褐飛虱小分子量熱激蛋白基因表達特性和功能

潘磊 王利華 朱鳳 韓陽春 王培 方繼朝1, , 4,*

褐飛虱小分子量熱激蛋白基因表達特性和功能

潘磊1, 2, #王利華2, #朱鳳3韓陽春2王培2方繼朝1, 2, 4,*

(1南京農業大學 植物保護學院, 南京 210095;2江蘇省農業科學院 植物保護研究所, 南京 210014;3江蘇省植物保護植物檢疫站, 南京 210036;4江蘇省區域現代農業與環境保護協同創新中心, 江蘇 淮安 223300;#共同第一作者;*通信聯系人, E-mail: fangjc126@126.com)

【目的】研究褐飛虱小分子量熱激蛋白的表達特性和功能，明確其在褐飛虱溫度脅迫適應中的作用。【方法】采用BLAST從轉錄組數據庫中篩選褐飛虱小分子量熱激蛋白基因序列；利用Bioedit、Mega等分子生物學軟件進行序列分析；利用qPCR技術分析目的基因在不同處理下的表達特性；利用原核表達技術研究其功能。【結果】篩選到6個含有α-晶體結構的小分子量熱激蛋白基因、、、、、，其ORF長度依次為561、531、570、570、588和735 bp，理論等電點為5.96、5.77、6.32、5.01、5.74和7.74。在3齡若蟲中的表達量最高，而和在雌成蟲中的表達量最高。雌蟲在低溫脅迫后所有小分量熱激蛋白基因的表達量均下降，高溫脅迫后除外的其他5個基因表達量不同程度上調；3齡若蟲在低溫脅迫后一半表達量下降，另一半上升，高溫脅迫后全部上調。轉化褐飛虱的重組大腸桿菌熱激存活率顯著上升?！窘Y論】褐飛虱小分子量熱激蛋白具有齡期和誘導表達特性及熱脅迫保護功能，可能在其高溫脅迫應激中具有重要作用，在低溫脅迫應激中的作用與蟲態有關。

褐飛虱；小分子量熱激蛋白；溫度；表達

褐飛虱（）是我國主要水稻害蟲之一，從19世紀開始，在我國頻繁暴發，嚴重危害水稻生產[1]。褐飛虱種群數量受溫度的影響，溫度過高或過低均抑制其種群發展[2]。在高溫脅迫下，褐飛虱成蟲存活率下降、產卵量顯著降低[3-4]；低溫脅迫導致褐飛虱若蟲發育歷期延長，存活率下降，卵孵化率降低甚至不孵化[5]。此外，溫度過高或過低還影響褐飛虱成蟲翅的振動頻率，削弱雄蟲對雌蟲翅振動信號的接收，從而影響其種群發展[6]。

熱激蛋白是生物體內廣泛存在的蛋白質之一，在原核生物至高等動物中均有發現，其表達和調控是生物應對多種內外環境脅迫的物質基礎。根據其分子量大小可分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子量熱激蛋白(sHSPs)。小分子量熱激蛋白是分子量在12~43 kD之間的熱激蛋白，包含一個約95個保守氨基酸序列的α-晶體結構，與生物正常生理狀態的維持、脅迫應激等有關[7]；其主要功能為維持細胞蛋白穩定，保證膜的完整性和穩定性，保護信使RNA，穩定細胞骨架等[8-14]。

