水力負荷與有機負荷協同作用對人工濕地微生物群落結構的影響*

丁海靜 游俊杰 王敦球, 王榮華 劉 良 白少元,#

(1.桂林理工大學廣西礦冶與環境科學實驗中心，廣西 桂林 541004；2.桂林理工大學廣西環境污染控制理論與技術重點實驗室，廣西 桂林 541004；3.廣西恒晟水環境治理有限公司，廣西 桂林 541004)

在人工濕地系統中，微生物對不同污染物的凈化起重要作用，在物質轉化、能量流動中也占有重要的位置，微生物的種群結構及多樣性直接影響到濕地系統的凈化功能[1-2]。為更好地了解濕地系統中微生物的多樣性，前人對此展開了大量的研究。李新慧等[3]研究了多種氟喹諾酮對人工濕地凈化能力和微生物群落的影響，通過在人工濕地進水中添加氧氟沙星、諾氟沙星和環丙沙星等，監測水質變化和微生物群落變化。裘湛[4]綜述了濕地植物種類、光照條件、基質特性等對植物根際效應的影響，進一步闡釋分析了濕地植物對根際微生物活性、降解性能和種群組成的影響機理。在人工濕地系統工藝設計中，通過篩選人工濕地植物種類和優化工藝條件來強化人工濕地植物根際效應，有助于提高人工濕地工藝的處理效率。陳慧萍等[5]采用高通量測序和網絡分析對電解強化人工濕地系統中的功能微生物群落進行了研究。結果顯示，電解強化人工濕地中有大量的自養型反硝化功能菌，保障了在低碳氮比下污水處理廠尾水中氮的脫除。

綜上可知，人工濕地基質微生物的研究至關重要，鑒于此，本研究以3種基質結構構建人工濕地系統，分別在不同水力負荷、不同有機負荷運行條件下，利用高通量測序技術對人工濕地系統基質表面的微生物進行測序，分析不同填充結構形成不同流場分布的人工濕地床體中微生物的群落結構和多樣性，最后分析不同基質結構與微生物群落結構分布的相關性[6-7]。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置

本研究模擬水平潛流人工濕地系統，濕地系統長、寬、高分別為2.0、1.2、0.7 m，均由厚度為3 mm的不銹鋼材構建而成。濕地基質填充深度0.6 cm，表層預留10 cm的超高區域，床體種植濕生挺水植物美人蕉，種植密度為20株/m2。濕地的布水區和集水區寬度均為20 cm，均用滲透系數為500 m/d的鵝卵石進行填充，床體其余區域均用石英砂填充。構建3個小型人工濕地裝置：(1)單層基質結構人工濕地系統，記為CW1，該濕地基質用粒徑為4.75～8.00、2.00～3.35 mm的石英砂以1∶1的質量比混合填充，基質滲透系數為65 m/d；(2)3層基質結構人工濕地系統，記為CW3，該人工濕地系統基質石英砂粒徑分布為第1層0.20～0.40 mm，第2層0.40～0.60 mm，第3層0.90～2.00 mm，基質滲透系數從上到下依次為26、36、64 m/d；(3)6層基質結構人工濕地系統，記為CW6，該人工濕地系統基質石英砂粒徑分布為第1層0.40～0.80 mm，第2層0.40～0.60 mm，第3層0.40～0.90 mm，第4層1.00～2.00 mm，第5層2.00～4.00 mm，第6層4.00～6.00 mm，其滲透系數從上到下依次為38、36、43、55、75、176 m/d。

1.2 進水水質

實驗裝置位于桂林理工大學污水處理站，原水來自調節池，實驗采用連續進水運行方式，儲水箱容積為2 m3，以乙酸鈉為氮源，氯化銨為碳源，磷酸二氫鉀為磷源，根據實驗設計的水力負荷和有機負荷配置模擬污水，調節污水C∶N∶P(質量比)=80∶6∶1。

1.3 運行參數

實驗設置2個水平的水力負荷及4個水平的有機負荷，實驗運行參數設置見表1。為降低有機負荷變化對濕地基質的影響，實驗過程逐步提高進水有機負荷，在低、高水力負荷交替下運行，即依次為L1、H1、L2、H2、L3、H3、L4、H4，運行過程中監測濕地進水和出水的COD和總懸浮固體(TSS)，待出水監測指標穩定時視為實驗結束，將儲水箱殘留物進行清理，然后進行下一運行條件的實驗。

表1 實驗運行參數設置

1.4 采樣及測試

實驗運行期間每周測定人工濕地進出水COD、TSS，于高負荷運行條件(H4)下對床體的進水端(距布水區30 cm處)和出水端(距集水區30 cm)的基質進行取樣，分別采集基質表層(0.1 m)、基質中層(0.3 m)、基質底層(0.5 m)樣品，進水端表層、中層、底層基質樣品分別標記為A1、A2、A3，出水端表層、中層、底層基質樣品分別標記為B1、B2、B3，以CW3為例，人工濕地結構圖及取樣點布置情況如圖1所示。

