水稻子預44和江南香糯基因組比較鑒定稻瘟病抗性相關基因

李金璐 張慧 焦澤宇 劉劍宇 韓光煜 卓曉軒 羅瓊

水稻子預44和江南香糯基因組比較鑒定稻瘟病抗性相關基因

李金璐#張慧#焦澤宇 劉劍宇 韓光煜 卓曉軒 羅瓊*

(云南農業大學 農業生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室/省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室, 昆明 650201;#共同第一作者;*通信聯系人, E-mail: qiongbf@aliyun.com)

【目的】子預44是一具有廣譜持久稻瘟病抗性的云南地方粳稻品種。為了鑒定子預44中候選稻瘟病抗性相關基因，【方法】本研究利用高通量測序技術（High-throughput sequencing）對子預44和感病水稻江南香糯進行了全基因組測序。而后使用軟件GATK(3.4-46)對高質量測序結果進行SNP和InDel的檢測和統計，進一步篩選出子預44和江南香糯DNA水平存在SNPs/InDels多態性抗病相關基因?！窘Y果】通過Hiseq X10 PE150平臺分別獲得了4 118 170 045 bp和2 995 054 509 bp子預44和江南香糯的基因組數據，比對到參考基因組（Ensembl release 31）的比對率分別為98.56％和98.30％。在抗病水稻子預44和感病水稻江南香糯之間鑒定了922個純合突變的差異抗病相關基因。結合基因定位結果，在子預44中鑒定了一個新的抗稻瘟病候選基因?！窘Y論】研究結果為子預44中抗稻瘟病新基因的克隆提供了參考，對子預44廣譜持久抗瘟分子機制的研究奠定了基礎。

水稻；稻瘟??；基因組測序；抗病相關基因

水稻是世界上近一半人口的主糧，隨著世界人口的不斷增長，預計到2030年水稻生產至少需要增加40%的產量才能滿足人們的生活所需[1]。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是水稻生產上最具毀滅性的病害，全球每年因稻瘟病造成稻谷減產10%~30%，每年減產的糧食足夠養活6千萬人口[2]。目前，稻瘟病防治主要采用的是藥劑防治和種植抗病品種。雖然藥劑防治對穩定水稻產量起到了非常重要的作用，但農藥的重復大量使用帶來了嚴重的環境污染[3, 4]。利用抗病基因培育抗病品種是控制稻瘟病最經濟有效和環保的方法[3-7]。目前已鑒定的主效抗性基因位點已超過100個，數量抗性位點已超過350個[5, 8, 9]，已克隆的抗稻瘟病基因約30個[5, 6, 9-12]?；蚪閷У男》N特異性抗性效果明顯、抗性強，在水稻育種中容易被利用，所以目前生產上使用的抗病品種多屬于這種抗性。然而，基因介導的抗性會由于病原的快速進化而喪失，因而抗性品種推廣種植3~5年后其抗性就逐漸喪失[13, 14]。此外，我國新育成的一些水稻品種抗瘟效果并不太理想。例如，在2004?2008年間，國審的174個品種對稻瘟病的平均抗病指數僅為5.5，處于中感水平[7]。因此，優異的稻瘟病抗性新基因的發掘，尤其是廣譜抗性基因的鑒定和利用對保證水稻產量具有重要意義。

子預44是一具有廣譜持久抗瘟性的云南地方粳稻品種[16]。我們在子預44中鑒定了多個主效和微效抗瘟基因位點[17-22]，發現子預44第6染色體短臂上10.008~11.043 Mb區間攜帶一個抗多個稻瘟病菌的主效基因。但由于水稻第6染色體短臂上抗稻瘟病基因成簇分布，且序列高度保守[23]，通過常規的PCR方法進行該區域DNA片段的擴增和分析鑒定候選基因不僅耗時費錢，而且結果不理想。為了能快速有效地鑒定和克隆已定位的抗病基因，我們嘗試在基因初步定位的基礎上，進行抗病親本子預44和感病親本江南香糯的全基因組重測序和序列比較分析，篩選鑒定抗病候選基因。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

抗病粳稻品種為子預44和中花11。感病粳稻品種為日本晴、臺北309、江南香糯和麗江新團黑谷。抗病秈稻品種為9311和地谷。感病秈稻品種為Kasalath。以上水稻材料均由本實驗室保存。