褐飛虱對熱脅迫的適應與熱激蛋白有關。Lu等[15-16]研究發現褐飛虱熱激蛋白HSP70和HSP90在其高溫脅迫保護中起重要作用，抑制其熱激蛋白基因和的表達使熱激后褐飛虱存活率顯著降低。Huang等[17]發現在37℃高溫脅迫后褐飛虱熱激蛋白上調表達；而5℃低溫處理后熱激蛋白基因表達量沒有顯著變化。小分子量熱激蛋白作為熱激蛋白家族的重要成員，在昆蟲抗逆性中起重要作用，如熱激顯著誘導小菜蛾()、中華蜜蜂()小分子量熱激蛋白基因的表達[18-19]。抑制灰飛虱()小分子量熱激蛋白基因的表達導致其對高溫的抗逆性下降[20]。因此，為了明確小分子量熱激蛋白在褐飛虱溫度脅迫適應中的作用，解析褐飛虱適應溫度脅迫的機制，從而為其種群數量預測及生態防控策略的制定提供理論依據，從轉錄組數據庫中篩選出褐飛虱小分子量熱激蛋白基因，然后采用qPCR法研究不同齡期褐飛虱表達譜和溫度脅迫對雌成蟲和3齡若蟲表達的影響，利用原核表達技術研究對熱脅迫的保護功能。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

褐飛虱種群2006年采自南京，室內采用武運粳7號飼養，飼養條件為溫度27℃±1℃，相對濕度為65%±10%，光周期為光照14 h/黑暗10 h。不同齡期褐飛虱小分子量熱激蛋白基因表達差異性檢測時，收集同一天的初孵若蟲置于30 cm×20 cm×18 cm的塑料筐中飼養，然后選擇發育一致的試蟲，分別收集1、2、3、4、5齡若蟲和雌雄成蟲，液氮速凍后貯存于?80℃冰箱，用于總RNA的提取。每個重復1齡若蟲取40頭，2齡30頭，3齡20頭，4齡15頭，5齡10頭，雌成蟲6頭，雄成蟲10頭；每處理重復3次。

溫度誘導褐飛虱小分子量熱激蛋白基因表達特異性分析時，設置的溫度處理分別為0℃、6℃、10℃、14℃、18℃、22℃、30℃、33℃、36℃、39℃、42℃、44℃，取羽化1 d的雌成蟲和3齡若蟲轉移至12 cm×2.5 cm的指形管中，除0℃在冰水混合物中孵育外，其余均在臺式冷凍恒溫振蕩器THZ-C-1中孵育1 h，26℃下恢復1 h，收集存活試蟲，液氮速凍后貯存于?80℃。3次重復，以不進行溫度脅迫的試蟲為對照，用于總RNA提取。

1.2 褐飛虱小分子量熱激蛋白序列分析

褐飛虱小分子量熱激蛋白序列分析采用分子生物學軟件Bioedit、Mega等進行。首先根據基因同源性采用離線BLAST從轉錄組數據庫中篩選出小分子量熱激蛋白基因，然后利用NCBI ORF Finder在線工具查找這些基因的開放閱讀框，再設計引物驗證開放閱讀框序列。利用ExPASy Translate Tool翻譯驗證后的序列，Computer pI/Mw Tool計算等電點和理論分子量，Prosite預測小分子量熱激蛋白特征區域，Pfam預測小分子量熱激蛋白的保守結構域，Bioedit進行序列比對，Mega 7.0.26構建開放閱讀框DNA序列系統進化樹。

1.3 實時熒光定量PCR(qPCR)

1.3.1 總RNA的提取

總RNA的提取參照Promega公司的總RNA提取試劑盒（SV Total RNA Isolation System）說明書進行。提取的總RNA分別使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整度，微量分光光度計(Eppendorf BioPhotometer Plus) 檢測其濃度，－80℃下貯存，用于qPCR模板的合成。

1.3.2 cDNA第1鏈的合成

cDNA第1鏈的合成參考TaKaRa的cDNA第一鏈合成試劑盒[PrimeScript? RT Master Mix (Perfect Real Time)]說明書進行。以500 ng總 RNA為模板，加入2 μL 5×反轉錄預混緩沖液(PrimeScript RT Master Mix)，然后以去RNA酶水補至10 μL，37℃下溫育30 min，85℃下10 s滅活反轉錄酶后即得到第1鏈cDNA。