圖1 CW3實驗裝置及采樣點布置Fig.1 CW3 experimental setup and sampling point

1.5 樣品預處理和高通量測序

稱取0.5 g基質樣品采用Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒進行DNA初步提取，具體實驗步驟如下：在2 mL離心管中加入0.8 mL Buffer SLX Mlus，振蕩混勻5 min，加入80 μL Buffer DS并振蕩混勻，接著在恒溫金屬浴70 ℃下裂解10 min，13 000 r/min室溫離心5 min，吸取600 μL上層液體，加入200 μL Buffer SP2，振蕩混勻，加入100 μL HTR Reagent，混勻10 s，冰浴5 min，13 000 r/min室溫離心5 min，吸取400 μL上清液體，加入450 μL Binding Buffer和40 μL MagSi Particles振蕩混勻，室溫靜置2 min，放置在磁力架上吸附5 min，棄上層清液；加入500 μL Binding Buffer，振蕩混勻，室溫放置2 min，放置在磁力架上吸附5 min，棄上層清液；加入1 000 μL Buffer PHB，振蕩混勻，放置在磁力架5 min，棄上層清液；加入1 000 μL SPM Wash Buffer，混勻放置在磁力架5 min，棄上層清液；重復加入1 000 μL SPM Wash Buffer，混勻放置在磁力架5 min，棄上層清液，置于55 ℃烘箱10 min，使SPM Wash Buffer中殘留的酒精完全揮發，加入60 μL Elution Buffer到離心管中，充分振蕩混勻，65 ℃金屬浴10 min，磁力架吸附5 min，吸取上清DNA液體到1.5 mL離心管中。

對18個基質樣品進行DNA初步提取，然后用1%(質量分數)的瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。對16s RNA基因的V4高變區片段進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，引物序列為515F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN (barcode) GTGCCAGCMGCCGCGGTAA和805R引物GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGGAC TACHVGGGTATCTAATCC。擴增條件為：94 ℃預變性3 min；接著94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，進行5個循環；然后94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，進行20個循環；循環結束后72 ℃最終延伸5 min。PCR結束后，PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測，利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，隨后進行高通量測序分析，對97%相似水平的可操作分類單元(OTUs)代表序列進行分類分析，并在各個分類水平上統計每個樣品的群落組成[8]。

1.6 數據處理

采用軟件Excel 2010和SPSS 20.0對實驗數據進行分析，并使用Origin 8.0畫圖。

2 結果與討論

2.1 不同負荷條件下人工濕地的凈化效果

3個人工濕地系統對COD、TSS的去除效果見圖2至圖5。可以看出，3個人工濕地系統對COD、TSS都有明顯的去除效果，不同水力負荷條件下，隨著有機負荷的提高，COD、TSS的去除率均表現出先升高后下降的趨勢；總體看來，相同運行條件下，CW6對COD、TSS的去除率最高，低水力負荷條件下，CW6在較低有機負荷水平(L2)時的凈化效果最好，COD、TSS去除率分別為88.8%±1.4%、85.8%±1.4%；高水力負荷條件下，CW6在較高有機負荷水平(H3)時的凈化效果最好，COD、TSS去除率分別為80.4%±2.2%、82.4%±4.0%。CW6從床體表層到底層滲透系數逐漸升高，這種分層結構可強化人工濕地對COD、TSS的去除能力，這可能是由于不同滲透系數分層結構使床體流場分布趨于均勻，有利于基質及基質上附著的微生物與污染物充分接觸，提高凈化性能。

圖2 低水力負荷條件下CW1、CW3和CW6的COD去除率Fig.2 COD removal rate of CW1,CW3 and CW6 under low hydraulic loading conditions

圖3 高水力負荷條件下CW1、CW3和CW6的COD去除率Fig.3 COD removal rate of CW1,CW3 and CW6 under high hydraulic loading conditions

圖4 低水力負荷條件下CW1、CW3和CW6的TSS去除率Fig.4 TSS removal rate of CW1,CW3 and CW6 under low hydraulic loading conditions

圖5 高水力負荷條件下CW1、CW3和CW6的TSS去除率Fig.5 TSS removal rate of CW1,CW3 and CW6 under high hydraulic loading conditions