1.2 稻瘟病菌菌株

稻瘟菌株LP33、LP174和LP29-3由何月秋教授課題組提供，H53由本實驗室從黑龍江采集的稻瘟病病樣分離保存。

1.3 水稻育苗

選取健康飽滿的成熟水稻種子，75％酒精消毒40 s，無菌水清洗3次，20％次氯酸鈉消毒40 min，期間每10 min輕微晃動一次，消毒完成后用無菌水清洗3次。將消毒后的種子浸泡于無菌水中于37℃下吸脹，待種子露白后轉移至鋪有滅菌濾紙的培養皿中，加少量無菌水后于37℃下催芽。幼芽長至0.5 cm左右時播于特制的96孔PCR育苗板上，放置于營養液（參照國際水稻研究所的配方，并依據本實驗室實際使用情況略作調整）中，室溫、正常光照條件下培養。

1.4 水稻幼苗基因組DNA提取

采用稍作修改的CTAB法提取水稻幼苗基因組DNA。新鮮水稻幼苗剪碎后置于液氮預冷的研缽中，加入液氮快速研磨成粉，分裝于2 mL離心管中，每管分裝約0.1 g水稻樣品。加入650 μL已于65℃下預熱的CTAB提取液，充分震搖混勻。65℃下水浴30 min（每10 min搖晃混勻一次，以免組織結塊）。加入等體積650 μL氯仿，顛倒混勻，12 000 r/min下離心10 min。上清轉入新的1.5 mL離心管中，加入等體積?20℃預冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，于?20℃下靜置30 min，12 000 r/min下離心5 min。棄上清，沉淀加500 μL 75％酒精洗滌，12 000 r/min下離心2 min，棄上清，洗滌2~3次，用無水乙醇洗一次。離心管開蓋于超凈工作臺晾干。

晾干的DNA沉淀加入20~50 μL雙蒸水充分溶解后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，并同已知濃度的λ DNA分子量標準比較估計其濃度。于?20℃冰箱保存備用。

1.5 子預44和江南香糯全基因組重測序

子預44是云南地方品種麻早谷與城堡2號雜交選育而成的廣譜抗稻瘟病的高原粳稻，對6群16個中國稻瘟病菌生理小種(ZA1，ZA49，ZA57，ZA61；ZBl，ZB13，ZB17，ZB25；ZCl，ZC3，ZCl3，ZC15；ZEI，ZE3；ZFl和ZGl)表現廣譜抗性[16]。江南香糯是一低海拔高感稻瘟病的粳糯水稻品種，是抗稻瘟病基因克隆中常用的感病親本[24]。在前期研究中，我們利用子預44和江南香糯作為雜交親本構建的F7重組自交系(RIL F7)群體，進行了子預44中數量抗性位點分析[20]；利用子預44和江南香糯雜交構建的F2群體，在子預44中定位了抗稻瘟病菌ZE1、LP33、LP11和LP36的主效抗瘟基因(t)[17]、(t)[18]、(t)[21]和(t)[22]。為了進一步克隆這些主效抗病基因，本研究利用高通量測序技術對子預44和江南香糯進行了基因組重測序和序列比較分析。

校園宣傳語的漢譯英不僅要基于原文，更要考慮翻譯要求，現實翻譯目的，它是檢驗翻譯是否充分的標準；因而要對受眾做分析，譯文難度要適合中學生的英語水平，同時譯者心中還應有虛擬受眾，譯文對他們必須有效；作為校園宣傳語，有其獨特的語體特征，譯文要短小精悍、朗朗上口、便于記憶、利于宣傳；另外，由于中英兩種語言在語言特點、修辭手法上存在差異，基于翻譯目的適時變通與創新。

參照文獻[17]提取子預44和江南香糯單株基因組DNA，用酶隨機打斷成短的DNA片段后，進行末端修復。然后在DNA片段兩端連接dA尾，并連接測序接頭。加上接頭的DNA片段經過AMPure XP磁珠純化，選擇300~400 bp范圍的片段進行PCR擴增，構建測序文庫。建好的文庫經過純化、庫檢，Hiseq X10 PE150上機測序。

1.6 數據過濾與質量分析

為了保證數據質量，在信息分析前對原始數據進行質控，通過數據過濾減少數據噪音。對下機的測序序列片段(clean reads)再進行更嚴格的過濾，得到高質量的測序序列片段(High quality clean reads)，用于后續的信息分析。過濾的步驟包括去除含接頭的，含N比例大于10%的以及低質量的(質量值Q≤10的堿基數占整條測序序列片段的50％以上)測序序列片段。

1.7 比對到參考基因組和覆蓋度統計

使用比對軟件0.7.12[25]和Mem算法，將過濾后的測序序列片段比對到參考基因組(Ensembl release 31)上，比對參數設置為-k 32 –M。

序列片段比對之后的結果用Picard 1.129 (Picard: http:// sourceforge.net/projects/picard/)進行標記，并統計插入片段數量。