1.3.3 實時熒光定量PCR

qPCR參考單丹等[21]的方法，以β-actin（EU179846）為內參[22]，取1 μL稀釋20倍的cDNA為模板，分別加入10 μL酶預混液（SYBR?Premix Ex Taq?）、0.4 μL Rox?參比染料（ROX Reference Dye）(50×)和0.4 μL 10 μmol/L上游和下游引物（引物序列見表1），以水補至20 μL。先95℃下預變性30 s，然后95℃下5 s，60℃下31 s，共40個循環，最后進行溶解曲線的擴增。

1.4 小分子量熱激蛋白基因原核表達及BL21(DE3)耐熱性測定

根據Transgen公司pEASY-Blunt E1表達載體設計引物（引物序列見表1），擴增小分子量熱激蛋白基因開放閱讀框全長，然后將目標序列連接到載體上，轉化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆測序。選擇正確表達方向的陽性克隆，擴大培養后提取質粒，轉化BL21（DE3）即獲得含小分子量熱激蛋白的重組細菌。重組細菌耐熱性測定參考Crack等[23]的方法。具體步驟為取50 μL菌液加入5 mL LB液體培養基中，37℃、250 r/min下培養至OD值約0.6，然后加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，30℃、200 r/min下培養過夜，以含空載體的大腸桿菌為對照。取1 mL菌液置于50℃水浴鍋中分別溫育0.5 h和1 h，冰浴后稀釋104倍，取100 μL熱激處理前和處理后樣品分別涂板，37℃培養過夜后記錄平板菌落數，每處理4個重復。大腸桿菌熱激存活率=（熱激處理前菌落數?熱激處理后菌落數）÷熱激處理前菌落數×100%。

表1 qPCR和原核表達引物

表2 褐飛虱小分子量熱激蛋白序列特征

1.5 數據處理

小分子量熱激蛋白基因相對表達量的計算采用2法[24]。不同齡期小分子熱激蛋白基因表達差異以1齡若蟲表達量為參照物計算其他齡期的相對表達量；不同溫度脅迫下小分子量熱激蛋白基因表達量的計算以不處理試蟲為對照。結果均采用SPSS 19.0，ANOVA最小顯著性差異法在0.05水平上進行差異顯著性分析。

重組大腸桿菌耐熱性實驗在相同處理時間水平比較表達小分子量熱激蛋白對大腸桿菌耐熱性的影響。轉化不同小分子量熱激蛋白基因后大腸桿菌存活率差異顯著性分析采用SPSS 19.0，ANOVA最小顯著性差異法在0.05水平上進行差異顯著性分析。

表3 褐飛虱小分子量熱激蛋白氨基酸序列間的一致性

2 結果與分析

2.1 褐飛虱小分子量熱激蛋白基因的序列特征

褐飛虱6個小分子量熱激蛋白基因開放閱讀框堿基序列長531~735 bp，預測氨基酸序列等電點為5.01~7.74，理論分子量為20.9~28.7 kD，均含有HSP20保守結構域PF00011，即約95個氨基酸序列的α-晶體結構（表2）。這些基因彼此間氨基酸序列同源性差異較大，同源性最高的是和，為68.2%；最低的是和NlHSP28.7，僅有6.9%（表3）。利用鄰接法構建褐飛虱、黑腹果蠅（）和人類（）小分子量熱激蛋白的開放閱讀框序列進化樹，發現來自人類的基因聚為一支，來自褐飛虱和黑腹果蠅的小分子量熱激蛋白雖然也表現出同一物種聚為一支的趨勢，但有些基因如褐飛虱與黑腹果蠅同源性更高（圖1）。

2.2 不同齡期褐飛虱小分子量熱激蛋白基因的表達特異性

褐飛虱小分子量熱激蛋白基因在不同齡期中的轉錄水平存在顯著差異。在3齡若蟲中的表達量最高，和在5齡若蟲中的表達量最高，和在雌成蟲中的表達量最高，而在雄成蟲中表達量最高。在1~5齡若蟲中，除和外，其余基因的表達量在高齡若蟲中略高于或者與低齡若蟲相當。在雌雄成蟲之間，除和在雌蟲中的表達量顯著高于雄蟲外，其余無顯著差異（圖2）。

