RP-HPLC法同時測定脈管復康膠囊中6種酚酸類成分

葉 慧，喬 正，姜 瑋，李 敏*

(1.泰州市食品藥品檢驗所，江蘇 泰州 225300；2.泰州市醫藥高新技術產業園區疫苗工程中心，江蘇 泰州 225300)

脈管復康膠囊屬于國家基本藥物品種，現行執行標準收錄在《國家食品藥品監督管理局國家藥品標準》2014年中藥(二)(標準執行編號為YBZ25562005-2011Z)[1]，主要由丹參、雞血藤兩味藥材經過煎煮、濃縮，再加入郁金、乳香、沒藥粗粉混勻、干燥制成，具有活血化瘀、通經活絡的功效，臨床上主要用于瘀血阻滯、脈管不通引起的脈管炎、硬皮病、動脈硬化性下肢血管閉塞癥，對冠心病、腦血栓后遺癥也有一定治療作用[2-5]。

脈管復康膠囊處方中丹參藥材為君藥，目前已報道的丹參的化學活性成分達100余種[6-10]，以對丹參中水溶性成分和脂溶性成分進行測定的方法來評價丹參及其制劑質量多有報道[11-15]。藥品處方中丹參主要通過煎煮、濃縮入藥，保留水溶性成分，脂溶性成分流失；水溶性成分主要以酚酸類成分為主，如丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B等。脈管復康膠囊現行執行標準中，采用不同的色譜條件，在280 nm波長測定丹參素鈉的含量、在278 nm波長測定丹酚酸B的含量，工作量大且繁雜，不能全面體現脈管復康膠囊的質量。本研究目的在于建立HPLC法同時測定脈管復康膠囊中丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A的含量，既豐富了脈管復康膠囊的定量指標，又為更加全面地評價和控制其質量提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity Arc高效液相色譜儀(包括Empower?3工作站，四元梯度泵，2998 PDA檢測器，自動進樣器和柱溫箱，美國Waters公司)；8200型超聲波清洗器(功率500 W，頻率53 kHz，上海科導超聲儀器有限公司)；LR16-A型高速離心機(北京雷勃爾離心機有限公司)；XS105DU型電子天平(十萬分之一，瑞士Mettler公司)；AL204型電子天平(萬分之一，瑞士Mettler公司)；Milli-Q超純水處理系統(美國M ILLIPORE公司)。

1.2 試藥

丹參素鈉對照品(批號：110855-201614，純度：98.1%)、丹酚酸B對照品(批號：111562-201716，純度：94.1%)、原兒茶醛對照品(批號：110810-201608，純度：99.3%)、迷迭香酸對照品(批號：111871-201706，純度：90.5%)均購自中國食品藥品檢定研究院；丹酚酸A(批號：P12O8F45509，HPLC≥98%)、紫草酸(批號：Y04J10H75487，HPLC≥98%)均購于上海源葉生物科技有限公司；脈管復康膠囊(陜西東泰制藥有限公司，批號：8E07、8D01、8F14)；色譜純乙腈(西班牙薩勞公司)；甲醇為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge? C18(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流動相：0.05%三氟乙酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～30 min，2%B～33%(B)；30～35 min，33%～2%(B)；35～45 min，2%(B)；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：280 nm，在上述色譜條件下，理論塔板數均不低于5 000，相鄰峰之間分離度均大于1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的配制 精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A對照品適量，精密稱定，加10%甲醇溶液制成濃度分別為78.09、3.94、5.27、8.13、87.32和16.27 μg/mL的混合對照品溶液，置于4 ℃冰箱避光保存。

2.2.2 供試品溶液的配制 取裝量差異項下的內容物約0.5 g，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，定容，搖勻，濾過，取續濾液，12 000 r/min離心10 min，作為供試品溶液，置于4 ℃冰箱避光保存。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品溶液2、5、8、10、15、20、25 μL，按“2.1”項下的色譜條件進樣分析。以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標，以進樣量(X)為橫坐標繪制標準曲線，得標準曲線回歸方程，各化合物在相應范圍內線性關系良好。結果見表1。

