性狀也較為穩定［5-6］。因而我們需要研究萜類化合物在釀酒酵母體內的合成途徑，并尋找合適的載體進行構建。為了賦予酵母倍半萜合成能力，需要人為引入相應的外源倍半萜合成酶，這些外源合成酶大部分來源于芳香植物。

MVA 途徑是釀酒酵母體內合成各類萜類化合物的代謝途徑，從乙酰輔酶acetyl-coA 開始，經過一系列酶作用到達中間產物FPP，并經由不同的萜類合成酶生成相應的萜類化合物，如在角鯊烯合成酶（由erg9編碼）的作用下流向麥角固醇（Ergosterol）合成途徑，因而為了提高通往合成目的產物的FPP流量，可以減弱erg9基因的表達。但由于麥角固醇對酵母細胞生長至關重要，無法將erg9基因的完全敲除，已有研究通過將erg9基因原有的啟動子替換為較弱的啟動子MET3，減少麥角固醇途徑的流量，從而實現目的產物產量的提高［7-8］。此外，?zaydin等［9］發現將rox1基因敲除后，MVA 途徑中間產物甲羥戊酸的表達水平得到大幅提高，其他研究也發現rox1基因在甲羥戊酸途徑和麥角固醇生物合成中是抑制基因表達的轉錄調節器，被敲除之后可提高MVA 途徑通量［10-11］。

綜上，本研究嘗試引入來自植物黃扁柏的瓦倫西亞烯合成酶基因（CnVS）到釀酒酵母體內，使得釀酒酵母能利用簡單培養基合成瓦倫西亞烯，并結合代謝途徑改造和表達載體適配提高瓦倫西亞烯產量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒及菌株 本實驗中所用質粒、菌株如表1 和表2 所示。

表1 本實驗所用質粒

1.1.2 主要試劑和儀器 本實驗所用限制性內切酶及2×DreamTaq Green PCR 購自上海Thermo Fisher Scientific 公司，T4 連接酶購自北京New England BioLabs 公 司，2×PrimerSTAR Max Premix 及DNA Marker 購 自 大 連 的TaKaRa 公 司，ClonExpress II 重組試劑盒購自南京的Vazyme 公司，Cycle-Pure Kit 購 自OMEGA bio-tek 公 司，S.c.EasyComp Transformation Kit 購自美國的Invitrogen 公司。

本實驗中所用主要儀器包括雙層全溫振蕩搖床，PCR 基因擴增儀，美國Aligent 公司的氣相色譜儀GC 7890A 及氣相色譜-質譜聯用儀7890-5975C，美國Waters 公司的高效液相色譜儀，上海Thermo Fisher Scientific 公司的超低溫冰箱。

1.1.3 主要培養基

1.1.3.1 Luria-Bertani（LB）培養基（L-1） 稱取10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g NaCl 溶于蒸餾水。配制固體培養基時，在LB 培養基中再加入20 g 瓊脂粉即可。配制LB/Amp+抗性培養基時，在LB 培養基滅菌后冷卻至60℃左右后，在超凈工作臺中以1∶1000 比例加入氨芐青霉素（100 mg/mL）即可。

1.1.3.2 三缺型SD 或SG 培養基（L-1） 配制ΔLeu-ΔTrp-ΔUra 的三缺型SD 或SG 培養基時，稱取20 g葡萄糖或半乳糖溶于蒸餾水。滅菌冷卻后，在超凈工作臺中按1∶10 的比例加入10×酵母氮源（YNB）溶液和10×DO Supplement 溶液。4℃保存。配制含某種氨基酸的單缺或雙缺培養基時，在三缺型SD培養基中按1∶100 的比例加入100×的相應氨基酸母液即可。配制固體培養基時，在SD 培養基中再加入20 g 的瓊脂粉即可。

表2 本實驗所用菌株

1.2 方法

1.2.1CnVS基因的獲取及擴增 通過查閱文獻，本研究選取了來源于黃扁柏的瓦倫西亞烯合成酶CnVS（Valencene synthase fromCallitropsis nootkatensis） 進行異源表達，并從NCBI 基因庫上下載獲得CnVS基因序列（JX040471），將序列交由生工生物工程（上海）有限公司經密碼子優化后合成。以含有CnVS基因的合成質粒pUC57-VS 為模板，用引物對VS-F、VS-R 擴增出CnVS基因片段，在片段兩端引入酶切位點SacI、BamH I、XbaI 和SmaI。將擴增后得到的基因片段用1%瓊脂糖凝膠電泳進行大小檢測，然后再用PCR 產物純化試劑盒Cycle-Pure Kit 純化基因片段，用微量分光光度計檢測基因片段的濃度。實驗所需引物如表3 所示。