用Bedtools 2.25.0[26]軟件進行覆蓋度統計。

1.8 SNPs和InDels統計

在基因組水平上由單個核苷酸或者幾個核苷酸的插入或缺失所形成的DNA序列多態性，為變異。使用軟件(3.4-46)[27]的UnifiedGenotyper模塊將處理好的比對文件進行多個樣本的變異檢測，檢測到的變異使用VariantFiltration進行過濾，過濾參數為-Window4, -filter “QD < 4.0 || FS > 60.0 || MQ < 40.0”，-G_filter “GQ < 20”。用ANNOVAR[28]對檢測出的變異進行功能注釋。

1.9 候選抗病相關基因鑒定

將子預44和江南香糯基因組測序獲得的數據對應到日本晴基因組中，根據日本晴基因組中基因注釋的結果，鑒定子預44和江南香糯中的抗病相關基因。篩選出子預44和江南香糯之間DNA水平上存在SNP/InDel多態性的基因，并統計差異位點。篩選出分布在抗病相關基因編碼區的SNP/InDel差異位點，進一步篩選出非同義純合突變的差異基因，作為初步候選抗病相關基因。結合前期基因定位結果，進一步鑒定候選抗病相關基因。

1.10 稻瘟病菌孢子懸浮液制備

參照文獻[17]，進行菌株活化培養和產孢培養，將孢子濃度調制為2×105個/mL，配成終濃度為0.4%的明膠孢子懸浮液，待用。

1.11 水稻幼苗期接種及調查

水稻幼苗長到3~4葉期，將其轉移至恒溫接種室，配制2×105/mL的孢子懸浮液進行噴霧接種。接種后在溫度25℃，濕度95％的條件下，黑暗培育24 h后，12 h光照和12 h黑暗交替培育5~7 d，參照文獻[29]采用6級分級法進行病斑類型調查。

1.12 DNA片段的PCR擴增、回收和測序

PCR擴增采用50 μL反應體系：DNA模板1 μL(10 ng/μL)，正反引物各0.75 μL(10 μmol/L)，10×緩沖液 5 μL，dNTPs 4 μL(2.5 mmol/L)，MgSO42 μL，KOD-PLUS 0.4 μL，DMSO 0.5 μL，ddH2O 35 μL。95℃下變性5 min，然后95℃下15 s，57±2℃下15 s，68℃下30 s/1000 bp，35個循環，72℃下延伸5 min。

PCR擴增產物用1％瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳緩沖液中，120 V電壓電泳~30 min，待DNA分子量標準各個條帶區分明顯后于切膠臺切取目的條帶。采用北京全式金公司的膠回收試劑盒(Easy PureQuick Gel Extraction Kit)，按每0.1g回收膠加300 μL溶膠液(Binding Buffer)，65℃下加熱溶解。溶膠加入分離柱(最多700 μL)，10 000 r/min下離心1 min，將液相加入分離柱重復此步驟。棄液相，再加300 μL新的溶膠液，10 000 r/min下離心1 min。棄液相，加入700 μL已加入無水乙醇的清洗液(Wash Buffer)，10 000 r/min下離心1 min。棄液相，重復此步驟1次。棄液相，空管離心，10 000 r/min下離心2 min。棄液相，開蓋于65℃下加熱3 min。換干凈1.5 mL離心管，加入30 μL 65℃下預熱的ddH2O。65℃下閉蓋保溫3 min，1300 r/min下離心2 min，收集洗脫液。

表1 子預44和江南香糯基因組序列數據

連接反應：回收產物0.5~4 μL，北京全式金公司平末端克隆載體（pEasy-Blunt Simple Cloning Vector ）1 μL，補充ddH2O到總體積5 μL，混勻。25℃下連接5~30 min（連接時間因連接片段大小而異：0.1~1 kb為5~10 min；1~2 kb為10~15 min；2~3 kb為15~20 min；大于3 kb為20~30 min）。

連接反應結束后，產物中加入50 μL大腸桿菌感受態DH5α，輕彈混勻。冰浴30 min， 42℃水浴熱擊1 min,立即放冰上2 min，然后加入1 mL的空白LB培養基，于37℃、200 r/min下搖床培養60 min，涂布于含有卡那霉素的LB平板，吹干，37℃下倒置培養過夜。挑取單菌落于含有卡那霉素的LB液體培養基中，37℃下培養4 h后，取菌液1 μL進行PCR檢測，能擴增出目的片段的單菌落菌液送昆明碩擎生物有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 子預44、江南香糯基因組重測序

