蓮腐敗病菌pg基因的克隆及真核表達分析

龔 鑫，石緒根，孫曉棠，鄭興汶，楊良波，崔汝強*

（1.江西農業大學 農學院，江西 南昌330045；2.江西省廣昌縣白蓮產業發展局，江西 廣昌344900）

近年來蓮腐敗病的發生面積快速增加，尤其是長時間的連作導致土傳病原真菌逐漸積累，蓮腐敗病發生日益嚴重[1]。目前該病害很難通過農事操作及化學防治達到有效控制，已經成為蓮生產中的一種重要制約因素。在江西，白蓮主產區每年約有30%～70%的蓮田發生蓮腐敗病，其中有10%～15%的蓮田發病嚴重，甚至顆粒無收[2-3]。實驗室通過分離病原物和體外接種實驗證實，江西省廣昌縣蓮腐敗病的病原菌為尖孢鐮刀菌蓮專化型（Fusarium oxysporumf.sp.nelumbicola）[2]。發病初期，蓮葉從葉緣處開始出現褐色病斑后逐漸向內擴展，后期葉片枯萎死亡，甚至整株枯死。

植物細胞壁是抵御病原菌侵入的主要屏障。病原菌通過分泌一系列的細胞壁降解酶降解寄主細胞壁，突破屏障入侵寄主植物[4]。在細菌、真菌和植物中廣泛存在的多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）是一種重要的細胞壁降解酶，通過降解植物細胞壁中的同源多聚半乳糖醛酸，引起植物組織浸解進而導致原生質體死亡[5]，在病原菌侵染寄主引起病害過程中起著關鍵作用[6-7]。本實驗室證實蓮腐敗病菌在侵染致病過程中能夠產生多種細胞壁降解酶，其中PG活性最高，且強致病性菌株的PG活性顯著高于弱致病性菌株[3]，說明菌株致病力與PG酶活性密切相關，PG是重要的致病因子。本研究克隆了蓮腐敗病菌PG基因，并通過構建原核表達載體以期進一步分析PG基因的功能，探討該基因在病原菌浸染過程中的作用機理，為蓮腐敗病的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蓮腐敗病菌（F.oxysporumf.sp.nelumbicola）為本實驗室分離鑒定并保存的菌種。挑取蓮腐敗病菌菌株于PSA 平板上28 ℃培養5～6 d 保存備用。

1.2 RNA 提取與cDNA 第一鏈合成

利用GeneMark RNA提取試劑盒提取蓮腐敗病菌總RNA。根據TAKARA RNA PCR Kit合成cDNA[8]。

1.3 pg1 基因的克隆

以反轉錄的cDNA為模板，pg1F和pg1R為引物擴增目的基因pg1，目的基因PCR產物連接至載體pMD18-T后，送上海祥音科技公司測序[9]。

1.4 蓮腐敗病菌pg1基因酵母表達載體的構建及表達分析

1.4.1 載體構建以獲得的全長陽性克隆質粒為模板，用Not I及Xho I內切酶雙酶切pPICZαA空載體和質粒37 ℃過夜。用T4連接酶16 ℃過夜連接獲得目的基因和空載體片段，然后轉化感受態大腸桿菌DH5α，于37 ℃培養12 h，挑單克隆進行PCR檢測，檢測為陽性的克隆送上海祥音科技公司測序[10]。

1.4.2 酵母轉化子的篩選和鑒定根據分子克隆中酵母菌的感受態細胞制備方法制備畢赤酵母SMD1168感受態細胞，并將重組載體pPICZαA-pg1通過電轉化法轉入酵母感受態中，于30 ℃環境下靜置培養24 h，利用篩選培養基篩選轉化子，PCR方法檢測篩選陽性克隆，并送上海祥音生物技術有限公司測序鑒定[11]。

1.4.3 酵母誘導表達鑒定取經PCR鑒定為陽性克隆的轉化子接種在BMGY培養液中振蕩培養至OD值為2.6，離心棄上清液。沉淀加BMMY培養液重懸細胞振蕩培養，每24 h補充甲醇連續誘導3 d，每24 h取菌液用于10%SDS-PAGE分析[11]。

1.5 重組蛋白Western blot

Western blot 方法參照文獻[11]提供的方法，采用BIO-RID 半干轉膜儀轉膜，采用Abcam 公司直標抗體Anti-c-Myc（HRP）進行標記。

1.6 生物信息學分析

用BioXM 軟件(Ver.2.6) 預測LbMYB1 蛋白分子量和等電點，用Clustalx(Ver.1.83) 和BioEdit 軟件(Ver.7.1.3) 進行多序列比對，用MEGA4.0.2 軟件進行系統發育分析[12]。