2.3 褐飛虱小分子量熱激蛋白基因的誘導表達

褐飛虱小分子量熱激蛋白基因在高溫和低溫脅迫下的表達譜存在顯著差異。高溫脅迫下，雌成蟲除表達無明顯變化外，其余小分子量熱激蛋白基因表達量均有不同程度的上調(圖3-A)；若蟲所有基因表達量均顯著上調(圖3-B)。其中和表達量在雌成蟲和若蟲中變化均非常顯著，最大誘導倍數在雌成蟲和3齡若蟲中分別為61.8和181.4；最大上調倍數分別為525.5和306.0。、和最大誘導表達倍數若蟲大于成蟲。最佳誘導溫度在不同基因間也存在顯著差異。雌成蟲、、在42℃下處理后表達量最高，但在36℃熱激后表達量最高，而最高誘導表達量出現在33℃處理后(圖3-A)。3齡若蟲、、在44℃下處理后表達量最高，其余基因在33℃下處理后表達量最高(圖3-B)。

低溫處理后，褐飛虱小分子量熱激蛋白基因的表達量在雌成蟲中均出現不同程度下降(圖4-A)，在3齡若蟲中、和表達量呈下降趨勢，但、和在18℃和0℃處理后表達量顯著增加(圖4-B)。不同基因最佳誘導溫度也存在顯著差異。如雌成蟲在10℃處理后表達量最低，而在0℃處理后表達量最低(圖4-A)；3齡若蟲在14℃處理后表達量最低，、、在0℃處理后表達量最高（圖4-B）。

HSPB開頭的基因來自人類，Dm前綴的基因來自于黑腹果蠅，Nl前綴的基因來自褐飛虱。

Fig. 1. Molecular Phylogenetictree of ORF DNA sequences offrom,andby Neighbor-Joining method.

柱上標相同小寫字母者表示材料間差異未達0.05顯著水平。

The same lowercase letters above the bars indicate no significant difference among the materials at the 0.05 level.

圖2 褐飛虱小分子量熱激蛋白基因在不同齡期間的相對表達量

Fig. 2. Relative expression level ofin different stage of

>A?雌成蟲中的相對表達量; B?3齡若蟲中的相對表達量。柱上標相同小寫字母者表示處理間差異未達0.05顯著水平。

A, Relative expression level ofof female; B, Relative expression level ofof the 3rd larvae. The same lowercase letters above the bars indicate no significant difference among the treatments at the 0.05 level.

圖3 高溫熱激后褐飛虱雌成蟲和3齡若蟲小分子量熱激蛋白基因的相對表達量

Fig. 3. The diagram showed the relative expression level ofofafter heat treatment.

A?雌成蟲中的相對表達量; B?3齡若蟲中的相對表達量。柱上標相同小寫字母者表示處理間差異未達0.05顯著水平。

A, Relative expression level ofof female after cold shock; B, Relative expression level ofof the 3rd larvae after cold shock. The same lowercase letters above the bars indicate no significant difference among the treatments at the 0.05 level.

圖4 低溫處理后褐飛虱雌成蟲和3齡若蟲小分子量熱激蛋白基因的相對表達量

Fig. 4. Relative expression levels ofofafter cold treatment.

2.4 小分子量熱激蛋白重組大腸桿菌的耐熱性

表達褐飛虱小分子量熱激蛋白顯著提高大腸桿菌的耐熱性。含重組褐飛虱小分子量熱激蛋白基因的大腸桿菌在高溫處理后，其30 min和60 min的存活率均顯著增加；但高溫熱激對大腸桿菌的傷害可能具有累加效應，隨著處理時間的延長，大腸桿菌存活率逐漸下降，60 min時其最高存活率僅為30 min的一半左右（圖5）。