表1 線性關系考察

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件，連續進樣6次，記錄上述6種成分的峰面積，結果丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的峰面積的RSD分別為0.80%、0.27%、0.40%、0.55%、0.38%和0.53%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批號樣品6份(批號：8E07)，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液并按“2.1”項色譜條件測定，結果丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A的平均含量(n=6)分別為4.62 、0.206、0.430 、0.790、3.14和2.00 mg/粒，RSD分別為0.63%、0.92%、1.41%、2.20%、0.60%、1.00%，表明本方法重復性好。

2.3.4 穩定性試驗 吸取同一份供試品溶液(批號：8E07)，按“2.1”項色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18、24 h進樣分析，結果A峰面積的RSD(n=6)分別為0.17%、1.02%、1.18%、1.79%、0.19%和0.57%，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.3.5 方法專屬性考察 取缺丹參藥材的陰性樣品，依法制備陰性樣品溶液；按“2.1”項色譜條件，分別對對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液進樣分析，記錄色譜圖，對照品溶液出峰順序為：丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B、丹酚酸 A，結果供試品溶液與對照品溶液相應峰保留時間一致，陰性樣品溶液無干擾，且各組相鄰成分之間分離度較好，R>1.5。詳見圖1。

A.混合對照品；B.樣品；C.陰性樣品；1.丹參素鈉；2.原兒茶醛；3.迷迭香酸；4.紫草酸；5.丹酚酸B；6.丹酚酸A

2.3.6 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品(批號：8E07)6份，每份0.25 g，精密稱定于100 mL容量瓶中，每份精密加入丹參素鈉(135.77 μg/mL)、原兒茶醛(25.20 μg/mL)、迷迭香酸(121.67 μg/mL)、紫草酸(39.83 μg/mL)、丹酚酸B(107.93 μg/mL)、丹酚酸A(39.87 μg/mL)的混合對照品溶液10 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進行分析測定，計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收率測定結果 (n=6)

2.4 樣品測定

取3個批次脈管復康膠囊(批號：8E07、8D01、8F14)，每批取0.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進行分析測定，測定峰面積，用外標法計算出丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B、丹酚酸 A的含量。測定結果見表3。

表3 樣品含量測定結果 (mg/粒，n=3)

3 討論

3.1 有效成分的選擇

丹參中水溶性的酚酸類成分遇熱易分解，脈管復康膠囊的制法中采用煎煮水提的方法提取有效成分，進而導致一些遇熱易分解的成分損失，由于6個成分均是受熱易分解的成分，故在樣品溶液前處理過程中盡量避免加熱等，所以色譜柱溫選擇25 ℃，且進樣時樣品溫度選擇10 ℃，樣品溶液在儲存過程中選擇4 ℃避光保存[18-21]。

3.2 前處理及流動相的考察

在選擇流動相組成及比例時，考察了甲醇-水體系與乙腈-水體系對基線、峰型以及分離度等的影響。通過比較研究，乙腈-水體系梯度洗脫時的峰型以及分離度均優于甲醇-水體系，其能夠較好地分離丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A 6種成分，同時加入0.05%的三氟乙酸以獲得更優的峰型。

本文所測得6個成分均為水溶性酚酸類成分，在溶劑選擇時分別選用水、10%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇，結果10%甲醇為提取溶劑時，丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸提取效率最高，而甲醇作為提取溶劑時，丹酚酸B和丹酚酸A，提取效率最高，綜合考慮，最終選用10%甲醇作為提取溶劑；在物料比例選擇中，分別稱取0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 g，經相同的前處理過程，總體看來6個成分在稱樣量為0.5 g時，提取效率最佳；在提取方式的考察時，回流提取和超聲過程均會導致有效成分的分解變質，而且在成藥的制法中，水溶性有效成分已經通過水提的方式提取出，故選用直接溶解的方式。

本文在原標準的基礎上，新增原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸A 4個化學成分的含量測定，以丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A作為考察指標，補充了原標準的不足之處，節約成本的同時又大大提高了工作效率。該方法快速、準確，重復性高，可作為脈管復康膠囊的質量控制標準。