更年湯對腎陽虛圍絕經期模型大鼠卵巢PI3K/AKT/mTOR蛋白表達的影響

張 帆，曹俊巖，王 菁，張 鑫，易 旭

(1.貴州中醫藥大學第二附屬醫院 婦科，貴州 貴陽 550001；2.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550001)

隨著老齡化時代的到來，老年女性的身心健康成為社會極為關注的問題，絕經綜合征成為研究的熱點之一。前期研究顯示[1-4]，自擬更年湯具有類雌激素樣作用，治療腎陽虛型及腎陰陽兩虛絕經前后諸證臨床療效確切，同時能抑制腎陽虛圍絕經期模型大鼠卵巢顆粒細胞凋亡因子，促進顆粒細胞發育，對改善卵巢功能有一定藥理作用。本課題在此基礎上以此信號通路為切入點，探討自擬更年湯通過調節腎陽虛圍絕經期模型大鼠卵巢中PI3K/Akt/mTOR信號通路對卵泡和卵巢功能的影響，報道如下。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗動物

4月齡SD雌性大鼠，清潔級，30只，體重(250±30)g；10～12月齡170只，體重(300±30)g。大鼠進行適應性喂養1周，喂養期間光照、黑暗各12 h，自由飲水，攝食顆粒飼料，室溫18～22 ℃，濕度68%～70%。實驗動物由第三軍醫大學醫學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK2012-0003。

1.2 實驗藥品

1.2.1 自擬更年湯組方 熟地12 g，山藥12 g，棗皮12 g，仙茅12 g，仙靈脾12 g，巴戟天12 g女貞子12 g，桑寄生12 g，旱蓮草12 g，當歸10 g，獨活9 g，防風9 g，桂枝9 g，細辛3 g，炙甘草6 g。每次使用前按相關藥物濃度比例煎制后儲存于4 ℃冰箱，藥材由貴州中醫藥大學第二附屬醫院中藥藥房提供。

1.3 主要實驗試劑及器材

蘇木素染液(140315)及伊紅染液(140315)由北京博奧森生物技術有限公司生產；大鼠免疫組化檢測試劑盒(2017060903)及免疫組化抗原修緩沖修復液(2017080301)由為基因科技(上海)股份有限公司生產；胰島素生長因子1(ab106836)及其受體(ab182408)免疫熒光試劑盒由艾搏抗(上海)貿易有限公司生產；1510型酶標儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；TDZ4-WS醫用離心機(湖南平凡科技有限公司)；萊卡DM300顯微鏡(德國萊卡公司)；倒置熒光顯微鏡IX71(日本奧林巴斯株式會社)；101-2AB型干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；電熱恒溫水浴箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。實驗用儀器均由貴陽中醫學院第二附屬醫院中心試驗室提供。

1.4 動物造模

1.4.1 圍絕經期模型大鼠制備 采集每只SD大鼠的陰道脫落細胞涂片，HE染色后在顯微鏡下觀察。連續觀察四個動情周期，共20天。若涂片底層細胞均在50%以上，為動情周期紊亂、動情間期延長，提示所觀察的大鼠符合圍絕經期模型的標準[5]。將符合標準的149只圍絕經期大鼠隨機分為5組，每組24只，剩余剔除備用。

1.4.2 腎陽虛圍絕經期模型大鼠制備 圍絕經期模型大鼠制備成功后，參考文獻[6-8]采用氫化可的松注射液進行腎陽虛圍絕經期模型大鼠制備，按照中醫臟腑辨證標準，外源性氫化可的松造成動物外觀的病態表現，符合中醫腎陽虛證的臨床表現。將圍絕經期模型大鼠于臀部肌肉豐厚處消毒后，左右交替，肌注氫化可的松注射液5 mg/(kg·d)，連續9天，給藥前后測量體重。當大鼠出現持續性萎靡不振、豎毛、脫毛、毛不光潔、拱背少動、反應遲鈍、扎堆，即為腎陽虛大鼠模型造模成功。