通過Hiseq X10 PE150平臺獲得的子預44和江南香糯高質量測序片段（HQ Clean Reads）分別為 41 021 044條(4 118 170 045 bp)和29 931 088條 (2 995 054 509 bp)，覆蓋參考基因組（Ensembl release 31）單末端的測序片段分別為104 368條和 64 567條，覆蓋參考基因組雙末端的測序片段分別為20 163 591×2和14 678 401×2，未比對上的測序片段分別為589 494條和509 719條，比對率分別為98.56％和98.30％。數據讀長為101 bp，Q30分別為95.39%和94.82%(Q30是指質量值大于30的堿基所占百分比，測序堿基正確率為99.9%，表1)。

2.2 子預44和江南香糯基因組比較分析及抗病相關基因鑒定

將子預44和江南香糯基因組測序獲得的數據對應到日本晴基因組中，根據與日本晴基因組中的基因注釋的比對結果，在子預44和江南香糯中共鑒定了4510個抗病相關基因對。這些基因廣泛分布于水稻的12條染色體上。不同染色體上的基因數目存在差異，第1染色體上有640個基因，數量最多，占總數的14％。第9染色體上的基因數最少，為199個(5％，圖1)。

進一步分析發現，4 510個抗病相關基因中有1769個基因在子預44與江南香糯之間存在DNA水平上的SNP/InDel多態性，差異位點達22 537個，廣泛分布于基因的上游、下游、外顯子以及內含子區域(圖2)。

在這22 537個SNP/InDel多態性位點中，有5063個SNP/InDel差異位點分布在987個抗病相關基因的編碼區，并導致了氨基酸水平的差異。其中，SNP/InDel包括四種類型，最多的為非同義SNP，共有4 732個（表2）。將包含不同SNP/InDel位點的抗性相關基因進行維恩分析，發現含有非同義SNP的基因數目最多，為728個（圖3）。

978個差異基因中有922個為純合突變的差異基因（附表1），它們不均勻地分布在水稻的12條染色體上，其中，第1、11和6染色體較多，分別有168個(17%)、158個(16%)和114個(12%)。第11和6染色體也是到目前為止鑒定和克隆抗稻瘟病基因最多的染色體。第1染色體雖然預測的抗病相關基因數量較多，但克隆的基因只有4個位于第1染色體上。該結果對子預44中抗稻瘟病基因的鑒定具有重要參考價值（圖4）。

圖1 抗病相關基因在水稻的分布

Fig. 1. Distribution of resistance related genes on rice chromosomes.

Fig. 2. Polymorphisms of disease resistance-related genes between Ziyu 44 and Jiangnanxiangnuo.

2.3 子預44中一個新的抗稻瘟病候選基因的鑒定

利用LP33、LP29-3、LP174、H53等多個稻瘟病菌株進行子預44中抗稻瘟病主效基因定位發現，子預44中抗這些菌株的基因均定位于水稻第6染色體短臂上10.008?11.043 Mb之間。進一步利用該定位區間的多態性標記和擴大的F2群體進行基因精細定位，縮小定位區間的工作卻困難重重，進展緩慢。基于此，結合定位區間內抗病相關基因的預測和子預44與江南香糯基因組的比較分析發現，該區間內1個預測的絲/蘇氨酸蛋白激酶編碼基因，在子預44和江南香糯等位基因間有9個核苷酸的缺失/插入（GCCGCCGCC）突變（圖5-A），導致了編碼蛋白3個氨基酸(AAA)的缺失/插入差異（圖5-B）。

表2 非同義突變的SNP/InDel

Frameshift InDel?引起氨基酸編碼移碼突變的插入缺失突變；Nonframeshift InDel?不導致氨基酸編碼移碼的插入缺失突變；Nonsynonymous SNP?引起氨基酸差異的單核苷酸多態性；Stoploss/gain?SNP/InDel突變引起功能缺失或獲得的氨基酸翻譯終止或延伸。

Fig. 3. Nonsynonymous mutation of SNP/InDel between Ziyu 44 and Jiangnanxiangnuo.

圖4 922個抗病相關基因在水稻染色體上的分布

Fig. 4. Distribution of 922 resistance-related genes on rice chromosomes.