1.2.2 不同CnVS表達載體的構建 基于課題組前期構建的表達載體YEplac181-PTDH3-TADH1和YEp352-PTDH3-TADH1，用BamH I 和SmaI 分別雙酶切兩個載體及PCR 擴增得到的CnVS基因片段，經過瓊脂糖凝膠電泳檢測及試劑盒純化后，按照基因片段∶載體片段=6∶1（n∶n）的比例配制連接體系，兩個DNA 片段總質量不可以超過150 ng，反應總體系為10 μL。16℃過夜連接后，利用化學法轉化入E. coliDH5α 感受態細胞中，經過colony PCR 驗證后，成功得到表達載體YEplac181-PTDH3-VS-TADH1、YEp352-PTDH3-VS-TADH1。

基于課題組前期構建的表達載體YEplac181-TADH1-PTDH3-PTEF1-TCYC1，分 別 以cas1-F/181-bone-R 和181-bone-2-F/181-bone-2-R 為引物對，進行片段PCR擴增并得到兩條片段backbone-1 和backbone-2，同時以質粒pUC57-VS 為模板，用引物對ADH1-VSF/TDH3-VS-R 和TEF1-VS-F/CYC1-VS-R 進行PCR 擴增，得到兩條片段VS-1 和VS-2。經過上述PCR 反應 共 得 到4 個DNA 片 段backbone-1、backbone-2、VS-1 和VS-2， 利用多片段同源重組試劑盒ClonExpress MultiS，將4 個片段連接在一起，并轉入E. coliDH5α 感受態細胞中，最終成功獲得雙向表達載體YEplac181-TADH1-VS-PTDH3-PTEF1-VS-TCYC1，用同樣的方法獲得雙向表達載體YE352-TADH1-VS-PTDH3-PTEF1-VS-TCYC1，構建示意圖如圖1 所示。

1.2.3 基因敲除菌株的構建 首先從NCBI 的基因數 據 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）中 下載獲得S.cerevisiaeBJ5464 基因組上rox1基因的外顯子序列和erg9啟動子序列。然后利用CRISPy 工具（http：//staff.biosustain.dtu.dk/laeb/crispy_cenpk/），獲得上面2 個目的基因的所有潛在靶序列。根據CRISPy 的結果排序，選擇不會與其他基因位點產生特異性匹配的序列作為gRNA 的靶序列。

表3 本實驗所用引物

gRNA 表達載體是基于購自Addgene 公司的p426-PSNR52-gRNA.CAN1.Y-TSUP4（簡稱P426）進行構建，采取同源重組的方法。首先根據質粒P426 的序列信息，選取質粒上的一段序列作為構建2 個gRNA表達載體時的通用引物（Tong-F/R），然后以質粒上原有的gRNA 靶序列前后的序列作為基礎設計上下游引物，并將rox1和erg9基因靶序列分別添加到上下游引物的5′端，形成20 bp 的同源臂，通過同源臂重組作用獲得2 個單基因敲除的gRNA 表達質粒P426-rox1、P426-erg9（圖2）。

圖1 雙向表達載體的構建示意圖

圖2 gRNA 表達質粒示意圖

利 用 酵 母 轉 化 試 劑 盒S.c.EasyComp Transformation Kit，將Cas9 蛋白表達質粒（p414-PTEF1-Cas9-TCYC1，簡稱p414-Cas9）轉化到S.cerevisiaeBJ5464 的感受態細胞中，最終得到可表達Cas9 蛋白的酵母菌株BJVC。隨后制備酵母菌株BJVC 的感受態細胞，將500 ng gRNA 表達質粒和500 ng 對應的用于DNA 修復的同源DNA 模板共同轉化到該可表達Cas9 蛋白的感受態細胞中，重組酵母細胞放在營養缺陷型平板SD/ΔUra-ΔTrp 中生長，30℃培養2-4 d。經過酵母菌落PCR 及基因測序驗證，最終成功得到基因敲除菌株。