1.5 分組及給藥方法

將腎陽虛圍絕經期模型大鼠隨機分為5組，分別為自擬更年湯高、中、低劑量組，替勃龍組，模型組，加上4月齡大鼠為青年組，共6組。每日準時給模型大鼠灌胃，給藥劑量按人與動物體表面積換算[20]，換算后給予更年湯高、中、低劑量組給藥劑量分別為26.4 g/(kg·d)、13.2 g/(kg·d)、6.6 g/(kg·d)，替勃龍組為0.22 mg/(kg·d)，模型組及青年組給予1 mL/100g生理鹽水灌胃，連續15日。

1.6 檢測方法

1.6.1 大鼠卵巢組織上IGF-1及受體蛋白表達檢測 采用免疫熒光法：①將切好的冰凍切片從-20 ℃取出置于室溫晾干15～30 min；②用標記筆做好樣本的標記，用實驗油筆將需染組織畫圈避免染色不均，范圍約為0.5～1 cm，再用磷酸緩沖液(PBS)覆蓋組織清洗3次，每次3 min；③洗好后用槍頭吸去或甩干組織周圍多余液體并放于保濕盒內，每張玻片滴加配制好的10%山羊血清50～100 μL覆蓋組織，將保濕盒放于37 ℃的孵育盒中孵育1 h；④孵育好的組織用PBS清洗2次，每次3 min，洗好后吸去組織周圍多余的液體，滴加配制好的IGF-I及IGF-IR一抗工作液50～100 μL覆蓋組織(比例均為1∶200)，再次放于濕溫盒內，并將濕溫盒放于4 ℃冰箱過夜；⑤次日將過夜的組織切片置于孵育箱內37 ℃孵育1 h，孵育好后PBS清洗3次，每次3 min；⑥滴加配制好的二抗工作液50～100 μL覆蓋組織(比例1∶200)，滴加好后放于37 ℃孵育箱孵育2 h，孵育好后用PBS清洗3次，每次3 min(避光洗)；⑦洗凈后滴加DAPI染液 50～100 μL將組織覆蓋，將保濕盒放于孵育盒中避光染色5～10 min，染好色后PBS清洗3次，每次3 min，然后吸去或甩干多余液體用抗熒光減弱膠封片；⑧將切片放于熒光顯微鏡下觀察所需觀察指標在卵巢組織中的定位表達并拍照。

1.6.2 圖片分析方法 免疫組化及熒光結果均用此方法分析，所拍下的圖片經Image-pro plus 6.0圖像處理軟件進行分析，統計卵巢組織上所需觀察指標的陽性表達強度，最終經軟件計算后換算成平均OD(吸光度)值。

2 數據統計

3 結果

3.1 各組大鼠卵巢組織中IGF-1及其受體表達結果

造模后大鼠卵巢組織中IGF-1及其受體表達明顯低于正常青年組(P<0.01)；經藥物干預后，更年湯高劑量組、西藥組大鼠卵巢組織上IGF-1及其受體表達明顯得到增加(P<0.01)；更年湯中劑量也能增加模型大鼠卵巢組織上IGF-1R表達(P<0.05)；低劑量組則作用不大(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠卵巢組織中IGF-1及IGF-1R表達結果比較 (x±s)

注：單因素方差分析，P<0.01。經LSD檢驗，與模型組比較，*P>0.05，◇P<0.05，■P<0.01；與低劑量比較，#P>0.05，▲P<0.01；與中劑量組比較，★P<0.01，◇P>0.05；與高劑量組比較，▼P<0.01，○P>0.05；與替勃龍組比較，※P<0.01。

3.2 免疫熒光檢測卵巢PI3K蛋白表達量

自擬更年湯高、中、低劑量組，替勃龍組，模型組與青年組比較，差異有顯著統計學意義(P<0.01)。自擬更年湯高劑量組及替勃龍組與模型組比較，差異有顯著統計學意義(P<0.01)。自擬更年湯低劑量組與替勃龍組比較，差異有顯著統計學意義(P<0.01)。自擬更年湯低劑量組與自擬更年湯高劑量組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