進一步根據基因序列設計特異的PCR引物，分別從3個抗病水稻(9311、中花11、地谷)和4個感病水稻(日本晴、麗江新團黑谷、Kasalath、臺北309)中擴增其基因片段。序列分析顯示，3個抗病水稻中基因的DNA序列與子預44一致，而4個感病水稻中該基因的DNA序列與江南香糯一致（圖5-A）。

為進一步確定9個水稻材料中基因在DNA水平上的差異是否與其抗/感表型一致，利用稻瘟病菌株LP174，對9個水稻材料進行了苗期噴霧接種鑒定。結果表明，子預44、9311、中花11和地谷對LP174的抗病型類似，江南香糯、日本晴、麗江新團黑谷、Kasalath和臺北309對LP174表現相似的感病特征（圖6），抗/感表型與基因在分子水平的差異一致。因此，推測該基因可能是子預44中抗稻瘟病菌株LP174的候選基因。

3 討論

到目前，鑒定的抗稻瘟病主效基因已超過100個，分布在水稻除第3染色體以外的其他所有染色體上。其中以第6、11和12染色體分布較多，占總數的一半以上[30]。本研究結果顯示，第3染色體上預測的抗病相關基因有469個，占總數的10％，僅次于第1和2染色體，多于定位和克隆抗稻瘟病基因數量較多的第6(383)、11(404)和12(277)染色體，居第3位（圖1）。這與目前定位和克隆的抗稻瘟病基因在水稻染色體上的分布不完全一致。是什么原因導致幾乎沒有能通過圖位克隆的方法在第3染色體上鑒定和克隆到抗稻瘟病基因呢？對子預44和江南香糯間非同義突變的差異抗性相關基因的進一步分析發現，子預44和江南香糯間非同義突變的差異抗性相關基因主要分布在第1、6和11染色體上，也就是說，雖然第3染色體上預測的抗病相關基因數量較多，但僅有5％預測的抗病相關基因在兩個抗、感水稻間存在非同義突變差異，差異基因的數目是12條染色體中最少的（圖4），這與目前鑒定和克隆的抗稻瘟病基因主要分布在水稻第1、6、11和12染色體上，第3染色體上鑒定的抗病基因數量最少的結果一致[15]。我們推測第3染色體上預測的抗病相關基因很可能多為沒有抗性功能的假基因，或微效基因位點，也有可能這些抗病基因與病原菌無毒基因間的相互作用不符合“基因對基因”假說。Li等[16]通過66份水稻材料的基因組測序和分析，在水稻第3染色體上鑒定了一個編碼C2H2結構域轉錄因子的隱性廣譜抗瘟基因，實現了水稻第3染色體上抗稻瘟基因克隆數量零的突破，為這一推論提供了一定的證據，但仍有待相關研究的進一步證實。

ZY44–子預44；Digu–地谷；ZH11–中花11；JNXN–江南香糯；Nip–日本晴；LTH–麗江新團黑谷；TP309–臺北309。

Fig. 6. Symptoms of nine rice varieties inoculated withLP174.

ZY44–子預44；Digu–地谷；ZH11–中花11；JNXN–江南香糯；Nip–日本晴；LTH–麗江新團黑谷；TP309–臺北309。

Fig. 5. Comparison of the nucleotide and amino acid sequences offrom nine rice varieties.

目前，已定位和克隆的抗稻瘟病基因除[31],(t)[32]和(t)[14]為隱性抗病基因外，其余都是顯性抗病基因。圖位克隆方法是定位和克隆水稻各種功能基因普遍采用的經典方法，并卓有成效。然而近年來利用這種方法克隆的抗稻瘟病基因大多數是已克隆基因的等位或是直系同源基因[10]。Shang等[33]在秈稻品種93-11和粳稻品種日本晴基因組中編碼的NBS-LRR基因分析和比較的基礎上，設計假基因化分子標記，從地谷中克隆了抗稻瘟病基因[33]。最近，Li等[16]通過66份水稻材料的基因組測序和分析，在水稻第3染色體上鑒定的隱性廣譜抗瘟基因。我們在基因定位的基礎上，結合兩親本基因組序列的比較分析，在水稻第6染色體短臂上鑒定一個新的編碼絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（serine threonine kinase）抗多個稻瘟病菌株的候選抗瘟基因()。這些結果表明，隨著高通量基因組測序技術的快速發展，通過基因組測序和比較基因組學的方法鑒定和克隆新的水稻抗病基因，是一種省時有效的方法。

子預44是一具有廣譜持久稻瘟病抗性的云南地方粳稻品種，利用高通量測序技術Hiseq X10 PE150進行了子預44和感病水稻江南香糯的全基因組重測序，分別獲得了高質量的基因組數據 4 118 170 045 bp和2 995 054 509 bp，比對到參考基因組（Ensembl release 31）的比對率分別為98.56％和98.30％。在子預44和江南香糯之間鑒定了922個純合突變的差異抗病相關基因，明確了這些基因的染色體分布，為子預44中抗病新基因的克隆和育種利用研究提供了有價值的信息，為研究子預44的廣譜抗瘟分子機制奠定了重要的基礎。

