大鼠顱腦損傷聯合FK506誘導促進坐骨神經再生的研究

何新澤，田 沖，李 芹,楊 濤，林書卿,于立志，王成剛，孫金占，王 培

(1. 濱州市中心醫院，山東 濱州 251700;2.承德醫學院附屬醫院手足外科，河北 承德 067000)

顱腦損傷是現代社會飛速發展的副產物，同時合并周圍神經損傷的患者臨床工作中并不罕見。神經損傷后的病理生理變化復雜、神經損傷后的恢復受多種因素的影響，恢復不全，致殘率較高[1]。何新澤等研究發現，實驗大鼠在顱腦損傷后損傷的坐骨神經修復速度加快，但修復機制尚不清楚[2]；查閱大量研究文獻發現應用FK506后損傷的周圍神經修復明顯優于對照組[3]。FK506促進神經修復的主要機制是通過免疫抑制作用、神經營養作用[4-10]。本實驗擬通過借鑒FK506促進神經損傷恢復機制，對比實驗結果，推測顱腦損傷促進神經損傷恢復可能的機制，指導進一步的深入研究。

1 材料和方法

1.1造模動物及材料：實驗在2018年11月～2019年4月在濱州市中心醫院完成。

實驗動物：選用SPF級雄性SD大鼠160只，200～220 g[北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK (京) 2012-0001]。飼養在晝夜各12 h節律下，實驗室溫度維持在(23±1)℃。將大鼠完全隨機分為四組，每組40只。實驗經過濱州市中心醫院倫理委員會批準，按照國際動物實驗標準執行。

主要設備及試劑：手術顯微鏡(LZL-6A型，鎮江中天公司)，光學顯微鏡(BH-3型，Olympus公司)，電子分析天平(ESJ200-4 ±0.0001g)，FK506(Tacrolimus)100 mg(Selleck)，頭孢唑啉納(魯抗制藥，國藥準字H19993050)、BL-420F系統(成都泰盟科技有限公司)、熒光金(Sigma)，冰凍切片機(Leica819)。

1.2造模步驟

1.2.1造模術前準備：禁食水4 h，術前30 min，肌內注射頭孢唑啉鈉10 mg/100 g預防感染，手術區域約2 cm2備皮剪毛。麻醉：10%水合氯醛按照0.35 ml/100 g進行腹腔全身麻醉；手術步驟：實驗組(A1組、A2組)(顱腦損傷+坐骨神經損傷)：消毒，沿頭部正中矢狀切開，在顱骨冠狀線后1.5 mm、中線偏左5 mm處開直徑5 mm骨窗，撞擊造成中度腦損傷；右側臀部，顯微鏡下完全切斷坐骨神經，9-0無損傷線縫合坐骨神經外膜4～6針[11-12]。對照組(B1組、B2組) (坐骨神經損傷)：SD大鼠僅于顯微鏡下完全切斷右側坐骨神經，縫合坐骨神經外膜。

1.2.2造模后的干預：分籠飼養在同樣環境中。FK506用0.9% NaCl溶液稀釋，1 ml 0.9% NaCl溶液+1 mg FK506，現用現配制，4℃恒溫保存；造模手術12 h后，A1組SD大鼠給予FK506按1 mg/200 mg腹腔注射，A2組給予生理鹽水按1 ml/200 mg腹腔注射，B1組大鼠給予FK506按1 mg/200 mg腹腔注射，B2組大鼠給予生理鹽水按1 ml/200 mg腹腔注射。每天應用1次，連續2周。SD大鼠均存活。

1.3主要觀察指標

1.3.1坐骨神經指數(sciatic nerve function index，SFI)的測量：分別于造模后4周、8周、12周，每組每次隨機取10只大鼠。根據Schiaveto de Souza A的方法[8]，實驗側足3個參數分別為：實驗側足印長度(SPL)、實驗側足趾寬度(STS)、實驗側中間足趾距離(SIT)；正常側足3個參數分別為正常側足印長度(ZPL)、正常側足趾寬度(ZTS)、正常側中間足趾距離(ZIT)。