3 討論

褐飛虱小分子量熱激蛋白基因間序列一致性不高。小分子量熱激蛋白與其他熱激蛋白家族成員如HSP70等不同，其α-晶體結構和N-、C-端經歷了不同的進化過程，導致sHSP在α-晶體結構域部分非常保守，但是在N-、C-端變異較大[25]，使其氨基酸序列間差異也較大。褐飛虱小分子量熱激蛋白相互間氨基酸序列一致性最高的僅有68.2%，最低的為6.9%。盡管如此，小分子量熱激蛋白在昆蟲間的同源性仍然高于昆蟲與其他物種，而同一物種間的同源性也常高于不同物種[20]。褐飛虱與黑腹果蠅小分子量熱激蛋白開放閱讀框DNA序列間遺傳距離小于其與人類相關序列間的遺傳距離與此結果一致。

褐飛虱小分子量熱激蛋白的基礎表達具有明顯的發育階段特異性，如和表達峰值出現在雌成蟲中，表達峰值出現在3齡若蟲中。這種發育階段相關的特異性表達可能與小分子量熱激蛋白在生物中的廣泛功能有關。小分子量熱激蛋白參與了昆蟲變態、滯育、繁殖等多個生理過程，如桔小實蠅化蛹后小分子量熱激蛋白表達量顯著上調可能與其變態有關[26]；而云杉卷葉蛾（）滯育前后小分子量熱激蛋白的差異表達則可能與滯育狀態有關[27]。褐飛虱小分子量熱激蛋白基因在不同齡期的差異表達說明這些基因在褐飛虱的發育中可能具有重要作用。

柱上標相同小寫字母者表示材料間差異未達0.05顯著水平。

Fig. 5. Survival of recombinant BL21(DE3)transformedafter heat treatment.

褐飛虱小分子量熱激蛋白基因具有不同的誘導表達特異性。超過半數的基因受高溫熱激誘導，但仍有部分基因不被誘導或僅被輕微誘導。誘導表達的小分子量熱激蛋白在生物熱脅迫損傷保護中具有重要作用。小分子量熱激蛋白能阻止底物蛋白的聚集或失活，幫助底物蛋白重新折疊。高溫熱激后褐飛虱小分子量熱激蛋白轉錄水平增加可提高褐飛虱對高溫脅迫的適應力，但不同小分子量熱激蛋白可能應對不同的高溫脅迫。、、等三個基因的誘導峰值出現在42℃~44℃，而在33℃，說明可能應對溫和高溫脅迫，而其余三個基因應對極端高溫脅迫。二化螟也是如此，Lu等[28]發現該害蟲有兩個小分子量熱激蛋白基因在42℃熱激后表達量最高，而另一個小分子量熱激蛋白基因的表達峰值出現在35℃。

褐飛虱組成型表達的小分子量熱激蛋白可能在其基礎抗性中起重要作用。與HSP70相似，部分小分子量熱激蛋白基因的表達幾乎不受熱激影響。Daugaard等[29]認為誘導表達的HSP70主要應對脅迫損傷，而組成型熱激蛋白HSC70在生物的組成型抗性和正常生理活動中起重要作用。Jagla等[30]則認為在非應激狀態下，小分子量熱激蛋白表達的可能原因是保護重要的發育器官免受環境損害。褐飛虱和雖然在熱激后表達量變化不顯著，但轉化這兩個基因的大腸桿菌對高溫熱激的抗逆性顯著增加，說明這兩個基因在褐飛虱的基礎抗性中可能起重要作用。