2.2 微生物群落結構

2.2.1 門水平群落結構組成

在H4運行條件下采集各人工濕地系統基質樣品，利用高通量測序方法分析18個基質樣品，得到615 845條高質量序列和12 001個OTUs，包括40門、71綱、147目、236科及763屬。對樣品中相似度97%以上的OTUs在門水平上進行統計分析，CW1、CW3、CW6中各基質樣品的微生物在門水平上的群落結構組成如圖6所示。可以看出，所有基質樣品中鑒定出的優勢菌主要為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)。由圖7可見，3個人工濕地系統中的主要菌門均為變形菌門，其在CW1中相對豐度為55.9%，在CW3、CW6中的相對豐度分別為50.8%、57.6%，變形菌門是生活污水中的主要優勢菌[9]，大多數為異養菌，它們代謝途徑很多，不同類型的有機物經過其消化和分解均能有所去除。已有研究表明，變形菌門中包含許多與有機物和無機物代謝(如碳循環、氮循環和硫循環)有關的菌屬，其在人工濕地中廣泛分布[10-11]，有助于發揮出人工濕地對污染物的去除作用。擬桿菌門和厚壁菌門在CW1中的相對豐度分別為18.0%、7.6%，在CW3中的相對豐度分別為13.6%、20.6%，在CW6中的相對豐度分別為18.8%和6.9%。擬桿菌門主要優勢菌為化能營養細菌，能夠將淀粉、纖維素最終水解為氨基酸、有機酸等，所以對有機物的降解同樣具有重要作用[12-13]，促進了人工濕地對污染物的去除效果。厚壁菌門同樣是以化能營養細菌為主的菌門，在其生長環境中都會有其內生孢子，也是生活污水中常有的菌群[14-15]。連續進水方式使人工濕地系統復氧能力減弱，導致系統基質處于還原狀態，不利于有機物的降解，影響微生物正常生命活動，進而使運行后期各污染物的去除率降低。

圖6 3個人工濕地中微生物OTUs分布Fig.6 OTUs distribution of microorganisms in 3 constructed wetlands

圖7 3個人工濕地中各菌門相對豐度Fig.7 The proportion of each phylum in 3 constructed wetlands

2.2.2 綱水平群落結構組成

對CW1、CW3、CW6中各基質樣品微生物在綱水平上的相對豐度進行分析。變形菌門中的優勢菌群為γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和β-變形菌綱(Betaproteobacteria)，其中，不同濕地系統的γ-變形菌綱的相對豐度具有相似性，并且在所有綱類上占比最高，而β-變形菌綱差異性最為明顯，在CW1、CW3和CW6濕地床體中相對豐度分別為12.9%、15.3%和20.3%，β-變形菌綱經常利用有機物分解產生的氨氣、甲烷等營養物質，β-變形菌綱的相對豐度越高，表明微生物群落結構越穩定[16-17]。WARKENTIN等[18]研究了水環境中細菌對溶解性有機污染物(DOP)的降解性，發現細菌對瓦爾諾河水體中的DOP具有生物再礦化作用，特別是原放線菌、β-變形菌、噬纖維菌和黃桿菌對DOP具有趨化性優勢。擬桿菌門中相對豐度較高的菌群有鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)和擬桿菌綱(Bacteroidia)，它們在3個濕地系統中的相對豐度均有一定的差異性，其中以鞘脂桿菌綱相對豐度最高，在CW1、CW3和CW6中相對豐度分別為9.5%、5.3%、7.1%；芽胞菌綱(Bacilli)和梭菌綱(Cytophagia)屬于厚壁菌門，兩者在不同濕地系統中表現出明顯的差異性，其中芽胞菌綱相對豐度較高，其在CW3中的相對豐度最高，達到13.1%，而在CW1、CW6中的相對豐度僅有4.9%、4.5%。由此看出，由于污水中污染物組成相同，因此CW1、CW3和CW6中的微生物結構存在相似性，但濕地床體的分層結構不同對微生物群落結構產生影響，因此微生物結構也有不同程度的差異性，總的來說，分層填充的人工濕地系統微生物群落結構更為穩定，對污染物的去除效果較好。

3 結 論

(1) 不同水力負荷條件下，隨著有機負荷的提高，CW1、CW3和CW6濕地系統COD、TSS的去除率均表現出先升高后下降的趨勢；總體來看，相同運行條件下，CW6對COD、TSS的去除率最高，可見不同滲透系數分層結構使床體流場分布趨于均勻，有利于基質及基質上附著的微生物與污染物充分接觸，提高凈化性能。

(2) CW1、CW3、CW6濕地系統微生物在門水平上主要優勢菌門有變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，它們都對污水中有機物分解和利用具有重要作用，其中以變形菌門占絕對優勢。

(3) 對基質樣品微生物在綱水平上的相對豐度進行分析，γ-變形菌綱在變形菌門中占主導地位，在不同濕地系統中具有相似性，而β-變形菌綱差異性最為明顯，在CW1、CW3和CW6濕地床體中占比分別為12.9%、15.3%和20.3%。擬桿菌門中鞘脂桿菌綱相對豐度最高，在CW1、CW3和CW6中相對豐度分別為9.5%、5.3%、7.1%，厚壁菌門中芽胞菌綱相對豐度較高，CW1、CW3、CW6中的相對豐度為4.9%、13.1%、4.5%。

(4) 濕地系統基質結構對微生物群落結構具有不同程度的影響，分層填充的濕地系統形成的均勻流場有助于微生物群落結構的穩定。