1.3.2動作電位幅值恢復率：分別于造模術后8周、12周，每組每次隨機取5只大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉后，暴露坐骨神經，取神經吻合口遠端0.5 cm放置刺激電極1，近端放置刺激電極2，誘導電極、記錄電極放在近神經根部，將記錄到的電信號直接輸入BL-420F系統中記錄神經干的動作電位幅值恢復率，以評價神經再生情況。

1.3.3熒光金示蹤：分別于造模術后12周，于坐骨神經斷端以遠0.5 cm處，注入4%的熒光金溶液5 μl，2 min后緩慢退針。術后7 d，深麻醉下開胸，左心室置入灌注針至升主動脈，剪開右心耳，灌流固定，取坐骨神經相應脊髓節段，冰凍切片機切片脊髓橫斷面20 μm。熒光顯微鏡下觀察脊髓前角熒光金陽性運動神經元數目。

1.4統計學分析：采用SPSS19.0進行統計學分析，組間均數兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料間接化法計算率，進行統計分析，以P<0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1造模后大鼠基本生活狀態的觀察：造模后所有動物均存活，未發現切口感染情況。造模手術后5 d B2組SD大鼠出現足部紅腫明顯，其他組紅腫較輕。3周后，A2組、B1組、B2組SD大鼠足跟出現程度不同的潰瘍面，A1組SD大鼠足部未見明顯潰瘍；12周時，各組SD大鼠足部潰瘍基本痊愈，B2組SD大鼠出現足部的自食現象。

2.2大鼠坐骨神經功能指數(SFI)：暗箱測試結果顯示，造模后第4周，A1組與A2組、B1組與B2組SD大鼠的坐骨神經功能指數接近，差異無統計學意義(P>0.05)，A1組SFI優于B1組、B2組，A2組SFI優于B1組、B2組，差異有統計學意義(P<0.01)；第4周后大鼠SFI逐漸降低，第8、12周時，A2組與B1組大鼠SFI接近，差異無統計學意義(P>0.05)，A1組SFI優于A2組、B1組、B2組大鼠，A2組SFI優于B2組，B1組SFI優于B2組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 腦損傷、FK506對周圍神經損傷大鼠SFI的影響

2.3腦損傷、FK506對周圍神經損傷大鼠神經干動作電位幅值恢復率的影響：實驗在屏蔽櫥內進行，室溫保持在(25±0.5)℃之間，實驗條件：刺激強度1.2 mV、波寬0.05 ms。動作電位幅值恢復率：將刺激電極1記錄的動作電位幅值作分子，刺激電2記錄的動作電位幅值作分母，將兩者的比值轉化為百分率。造模后第8周，各組大鼠坐骨神經干的動作電位幅值恢復率差異有統計學意義(P<0.01)，A1組優于A2組、B1組、B2組，A2組優于B1組、B2組，B1組優于B2組；第12周時，A2組與B1組大鼠坐骨神經干的動作電位幅值恢復率接近，差異無統計學意義(P>0.05)，A1組優于A2組、B1組、B2組，A2組優于B2組，B1組優于B2組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 腦損傷、FK506對周圍神經損傷大鼠神經干動作電位幅值恢復率的影響

2.4熒光金示蹤標記：光鏡下，觀察各組相應脊髓節段前角神經元細胞胞漿中熒光顆粒。每高倍視野下進行計數，統計分析結果；造模后第12周，各組脊髓神經元胞漿熒光金標記陽性率差異有統計學意義(P<0.05)，A2組與B1組大鼠脊髓神經元胞漿HRP標記陽性率接近，差異無統計學意義(P>0.01)，A1組高于A2組、B1組、B2組，A2組高于B2組，B1組高于B2組，差異有統計學意義(P<0.01)。第12周時，A2組HRP標記脊髓前角陽性率(77.24±1.52)%與B1組大鼠脊髓神經元胞漿熒光金標記陽性率(78.60±2.23)%接近，差異無統計學意義(P>0.01)，A1組熒光金標記脊髓前角陽性率(82.37±1.33)%高于A2組(77.24±1.52)%、B1組(78.60±2.23)%、B2組(42.63±2.12)%，A2組熒光金標記脊髓前角陽性率高于B2組(42.63±2.12)%，B1組熒光金標記陽性率(78.60±2.23)%高于B2組(42.63±2.12)%，差異有統計學意義(P<0.01)。