與高溫脅迫不同，褐飛虱小分子量熱激蛋白在其低溫脅迫適應中的作用與齡期有關。低溫處理后，褐飛虱雌成蟲小分子量熱激蛋白基因轉錄水平無顯著變化或呈現不同程度的下降，這與熱激蛋白HSP70相似，低溫脅迫后褐飛虱Hsp70s僅有1個基因的表達量略微上調[17, 21]。與雌成蟲不同的是小分子量熱激蛋白在褐飛虱若蟲的低溫抗性中可能具有一定的作用，其3齡若蟲和在0℃處理后表達量顯著上升。但有趣的是褐飛虱3齡若蟲小分子量熱激蛋白在低溫脅迫后的上調倍數遠低于高溫熱激，其最大上調倍數在低溫脅迫后僅有10倍左右，但高溫熱激后高達300倍以上，在雌成蟲中更是達到500倍以上。這一現象可能與褐飛虱的生物學特性有關。褐飛虱是一種遷飛性害蟲，其越冬北界冬季日均最低氣溫在15℃左右，所以褐飛虱野外生存中一般不會遭遇極端低溫，而熱激蛋白是一類主要的脅迫應激蛋白，因此褐飛虱在進化上可能較少保留上調熱激蛋白應對低溫脅迫的反應機制。

綜上所述，本研究發現褐飛虱小分子量熱激蛋白基因均含有Hsp20保守結構域，其開放閱讀框DNA序列與黑腹果蠅間的同源性高于人類，彼此間氨基酸序列一致性不高。不同齡期褐飛虱小分子量熱激蛋白的轉錄水平存在顯著差異；高溫誘導后大多數基因的表達量顯著增加，而且表達這些基因的大腸桿菌的耐熱性也顯著提高。但低溫脅迫后的轉錄水平與齡期有關，在雌成蟲中表達量不同程度下降，在3齡若蟲中，一半表達量下降，一半上調。以上結果說明褐飛虱小分子量熱激蛋白在其高溫抗逆性中可能具有重要作用，但其在低溫脅迫應激中的作用受齡期影響。雌成蟲對低溫脅迫的適應機制以及組成型表達的小分子量熱激蛋白在高溫脅迫保護之外的功能尚需進一步研究。

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Expression Profiles and Functions of Small Heat Shock Proteins in

PAN Lei1, 2, #, WANG Lihua2, #, ZHU Feng3, HAN Yangchun2, WANG Pei2, FANG Jichao1, 2, 4, *

(1College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;3Jiangsu Plant Protection and Plant Quarantine Station, Nanjing 210036, China;4Jiangsu Collaborative Innovation Center for Regional Modern Agriculture & Environmental Protection, Huaiyin Normal University, Huai’an 223300, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: fangjc126@126.com)

【Objective】To explore the adaptation mechanisms of brown planthoppers(BPH) to temperature stress, the expression profiles and functions of small heat shock proteins (sHSPs) inwas studied. 【Method】The nucleotide sequence of small heat shock proteins inwas screened from transcriptome database by BLAST; The sequence analysis was carried out by molecular biological software such as Bioedit and Mega; the expression profiles were analyzed by qPCR; and the prokaryotic expression technology was used for functional research. 【Result】Six(,,,,and) with conserved alpha crystal structure were screened. The ORF length of these genes was 561, 531, 570, 570, 588 and 735 bp, and the theoretical isoelectric point was 5.96, 5.77, 6.32, 5.01, 5.74 and 7.74, respectively. The peak expression ofwas found in the third larvae and the peak ofandin females. The expression of these genes decreased in females after exposure to low temperature, while increased after exposure to high temperature except. To the 3rd instar nymphs, the expression of about half ofdecreased after low temperature stress and half ofincreased, while all increased after high temperature stress. Moreover, the survival of transformed BL21 (DE3) was significantly increased after heat treatment. 【Conclusion】The small heat shock protein ofhas stage-specific and inducible expression characteristics and show protection against heat stress. It may play an important role in response to high temperature stress, but its role in response to low temperature stress is related to insect developmental stages.

; small heat shock proteins; temperature; expression

Q755; S435.112+.3

A

1001-72169(2020)01-0037-09

10.16819/j.1001-7216.2020.9034

2019-03-27;

2019-06-14。

國家重點研發計劃資助項目（2016YFD0300706）；國家自然科學基金資助項目（31572004）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK20170072）；江蘇省重點研發計劃資助項目(BE2017366)。