1.2.4 重組菌株雙相搖瓶發酵 挑取上述構建成功的重組菌株，在對應營養缺陷型的SD 液體培養基中30℃，220 r/min 培養36-72 h，直至OD600值為1-3，然后取適量菌液加到50 mL 錐形瓶中，并在錐形瓶中加入10 mL 相應營養缺陷型的SD 液體培養基，使得錐形瓶中菌液起始OD600為0.05，加入2 mL 正十二烷覆蓋在菌液上方，用于萃取瓦倫西亞烯。發酵在30℃，220 r/min 環境下培養48 h。其中原始菌株作為對照組，各基因敲除菌株作為實驗組。對照組與實驗組均設置3 個平行樣。

探究不同碳源濃度時，設置3 個濃度梯度：20 g/L、80 g/L、140 g/L。探究不同氮源濃度時，設置了3 個濃度梯度N0、N1、N2，并設置一組將有機氮源替換成無機氮源的實驗，如表4 所示。

1.2.5 瓦倫西亞烯的鑒定及產量檢測 氣相樣品制備：發酵48 h 結束后，取出50 mL 錐形瓶，靜置數分鐘直至有機相與水相分離開，用移液槍吸取上層的有機相至2 mL 離心管中，14000 r/min 離心5 min。然后取500 μL 上層有機相至1.5 mL 離心管中，并加入500 μL 乙酸乙酯和2 μL 異長葉烯（作為內參，終濃度為50 μmol/L），再加入適量無水硫酸鈉（吸水劑），充分振蕩混勻后，14000 r/min 離心5 min。用注射器吸取離心管的上層有機相，經0.22 μm 無菌濾頭過濾至氣相色譜瓶中，-20℃凍存，作為GC檢測的樣品。

瓦倫西亞烯標樣制備：為制作瓦倫西亞烯標準曲線，制備濃度梯度為10、25、50、75、100/（mmol/L）的瓦倫西亞烯標準溶液，制備方法同上。

GC-FID 檢測：用氣相色譜儀7890A 對制備的樣品及標樣進行檢測，氣相色譜柱為Agilent HP-5（30 m×0.32 mm；0.25 μm），使用氮氣作為載氣。檢測方法為100℃保持10 min，然后以10℃/min 的速度勻速升溫至200℃并保持8 min，結束方法。

1.2.6 發酵液水相產物的鑒定及含量檢測 液相樣品制備：每個取樣時間點，從搖瓶中取出適量下層發酵液，14000 r/min 離心5 min，取950 μL 上清到1.5 mL 離心管中，并加入950 μL 超純水和100 μL 10%烯硫酸，充分振蕩混勻后，用0.22 μm 無菌濾頭過濾至液相色譜瓶中，-20℃凍存，作為HPLC 檢測的樣品。

標樣制備：為制作葡萄糖和乙醇的標準曲線，分別制備濃度梯度為2、4、6、8、10 g/L 的葡萄糖標準溶液，和1、2、3、4、5 g/L 的乙醇標準溶液，制備方法同上。

HPLC 檢測：本研究使用高效液相色譜儀2695-2414 對制備的樣品及標樣進行檢測。液相色譜柱為AMINEX HPX-87H（300 mm×7.8 mm），使用2.5 mmol/L 的稀硫酸作為流動相。跑樣程序保持60℃，流動相速率為0.6 mL/min，分析時間為25 min。

表4 氮源濃度梯度

2 結果

2.1 雙CnVS表達盒的酵母基因組整合

為構建產瓦倫西亞烯釀酒酵母菌株，利用CRISPR/Cas9 技術將雙CnVS表達盒（TADH1-VS-PTDH3-PTEF1-VS-TCYC1）整合到酵母基因組的rox1基因位點上，獲得該菌株BJV00 后，選取10 個單菌落進行酵母菌落PCR，擴增靶基因片段進行測序，驗證雙CnVS表達盒整合效果。圖3 為雙CnVS表達盒整合基因組的菌落PCR 結果，從圖中看到3 號單菌落在rox1位點可擴增出兩個CnVS表達盒的片段，基因測序結果也正確，說明成功將雙CnVS表達盒整合到酵母基因組上。