3 討論

何新澤等動物實驗發現大鼠腦損傷后損傷的坐骨神經的修復重建有明顯促進作用，但具體修復機制尚不清楚[13-15]。本文通過動物實驗比較顱腦損傷聯合應用FK506的坐骨神經損傷大鼠損傷后的坐骨神經損傷恢復的情況。在所有的實驗觀測項目中，顱腦損傷聯合FK506組(A1組)的坐骨神經修復效果要優于其他組(A2組、B1組、B2組)，這也證實了顱腦損傷可以與FK506協同促進坐骨神經損傷后的修復，推測腦損傷其誘導神經再生作用機制與FK506促進神經恢復機制可能不完全相同。

在Sunderland V型的外圍神經損傷后，神經損傷切斷了神經軸突內分泌的養分，不能將其輸送到靶子器官上，靶子器官將失去活性和營養的支持，同時靶器官分泌的物質不能反饋給上一級中樞[16-18]。根據目前的FK506促進神經機制，促進外圍神經修復相對明確是兩個功能領域，發揮神經營養功能，形成一個FKBP12的綜合體，加入功能地區后表達GAP-43，一個超蛋白質神經生長，并促進形成和擴大神經的生長由神經脈沖生成的生物電能，靶器官再生軸突的內徑上升，厚厚的神經膜層作用范圍增加[19-23]。這證實了FK506有助于恢復外圍神經的營養功能，萎縮身體的部分看起來更容易潰瘍，SFI、神經干動作電位恢復幅值率FK506組(A1組、A2組)恢復較好，提示促進損傷的修復作用，結合功能或復雜的FKBP12 區來促進表達GAP-43。

在周圍神經損傷后，軸突的退化立即發生，軸突碎片是由巨噬細胞吞噬清除的，新的軸突、未退化的神經元延伸到由Schwann細胞組成的內膜神經的間隙，靶器官逐漸建立聯系和營養[24-26]。FK506結合FKBP12，形成鈣復合物抑制堿(CAN)，抑制T細胞的衰減，并抑制白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-3(IL-3)的表達，以生產免疫抑制物被神經接收[27-28]。周圍神經的損傷伴隨著血液神經屏障的破壞，刺激纖維增生和巨噬細胞的擴散，形成影響神經修復的疤痕[29-30]。FK506可以抑制纖維素的擴散、遷移和生物活性，抑制纖維素的擴散，并通過免疫抑制作用促進神經損傷的重建和修復。神經內分泌系統的調節，創造微型環境的因素、Schwann細胞的信號有助于促進軸突再生[31]。神經交換的物質是軸漿的運輸器官和再生軸芽器官通過內膜管再生作用于目標器官[29]。軸突內物質更好地恢復運輸功能和靶器官的反饋是相互促進的[2]。脊髓前角熒光金標記證明A1組比 A2組、B1組、B2組的免疫神經內分泌系統在腦損傷期間的關系更加密切[32-33]，自主神經系統的中心結構被摧毀，導致免疫調節紊亂、改變或喪失，功能腦細胞的變性，導致Caspase瀑布反應性的激活，導致神經凋亡。

本試驗結果提示，腦損傷伴隨周圍神經損傷動物早期應用FK506后，周圍神經修復再生方面較好，腦損傷、FK506均可促進周圍神經損傷的修復，并且協同促進神經損傷的修復效果更好，為腦損傷合并周圍神經損傷的患者提供了新的治療思路。但腦損傷促進周圍神經損傷的具體機制仍需進一步深入研究。