d-檸檬烯對柑橘全爪螨的作用方式和生物活性

畢曉陽，張肖肖，劉雅倩，黃繼光

（華南農業大學 天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室，廣東 廣州510642）

檸檬烯是一種常見的單環單萜類植物精油，具有d型、l型和dl型3 種構型[1]，無色油狀液體，易溶于丙酮、乙醇等有機溶劑，有特殊的檸檬芳香味[2-4]。d-檸檬烯是自然界常見的一種構型，又稱d-苧烯，具有多種活性，可從柑橘類或檸檬類的果皮或果肉中提取。研究表明d-檸檬烯具有抗蟲、抑菌、消炎、減痛、預防和治療癌癥的作用[5-8]，也可作為增香劑、抗氧化劑等添加到食品中，還可作為綠色提取劑及空氣清潔劑等[9-10]。

隨著農藥往高效、低毒方向發展，以及植物精油具有多種活性的特點，從植物中提取的d-檸檬烯被廣泛地用于害蟲防治，如螨蟲、粉虱、蚧殼蟲等，奧羅阿格瑞國際有限公司現已登記d-檸檬烯原藥和5%可溶液劑。柑橘類水果中普遍存在的d-檸檬烯通過什么方式對危害柑橘的紅蜘蛛表現出生物活性，未見相關報道。為弄清這個問題，本文重點測定了d-檸檬烯對柑橘全爪螨的作用方式和生物活性，旨在為檸檬烯類精油的使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及飼養

柑橘全爪螨（Panonychus citriMcGregor）采集于華南農業大學教學科研基地柑橘園，將成螨采集回來接種到干凈未接觸任何藥劑的柑橘苗上飼養擴繁。飼養環境：溫度（28±1）℃，相對濕度（65±5）%，光周期16∶8。

1.2 供試試劑

d-檸檬烯：含量95%，購于悌希愛（上海）化工發展有限公司。魚藤酮：含量98%，購于Sigma。丙酮等常用有機溶劑均為分析純，市售。

1.3 藥劑配制

d-檸檬烯用少量丙酮溶解，再用0.1%吐溫-80 水溶液逐級稀釋至所需濃度。控制最終溶液中丙酮含量不超過2%。

1.4 測定方法

1.4.1 成螨采用FAO 推薦的玻片浸漬法進行：將雙面膠粘貼在載玻片上，用零號毛筆挑取大小一致、健康活潑的柑橘全爪螨雌成螨，將其背部粘在雙面膠上，然后置于光照培養箱中培養觀察2 h，剔除死亡和不活潑的螨蟲。再將帶有螨蟲的載玻片在藥液中浸漬5 s，用濾紙吸干蟲體周圍藥液，晾干后置于培養箱中，24 h 觀察，記錄死亡情況。

每處理20 頭雌成螨，3 次重復，對照用相同含量的有機溶劑和乳化劑處理。

1.4.2 若螨采用噴霧法進行：準備干凈平整的豇豆葉片，剪成3 cm×5 cm 大小，葉背朝上，置于鋪有濾紙的培養皿中，接入大小一致的柑橘全爪螨若螨。用手持小型噴霧器將藥液均勻噴至葉片和螨蟲表面，至葉片表面剛好布滿霧滴為止。處理后自然晾干，轉移至光照培養箱進行培養觀察，24 h 調查死亡情況。每處理20 頭，3 次重復，對照用相同含量的有機溶劑和乳化劑處理。

1.4.3 殺卵采用浸漬法進行：準備新鮮干凈3 cm×5 cm 大小豇豆葉片，鋪于培養皿中，每個培養皿中接入產卵盛期的柑橘全爪螨成螨30 頭，置于培養箱中產卵24 h 后，剔除雌成螨，然后將帶有卵的葉片小心地在不同濃度的d-檸檬烯溶液中浸漬5 s，取出放回原處晾干。在雙目解剖鏡下記錄各處理卵的數量后，轉移至正常環境中培養，48 h 后觀察卵孵化情況，未孵化的卵粒視為死亡，計算殺卵效果。每處理重復3 次，用相同含量的有機溶劑和乳化劑處理當做空白對照。

1.4.4 產卵抑制采用噴霧法進行：將處于產卵期的雌成螨接入到新鮮、干凈的豇豆葉片背面，立即用噴霧器將不同濃度藥液噴至葉片表面，至葉片表面均勻布滿霧滴為止。然后將處理的雌成螨置于培養箱中培養、觀察。72 h 調查卵的數量。每處理20 頭，3 次重復。對照用相同含量的有機溶劑和乳化劑處理。

1.5 盆栽

采用噴霧法進行。用直徑12 cm 和高度16 cm 的塑料缽種植豇豆，待植株長至4～6 葉后，選取長勢基本一致的豇豆進行盆栽試驗。每個盆栽保留1 顆生長良好的植株，選取3 片葉，接入柑橘雌成螨50 頭，莖桿基部涂抹凡士林和爽身粉以防螨蟲逃逸。4 h 后檢查蟲口基數，不足50 頭的補足到50 頭，然后進行噴霧處理。以噴至葉片正反面均勻布滿霧滴、剛好滴水時為止。