圖3 雙CnVS 表達盒整合的酵母菌落PCR 結果

2.2 瓦倫西亞烯產量與細胞生長曲線

成功實現rox1基因的敲除并將雙CnVS表達盒整合到rox1位點后，獲得可合成瓦倫西亞烯的出發菌株BJV00，挑取該菌株的單克隆接種進行雙相搖瓶發酵，探究瓦倫西亞烯產量變化與細胞生長曲線的關聯，結果如圖4 所示。從圖中可看出，瓦倫西亞烯的增長曲線與細胞生長曲線基本保持一致，最高達到4.16 mg/L，而在14 h 葡萄糖被消耗完后細胞增長開始變緩，同時瓦倫西亞烯的增長也變緩，說明瓦倫西亞烯的合成是生長偶聯型。從乙醇曲線和甘油曲線可以發現在葡萄糖未消耗完前，兩者均是處于不斷積累的狀態，當葡萄糖消耗完后，兩者含量開始下降，說明細胞開始消耗乙醇及甘油進行生長和瓦倫西亞烯合成。

2.3 erg9基因下調對瓦倫西亞烯產量的影響

在BJV00 菌株基礎上，我們引入對erg9基因的下調，在獲得基因敲除酵母菌株后，同樣選取10 個單菌落進行酵母菌落PCR，擴增靶基因片段進行測序，驗證各基因敲除效果。圖5 為基因敲除↓erg9的酵母菌落PCR 結果，從圖中可看到各單菌落均擴增出了條帶單一的目的條帶，挑取1-3 對應的PCR產物直接送測，測序結果顯示均為陽性，即成功對靶位點進行了定點修飾，獲得菌株BJV01，基因測序結果如圖6 所示。

圖4 瓦倫西亞烯與細胞生長曲線

圖5 轉化子酵母菌落PCR 結果

挑取菌株BJV01 單菌落接種進行搖瓶發酵，發酵結果如圖7 所示，對erg9基因下調后，菌體生長與原始菌株保持一致，并未有明顯影響，而產量比原始菌株提高了約1.7 倍，達到了6.63 mg/L，表明erg9基因的下調對瓦倫西亞烯產量起到促進作用。

2.4 不同碳氮源濃度對瓦倫西亞稀產量的影響

圖6 基因敲除的測序結果圖

基于BJV01 菌株，對培養基的碳氮源濃度進行探究。碳源濃度選取了20 g/L、80 g/L、140 g/L 進行搖瓶發酵，結果如圖8 所示，初始糖濃度越高，菌體生長量也越高，80 g/L 糖濃度的產量最高，達到8.1 mg/L，提高了約1.3 倍，而在此細胞產量上，20 g/L糖濃度與80 g/L 糖濃度一致，高于140 g/L 糖濃度。氮源濃度設置參考1.2.4，發酵結果如圖9 所示，提高氮源濃度同樣可以提高菌體生長量，最高的N2 組達到33，而S 組中將氮源里的蛋白胨替換成無機氮源硫酸銨后，菌體生長量大幅下降，僅有8.45。N1組的產量最高，達到11.74 mg/L，比N0 組提高了約1.3 倍，而在比細胞產量上卻是S 組最高，遠高于另外3 組。

圖7 基因敲除菌株發酵結果

圖8 不同碳源濃度發酵結果

圖9 不同氮源濃度發酵結果

2.5 不同CnVS表達載體的構建

以YEplac181-PTDH3-VS-TADH1為例，在得到陽性克隆轉化子后，挑取單菌落接種培養，然后提取質粒進行雙酶切驗證。如圖10 所示，重組質粒經雙酶切后得到線性YEplac181 片段和CnVS基因片段，大小值分別為約6500 bp 和1800 bp 左右，均與理論值相符，表明成功構建重組質粒YEplac181-PTDH3-VS-TADH1，同理驗證重組表達載體YEplac352-PTDH3-VS-TADH1，測序結果正確，均構建成功。

雙向表達載體以YEplac181-TADH1-VS-PTDH3-PTEF1-VS-TCYC1為例，VS-1 和VS-2 基因片段是以pUC57-VS 為模板PCR 擴增得到，backbone-1 和backbone-2片段是以YEplac181-TADH1-PTDH3-PTEF1-TCYC1為模板PCR 擴增得到，圖11-A 為4 個片段的瓊脂糖凝膠電泳圖，從結果可看出每個片段均得到單一的目的條帶，大小也符合理論值。片段通過同源重組連接在一起后，挑選陽性克隆提取質粒進行酶切驗證，如圖11-B 所示，大小符合預期，測序結果正確。