謝辭:感謝中國科學院遺傳與發育生物學研究所程祝寬研究員和梁承志研究員在水稻基因組測序中提供的幫助，感謝廣州基迪奧生物科技有限公司在數據分析中的幫助。

輔助信息：有一個輔助性表格S1放在《中國水稻科學》網站(http://www.ricesci.cn)上。

[1] Khush GS. What it will take to feed 5.0 billion rice consumers in 2030[J]., 2005,59(1):1-6.

[2] Skamnioti P, Gurr SJ. Against the grain: Safeguarding rice from rice blast disease[J]., 2009,27(3):141-150.

[3] Hu K M, Qiu D Y, Shen X L, Li X H, Wang S P. Isolation and manipulation of quantitative trait loci for disease resistance in rice using a candidate gene approach[J]., 2008,1(5):786-793.

[4] Miah G, Rafii MY, Ismail MR, Puteh AB, Rahim HA, Asfaliza R, Latif MA. Blast resistance in rice: A review of conventional breeding to molecular approaches[J]., 2013,40(3):2369-2388.

[5] Deng Y W, Zhai K, Xie Z, Yang D Y, Zhu X D, Liu J Z, Wang X, Qin P, Yang Y Z, Zhang G M, Li Q, Zhang J F, Wu S Q, Milazzo J, Mao B, Wang E T, Xie H A, Tharreau D, He Z H. Epigenetic regulation of antagonistic receptors confers rice blast resistance with yield balance[J]., 2017,355(6328):962-965.

[6] Zhou X G, Liao H C, Chern M, Yin J J, Chen Y F, Wang J P, Zhu X B, Chen Z X, Yuan C, Zhao W, Wang J, Li W T, He M, Ma B T, Wang J C, Qin P, Chen W L, Wang Y P, Liu J L, Qian Y W, Wang W M, Wu X J, Li P, Zhu L H, Li S G, Ronald PC, Chen X W. Loss of function of a rice TPR-domain RNA-binding protein confers broad-spectrum disease resistance[J]., 2018,115(12):3174-3179.

[7] 何峰, 張浩, 劉金靈, 王志龍,王國梁. 水稻抗稻瘟病天然免疫機制及抗病育種新策略. 遺傳, 2014,36(8):756-765.

He F, Zhang H, Liu J L, Wang Z L, Wang G L. Recent advances in understanding the innate immune mechanisms and developing new disease resistance breeding strategies against the rice blast fungusin rice[J].(), 2014,36(8):756-765. (in Chinese with English abstract)

[8] Tanweer FA, Rafii MY, Sijam K, Rahim HA, Ahmed F, Latif MA. Current advance methods for the identification of blast resistance genes in rice[J]., 2015,338(5):321-334.

[9] Liang Z J, Wang L, Pan Q H. A new recessive gene conferring resistance against rice blast[J].2016,9(1):47. doi: 10.1186/s12284-016-0120-7.

[10] Xu X, Lv Q M, Shang J J, Pang Z Q, Zhou Z Z, Wang J, Jiang G H, Tao Y, Xu Q, Li X B, Zhao X F, Li S G, Xu J C, Zhu L H. Excavation of Pid3 orthologs with differential resistance spectra toin rice resource[J].2014,9(3):e93275. doi:10.1371/journal.pone.0093275.

[11] Li W T, Zhu Z W, Chern M, Yin J J, Yang C, Ran L, Cheng M P, He M, Wang K, Wang J, Zhou X G, Zhu X B, Chen Z X, Wang J C, Zhao W, Ma B T, Qin P, Chen W L, Wang Y P, Liu J L, Wang W M, Wu X J, Li P, Wang J R, Zhu L H, Li S G, Chen X W. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance[J]., 2017,170(1):114-126.

[12] You Q Y, Zhai K, Yang D L, Yang W B, Wu J N, Liu J Z, Pan W B, Wang J J, Zhu X D, Jian Y K, Liu J Y, Zhang Y Y, Deng Y W, Li Q, Lou Y G, Xie Q, He Z H. An E3 ubiquitin ligase-BAG protein module controls plant innate immunity and broad-spectrum disease resistance[J]., 2016,20(6):758-769.

[13] Kou Y J, Wang S P. Broad-spectrum and durability: understanding of quantitative disease resistance[J]., 2010,13(2):181-185.