組別nPI3K自擬更年湯低劑量組1411.45±5.61☆※△■▲自擬更年湯中劑量組1714.34±6.37☆※◇自擬更年湯高劑量組1221.33±7.70☆○替勃龍組1821.11±8.32☆○模型組149.94±4.71☆青年組2140.56±18.90

注：與青年組比較，☆P<0.01；與模型組比較，○P<0.01，※P>0.05；與替勃龍組比較，△P<0.01，P>0.05；與高劑量組比較，■P<0.05，◇P>0.05；與中劑量組比較，▲P>0.05。

4 討論

中醫學認為絕經前后諸證，腎虛是發病之本。但通過長期臨床觀察發現，貴州地處高原，寒濕較重，寒性收引易傷陽氣，易致腎陽虛衰，氣化無力，濕性重著，阻遏全身氣機，氣機不暢則全身經脈氣血津液暢行受阻，甚或凝結阻滯不通，出現因腎陽虛衰而經絡閉塞，氣不固衛，陽不外達，出現一系列陽虛內寒的癥狀，并且易感受寒濕之邪，出現內寒與外寒共見之狀。在臨床遣方用藥中發現此類患者單以補腎溫陽滋陰臨床癥狀改善效果欠佳，故腎陽虛及腎陰陽兩虛患者可采用補腎溫陽、祛風散寒之更年湯，全方貫穿補腎溫陽之法，并加入袪散風寒的藥物，使腎陽得以內滋，內寒得以溫煦；同時，外寒得以驅散，經絡得以通暢，氣機得以疏暢，能明顯改善絕經前后諸證的腎陽虛、腎陰陽平衡失調所造成的寒證[2]。自擬更年湯由六味地黃丸、二仙湯、二至丸與獨活寄生湯四方化裁而成，全方由15味藥組成，方中君藥仙茅、熟地，二者共同溫腎陽、補腎精；臣藥仙靈脾、巴戟天，二者溫腎壯陽、祛風濕、強筋骨；當歸、桑寄生、棗皮、女貞子、旱蓮草四者同補肝腎、益腎精、祛風濕、強筋骨，淮山共補腎肝脾三陰，填先天、補后天、調肝氣，以上八味藥共同配伍壯腎中之陽氣，溫而不燥，平補腎中陰陽，共奏補腎中陽氣、填精益髓、強固筋骨之功；佐藥獨活、防風、細辛三者散外風，加以桂枝，溫經脈、助陽氣，共同驅散寒濕之邪，溫通經脈；使藥炙甘草，健益后天脾氣，調和諸藥。現代藥理研究發現，六味地黃丸能夠促進女性調節HPO軸的功能，提高雌激素水平釋放，改善絕經前后諸證。研究發現二仙湯及其組方可上調卵泡顆粒細胞中雌激素β受體表達水平，改善卵巢功能，促進卵泡發育、成熟及排卵，同時能通過改善卵巢供血，促進抗苗勒氏管激素和抑制素的分泌，進而提高卵泡募集和成熟，減少卵泡閉鎖，改善卵巢儲備功能。二至丸干預更年期模型大鼠能降低 FSH、LH、PRL水平表達，升高E2水平表達，達到改善絕經綜合征癥狀的作用。有研究發現，二至丸與二仙湯均可提高機體卵巢顆粒細胞的分泌功能，進而調節生殖內分泌-免疫網絡。

PI3K/Akt/mTOR信號通路廣泛存在于細胞中，參與細胞生長、發育、調控機制，研究發現卵母細胞和顆粒細胞中均存在完整的PI3K/AKT信號系統，它們共同協調卵泡的生長發育、成熟和周期性排卵。本實驗結果發現自擬更年湯可以通過提高腎陽虛圍絕經期模型大鼠卵巢中PI3K、Akt、mTORmRNA和蛋白表達水平，而其中間介質可能是通過IGF-1及IGF-1R來發揮作用，進而促進PI3K/Akt/mTOR信號通路活性增加，從而發揮其生物學功能，抑制卵泡閉鎖，促進卵泡生長發育，這也從另一方面驗證了自擬更年湯可促進卵泡發育，進而使卵巢功能得到一定程度的改善。