2.6 不同表達載體對瓦倫西亞烯產量的影響

基于載體YEplac181 和YEp352 構建了不同CnVS表 達 載 體p181-VS、p352-VS、p181-2VS、p352-2VS，并導入釀酒酵母BJ5464 體內得到菌株BJV02、BJV03、BJV04、BJV05， 發 酵 結 果 如圖12 所示，結果表明在只含單CnVS表達盒的情況下，BJV03 產量是BJV02 產量的2.35 倍，增加一個CnVS表達盒后，BJV04 比BJV02 提高了約2.5 倍，但BJV05 相比BJV03 并沒有明顯提高。且在含雙CnVS表達盒時，BJV04 和BJV05 并無明顯差距。為了進一步提高產量，將最優表達載體p181-2VS 轉入雙基因敲除菌株BJV06（↓erg9Δrox1）中，獲得菌株BJV07，經過發酵最終獲得17.54 mg/L 的產量，比雙CnVS表達盒在酵母基因組上的BJV01 提高了2.6 倍。

圖10 重組表達載體酶切驗證結果

圖11 雙向表達載體片段PCR 擴增結果

3 討論

本研究通過在釀酒酵母BJ5464 體內引入來自植物黃扁柏的CnVS基因，并將兩個CnVS表達盒整合入酵母基因組的rox1位點上，使得酵母細胞能利用簡單碳源合成瓦倫西亞烯，同時rox1位點的敲除也可以解除對MVA 途徑的抑制［10-11］，初始產量為4.16 mg/L。為進一步提高產量，對麥角固醇合成途徑的關鍵基因erg9進行下調，增加通往瓦倫西亞烯途徑的碳流量，發酵產量的提升證明erg9基因的下調對瓦倫西亞烯產量起到促進作用，這也與已有文獻報道相符［7，12-15］，也說明下調或敲除競爭途徑的改造策略的有效性［16］。

探究不同碳氮源濃度對產量影響時，碳氮源濃度的提高均能提高細胞生長積累，但產量卻并沒有與碳氮源濃度完全成正比，可能原因是碳氮源濃度過高時，菌體的生長速率過快，代謝能量均用于細胞生長，而并未用于瓦倫西亞稀的合成，所以碳氮源濃度提高對產量的提升作用并不明顯，這可能也是隨著碳氮源濃度提高，比細胞產量反而下降的原因。另外也說明雖然瓦倫西亞稀的合成是生長偶聯型，但并非菌體生長積累越高，瓦倫西亞稀產量越高，而是需要將細胞生長速率與產物合成速率控制在一定比值范圍內，這也是后續需要進一步探究的。還有研究表明細胞體內氧化還原失衡時，會導致代謝流溢出，流向乙醇甘油等副產品的合成，造成能量的損失，不利于目的產物的積累［17-18］，控制低糖濃度發酵有利于減少副產物的產生，因而發酵培養基有待進一步優化。

在不同CnVS表達載體的實驗中，單CnVS表達盒的情況下，YEp352 載體的表現要優于YEplac181載體，說明不同載體也會對瓦倫西亞烯產量造成影響，可能原因一是YEp352 載體拷貝數要高于YEplac181，提高了整體的酶活，后續可以通過檢測兩者的拷貝數來進行驗證；二是YEp352 載體上的某部分元件促進CnVS的表達，從而提高了瓦倫西亞烯產量，這仍有待繼續探究。另外在同樣的基因敲除背景下，CnVS表達盒在質粒上時的瓦倫西亞烯產量要遠優于CnVS表達盒整合到基因組上的產量，猜測是基因組上CnVS基因拷貝數較低，導致酶活較低的原因［19-20］，因而提高CnVS基因的拷貝數是進一步提高產量的關鍵［21-23］。

圖12 含不同CnVS 表達載體菌株的發酵結果

4 結論

本研究基于釀酒酵母菌株BJ5464，引入瓦倫西亞烯合成酶，并結合代謝途徑改造、培養基優化以及表達載體適配性等策略，最終獲得最高產量為17.54 mg/L 的酵母工程菌株，比出發菌株提高了約4.2倍，對利用其他微生物表達高價值化合物具有重要參考意義。