[14] Kou Y J, Wang S P. Toward an understanding of the molecular basis of quantitative disease resistance in rice[J]., 2012,159(4):283-290.

[15] Zhang X H, Yang S H, Wang J, Jia Y H, Huang J, Tan S J, Zhong Y, Wang L, Gu L J, Chen JQ, Pan Q H, Bergelson J, Tian D C. A genome-wide survey reveals abundant rice blast R genes in resistant cultivars[J]., 2015,84(1):20-28.

[16] 張錦文, 洪汝科, 范靜華, 張祎穎,曾千春,羅瓊. 一份云南地方稻廣譜持久抗稻瘟病初步分析[J]. 西南農業學報, 2011,24(4):1323-1326.

Zhang J W, Hong R K, Fan J H, Zhang Y H, Zeng Q C, Luo Q. Analysis of broad spectrum and persistent rice blast resistance in Yunnan local rice variety[J]., 2011, 24(4): 1323-1326. (in Chinese with English abstract)

[17] 張錦文, 譚亞玲, 洪汝科,范靜華,羅瓊,曾千春. 高原粳稻子預44 抗稻瘟病基因遺傳分析和定位[J]. 中國水稻科學, 2009,23(1):31-35.

Zhang J W, Tan Y L, Hong R K, Fan J H, Luo Q, Zeng Q C. Genetic analysis and gene mapping of rice blast resistance invariety Ziyu 44[J]., 2009, 23(1): 31-35. (in Chinese with English abstract)

[18] 樊琳琳, 姚波, 劉志濤, 王波,劉劍宇,王韻茜,汪秉琨,曾千春,羅瓊. 子預44中抗稻瘟病基因(t)的定位[J]. 分子植物育種, 2015,13(5):961-967.

Fan L L, Yao B, Liu Z T, Wang B, Liu J Y, Wang Y Q, Wang B K, Zeng Q C, Luo Q. Identification of(t)gene conferring resistance to rice blast isolate LP33 in Ziyu 44[J]., 2015, 13(5): 961-967. (in Chinese with English abstract)

[19] 李書, 李權, 樊琳琳, 沙莎,曾千春,羅瓊. 高原粳稻子預44中三個稻瘟病抗性基因的假基因化分子標記鑒定[J]. 分子植物育種, 2014,12(2):219-225.

Li S, Li Q, Fan L L, Sha S, Zeng Q C, Luo Q. Identification of the rice blast resistance genes by pesudogenization molecular markers in plateauvariety Ziyu44[J]., 2014,12(2):219-225.(in Chinese with English abstract)

[20] 周镕, 王波, 楊睿, 李書,范琳琳,曾千春,羅瓊. 粳稻子預44中稻瘟病數量抗性位點分析[J]. 植物學報, 2015,50(6):691-698.

Zhou R, Wang B, Yang R, Li S, Fan L L, Zeng Q C, Luo Q. Quantitative trait locus analysis for rice blast resistance inrice variety Ziyu 44[J]., 2015, 50(6): 691-698. (in Chinese with English abstract)

[21] 胡朝芹, 劉劍宇, 王韻茜, 楊睿,汪秉琨,何月秋,曾千春,羅瓊. 粳稻子預44抗LP11稻瘟病菌基因(t)的定位[J]. 植物學報, 2017,6(1):1-9.

Hu C Q, Liu J Y, Wang Y Q, Yang R, Wang B K, He Y Q, Zeng Q C, Luo Q. Mapping of(t), a gene conferring resistance to the rice blast strain LP11, insubsp.cultivar Ziyu 44[J].,2017, 52(1): 61-69. (in Chinese with English abstract)

[22] 卓曉軒, 樊琳琳, 安星宇, 郭敬瑋, 楊睿, 曾千春, 羅瓊. 云南地方品種子預44中一個新的抗稻瘟病基因的定位[J]. 中國水稻科學, 2019,33(1):12-19.

Zhuo X X, Fan L L, An X Y, Guo J W, Yang R, Zeng Q C, Luo Q. Mapping of a new rice blast resistance gene in Ziyu 44, a rice landrace from Yunnan Province, China[J]., 2019,33(1):12-19. (in Chinese with English abstract)

[23] Ballini E, Morel JB, Droc G, Price A, Courtois B, Notteghem JL, Tharreau D. A genome-wide meta-analysis of rice blast resistance genes and quantitative trait loci provides new insights into partial and complete resistance[J]., 2008,21(7):859-868.