藥后1，3，5 d 調查盆栽植株上的活蟲數，藥后3、5 d 同時還調查所有葉片上的卵粒，以此計算防治效果和產卵抑制效果。

1.6 數據處理和分析

成螨、若螨、卵的活性測定采用死亡率和校正死亡率的公式進行計算：

產卵抑制作用采用如下產卵抑制率的公式進行計算：

盆栽防效采用蟲口減退率和防效公式進行：

數據采用SPSS 20.0 軟件進行處理，多重比較采用Turkey。毒力分析采用幾率值進行線性回歸，計算出致死中濃度及95%置信區間。

2 結果與分析

采用玻片浸漬法、噴霧法測定后，d-檸檬烯對柑橘全爪螨雌成螨、若螨和卵的毒力活性，以及對雌成螨的產卵抑制活性見表1。

表1 d-檸檬烯對柑橘全爪螨不同蟲態的生物活性

從表1可以看出，d-檸檬烯對柑橘全爪螨的成螨、若螨和卵雖表現出一定的毒力活性，LC50值分別為541.07 mg/L、630.45 mg/L 和231.73 mg/L，但均在200 mg/L 以上，說明d-檸檬烯對柑橘全爪螨的觸殺作用并不顯著。同時，筆者在試驗過程中也采用浸葉法進行了測定，發現在供試濃度下螨蟲死亡率很低導致無法計算出LC50值（超過2 000 mg/L），表明d-檸檬烯對螨蟲無明顯的毒殺作用。

但是，噴霧法處理后，d-檸檬烯對柑橘全爪螨雌成螨的產卵表現出較明顯的抑制活性，72 h 的產卵抑制作用中濃度為54.19 mg/L。相比于其他幾種作用方式，d-檸檬烯的產卵抑制活性更為明顯。

為弄清d-檸檬烯對柑橘全爪螨的綜合防控作用，在室內活性測定基礎上，以植物源成分魚藤酮原藥（96%）作為對照藥劑，進一步通過盆栽試驗研究了d-檸檬烯對柑橘全爪螨雌成螨的控制效果和產卵抑制作用。結果見表2。

表2 d-檸檬烯對柑橘全爪螨盆栽防效和產卵抑制作用

表2結果表明，d-檸檬烯噴霧處理后，對柑橘全爪螨雌成螨的1、3、5 d 防效分別為10.06%、15.04%和18.97%，均不超過20%，與魚藤酮的防效之間存在顯著差異，說明該化合物對成螨的防治效果較差，不會引起成螨快速死亡。而通過調查產卵數量發現，d-檸檬烯在盆栽試驗中表現出了良好的產卵抑制作用，藥后5 d 的產卵抑制率高達83.31%，明顯優于對照藥劑魚藤酮，說明該藥劑可明顯地減少雌成螨在植株上的產卵量。

3 結論與討論

對柑橘全爪螨不同蟲態的毒力測定結果表明，噴霧或浸漬處理后，d-檸檬烯對螨蟲的致死作用不明顯，在實驗中，課題組還測定了浸葉法的毒力，發現活性更低以致無法計算出LC50值，說明觸殺和胃毒均不是這種精油成分的主要作用方式，與普遍認為的精油類成分能破壞昆蟲體壁蠟質層或在昆蟲體表形成油膜引起昆蟲死亡的作用方式不同。

胡軍華等[11]研究發現柑橘提取物對柑桔全爪螨具有較好的生物活性，并在GC-MS 確定組分的基礎上測定了檸檬烯等4 種主要組分的毒力，結果表明檸檬烯對柑橘全爪螨雌成螨、若螨和卵的LC50值分別為59.2、230.1 和65.8 mg/L，與本文結果不一致，出現這種現象的原因可能與檸檬烯的構型和純度不同有關。文獻中采用的是dl構型（CAS 號為138-86-3），含量未述及，本研究采用的是d構型（CAS 號為5989-27-5），含量95%。

另外，Abdelgaleil 等[12]通過殘毒法測定表明檸檬烯對赤擬谷盜24 h 觸殺活性LC50值為494.18 μg/cm2、熏蒸活性LC50值為33.37 mg/L，袁海濱等[13]測定水蒿精油對綠豆象6 h 觸殺活性LC50值為1.562 4 mg/L，活性大小差異很大，說明檸檬烯對不同試蟲表現的作用方式不同，不同精油的主要作用方式也存在差異。

植物精油一般具有觸殺、熏蒸、抑制產卵、驅避、拒食和引誘等多種活性[14-16]。本研究表明d-檸檬烯能抑制雌成螨產卵以及具有一定的殺卵作用，進而控制螨蟲種群增長。但d-檸檬烯對柑橘全爪螨是否還有拒食等其他作用方式，以及是否能夠減少成螨產卵的生物學機制還需進一步研究。

Oboh 等[17]發現桔皮主要成分d-檸檬烯對Na+/K+三磷酸酸腺苷的活性有抑制作用，Abdelgaleil 等[12]發現檸檬烯可抑制米象和赤擬谷盜的乙酰膽堿酯酶，也有報道指出植物精油可以破壞昆蟲體壁蠟質層，破壞細胞和神經[18]或通過物理方式形成油膜的覆蓋，引起昆蟲窒息死亡[19]。d-檸檬烯是否也具有類似的作用機制，值得進一步探索。

總之，d-檸檬烯來源于植物，廣譜、低毒，易降解，能很好地滿足現代農產品安全生產的用藥需要，必將有廣闊的發展前景。