2 結果與分析

2.1 RNA提取結果

利用GeneMark RNA提取試劑盒提取蓮腐敗病菌總RNA，電泳結果如圖1所示。

2.2 pg1基因的擴增

從GeneBank的鐮刀菌數據庫中下載pg1基因序列，利用Clustalx軟件進行多序列相似性比對，發現該基因在起始密碼子和終止密碼子位置附近具有較高的同源性，故在包含起始密碼子和終止密碼子的位置設計了pg1特異性全長引物并加入Not I及Xho I的酶切位點。

pg1F：5′-ctcgagaaaagaATGTTCTCTTCAACTGTCCTTCTC-3′，

pg1R：5′-gcggccgcGCAAGAGGCACCAGAGGG-3′

圖1 RNA 電泳

以cDNA 為模版，利用引物pg1F/pg1R 在不同退火溫度條件下擴增pg1，在電泳圖譜上得到一條大小約為1 100 bp 的目的條帶，符合預期片段大小（圖2）。將目的基因cDNA 全長連接到克隆載體pEASY-Blunt Simple 上，對陽性克隆載體進行挑斑鑒定。陽性克隆測序結果表明，pg1 基因包含完整的開放閱讀框1 113 bp，推測編碼了371 個氨基酸（GenBank No.MF563874）。預測的信號肽序列為MVRNIAALLPAAFAS。編碼的氨基酸序列分子量大小38 451.7 ku，理論等電點6.36，有27個帶負電荷的殘基（Asp+Glu），25 個帶正電荷的殘基（Arg+Lys）。分子式為C1668H2635N465O554S12，含有原子總數5 334 個。脂肪系數為78.54，疏水平均值為-0.165。不穩定系數為21.19，推測該蛋白為穩定的蛋白。

2.3 PG同工酶基因的系譜分析

從GeneBank 上下載目前已克隆的尖孢鐮刀菌PG同工酶基因序列，利用Clustalx 和BioEdit 軟件進行多序列比對，利用MEGA4.0.2 軟件構建本實驗獲得的蓮腐敗病菌尖孢鐮刀菌蓮專化型及其它尖孢鐮刀菌的PG 同工酶基因系統發育進化樹。結果顯示pg1 與尖孢鐮刀菌內切多聚半乳糖醛酸酶基因的親緣關系較近，具有Glyco-hydro-28 家族的保守區域的結合位點，如圖3所示。

圖2 不同退火溫度條件下pg1 的擴增結果

圖3 PG同工酶基因的氨基酸比對及系統進化樹分析

2.4 轉化子的誘導表達及Western blot分析

將陽性克隆先后接種在BMGY 和BMMY 培養基中培養，后加甲醇誘導3 d。利用SDS-PAGE 和Western blot 鑒定。結果表明，pPICZαA-pg1 目的蛋白約為38 ku，與預測蛋白分子量大小相當（圖4）。

圖4 重組蛋白表達產物的Western blot 分析

3 結論與討論

研究表明，多數真菌的PG是由多基因編碼[13]。根據降解半乳糖醛酸的方式不同，可分為內切型（endoPG）和外切型（exoPG）兩種。endoPG能降解細胞組織引起細胞死亡[14]，而且產生的寡聚半乳糖醛酸是激發植物防衛反應的激發子[15]。exoPG能降解由endoPG產生的激發子物質，并轉變為其它細胞壁降解酶的誘導劑[16]。序列分析發現真菌PG有11 個完全保守的芳香族的氨基酸殘基，endoPG和exoPG還有各自特異保守片段和殘基。這種結構上的高度保守性，為更多地克隆和研究植物病原真菌PG基因的功能提供了途徑[17]。

目前已從不同屬的病原真菌中克隆了多個endoPG基因。氯氮卓青霉菌（Penicillium solitum）的PG在病原菌侵染寄主的前期起著重要作用[18]，辣椒疫霉（P.capsici）PG體外重組蛋白能侵染辣椒表現癥狀[19]；鏈格孢菌（Alternaria citr）endoPG突變降低了對柑橘和馬鈴薯的致病力[20]，灰葡萄孢Bcpg1 的缺失導致其在不同寄主上的致病力下降[21]、麥角菌（Claviceps purpurea）endoPG 失活，對黑麥幾乎喪失了致病力[22]。侵染柑橘果實的鏈格孢菌（A.alternata）[23]、侵染美洲栗的球叢赤殼菌(Cryphonectria parasitica)[23]、侵染玉米的旋孢腔菌（Cochliobolus carbonum）[24]的PG基因敲除或失活，對病原菌致病性沒有影響。目前已從尖孢鐮刀菌甜瓜轉化型F.oxysporumf.sp.melonis中克隆了pg1 基因[25]，從番茄專化型F.oxysporum.f.sp.lycopersici（FOL）中克隆了pg5[26]兩種endoPG 基因，但單獨缺失FOM pg1 和FOLpg5 對病原菌致病力均沒有影響。尖孢鐮刀菌有150 多個寄主專化型，而據報道，PG的進化源于生態對策，是與植物的免疫反應協同進化的[27]。不同專化型在與寄主長期協同進化的過程中，PG基因會不會在表達和功能上存在不同，尚不清楚。本研究克隆了蓮腐敗病菌PG基因，并通過構建原核表達載體，以期為進一步分析PG基因的功能，探討該基因在病原菌浸染過程中的作用機理及蓮腐敗病的防治提供科學依據。