[24] Chen X W, Li S G, Xu J C, Zhai W X, Ling Z Z, Ma B T, Wang Y P, Wang W M, Cao G, Ma Y Q, Shang J J, Zhao X F, Zhou K D, Zhu L H. Identification of two blast resistance genes in a rice variety, Digu[J]., 2004, 152: 77-85.

[25] Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform[J]., 2009,25(14):1754-1760.

[26] Quinlan AR, Hall IM. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features[J]., 2010,26(6):841-842.

[27] DePristo MA, Banks E, Poplin R, Garimella KV, Maguire JR, Hartl C, Philippakis AA, del Angel G, Rivas MA, Hanna M, McKenna A, Fennell TJ, Kemytsky AM, Sivachenko AY, Cibulskis K, Gabriel SB, Altshuler D, Daly MJ. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data., 2011,43(5):491-498.

[28] Wang K, Li M Y, Hakonarson H. ANNOVAR: Functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data., 2010,38(16):e164(https://doi.org/10.1093/nar/gkq603).

[29] 王韻茜, 蘇延紅, 楊睿, 李鑫, 李晶, 曾千春, 羅瓊. 云南疣粒野生稻稻瘟病抗性. 植物學報, 2018, 53(4): 477-486.

Wang Y Q, Su Y H, Yang R, Li X, Li J, Zeng Q C, Luo Q. Rice blast resistance of wild rice in Yunnan., 2018, 53(4): 477-486. (in Chinese with English abstract)

[30] Ashkani S, Rafii MY, Shabanimofrad M, Ghasemzadeh A, Ravanfar SA, Latif MA. Molecular progress on the mapping and cloning of functional genes for blast disease in rice (L.): Current status and future considerations., 2014:1-15.

[31] Fukuoka S, Okuno K. QTL analysis and mapping of,a recessive gene for field resistance to rice blast in Japanese upland rice., 2001,103:185-190.

[32] He X Y, Liu X Q, Wang L, Wang L, Lin F, Cheng Y S, Chen Z M, Liao Y P, Pan Q H. Identification of the novel recessive gene(t) conferring resistance to., 2012,55(2):141-149.

[33] Shang J J, Tao Y, Chen X W, Zou Y, Lei C L, Wang J, Li X B, Zhao X F, Zhang M J, Lu Z K, Xu J C, Cheng Z K, Wan J M, Zhu L H. Identification of a new rice blast resistance gene,, by genomewide comparison of paired nucleotide-binding site-leucine-rich repeat genes and their pseudogene allelesbetween the two sequenced rice genomes.,2009,182(4):1303-1311.

Identification of Blast Disease Resistance-related Genes by Genomic Sequence Comparison of Rice Variety Ziyu 44 and Jiangnanxiangnuo

LI Jinlu#, ZHANG Hui#, JIAO Zeyu, LIU Jianyu, HAN Guangyu, ZHUO Xiaoxuan, LUO Qiong*

(State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources in Yunnan, Ministry of Education Key Laboratory of Agricultural Biodiversity for Plant Disease Management, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: qiongbf@aliyun.com)

【Objective】Ziyu 44 is indigenousrice from Yunnan Province of Chinawith durable broad-spectrum resistance to. In order to identify novel candidate rice blast resistance-related genes from Ziyu44, 【Method】we performed the whole genome sequencing of Ziyu 44 and susceptible variety Jiangnanxiangnuo(JNXN). Then we checked and summarized SNPs/InDels of high-throughput sequencing data by software GATK(3.4-46), and screened out disease resistance-related genes with SNPs/InDels polymorphic loci at DNA level of Ziyu44 and JNXN.【Result】4118170045bp and 2995054509bp genomic data of Ziyu44 and Jiangnanxiangnuo were respectively produced using Hiseq X10 PE150 platform. The alignment rates to the reference genomes (Ensembl release 31) were 98.56% and 98.30%, respectively. A total of 922 resistance-related differential genes were identified between Ziyu44 and JNXN. Further, combined with the result of gene mapping, we identified a new blast resistance candidate gene in Ziyu44. 【Conclusion】Our results provide valuable information for cloning of new rice blast resistance new genes, and lay an important foundation for exploring the molecular mechanism of durable broad-spectrum resistance to rice blast in Ziyu44.

rice; rice blast; genome sequencing; resistance-related genes

S435.111.4+1; S511.034

A

1001-7216(2020)01-0008-09

10.16819/j.1001-7216.2020.9066

2019-06-12;

2019-06-28。

國家重點研發計劃資助項目（2016YFD0100600）；國家自然科學基金資助項目（31160223）；云南省高?？萍紕撔聢F隊支持計劃資助項目(IRTSTYN)。