不同脂肪源對卵形鯧鲹腸道微生物菌群的影響

李秀玲，劉寶鎖，劉 波，張 楠，朱克誠，郭 梁，郭華陽，江世貴，張殿昌

( 1.中國水產科學研究院 南海水產研究所，農業農村部南海漁業資源開發利用重點實驗室， 廣東 廣州 510300； 2.上海海洋大學 水產與生命學院，上海 201306； 3.廣東省海洋生物種業工程技術研究中心，廣東 廣州 510300 )

卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)是一種肉食性魚類，主要捕食浮游動物、小型甲殼類、貝殼類和魚類等[1]。魚肉質鮮美，生長速度快，營養價值高，為優質的海水食用魚類[2]。近年來，在中國和東南亞的一些國家，例如新加坡和馬來西亞等國家對卵形鯧鲹的商業化養殖不斷增加[3-4]。

腸道內棲息著數以萬計的微生物，這些微生物有助于宿主的生長、消化、營養吸收、抵抗疾病和免疫調節等[5-6]。脂肪是三大營養素之一，在提供能量、必需脂肪酸和磷脂等方面發揮著重要作用[7]。許多研究表明，脂肪源可以影響腸道微生物的組成和多樣性，而微生物也會參與脂質代謝。在哺乳動物中，腸道微生物參與脂質代謝，包括膽汁酸合成[8]、能量動態平衡[9]和脂質存儲等。在凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)中，飼料中的脂肪酸主要通過改變腸道微生物的分布影響其生長和免疫[10]。在斑馬魚(Daniorerio)中，腸道微生物調節腸道吸收和脂肪酸的代謝[11]。目前關于不同脂肪源對腸道微生物影響的研究還比較少，考慮到脂肪源和腸道微生物的關系及對宿主的影響，因此探究不同脂肪源對卵形鯧鲹腸道菌群的影響是非常有必要的。

腸道微生物的研究大體經歷了3個階段，培養依賴的方法階段，非培養依賴的傳統分子生物學方法階段和基于測序的高通量組學方法階段[12]。傳統培養的方式只能檢測到約1%～10%的微生物群落，這種方法雖然能夠快速有效地自環境樣品中提取大部分脂肪酸，但受人為因素干擾強烈[13]，費時費力。高通量測序技術能夠為快速準確的基因組測序提供平臺，大大降低了成本、時間[14]，已經成為微生物多樣性研究的主要方法[15-16]。本研究基于16S rDNA高通量測序技術，旨在探討不同脂肪源對卵形鯧鲹腸道微生物菌群的影響，以期能夠為卵形鯧鲹確定合適的脂肪源和健康養殖提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

共配制8種等氮等能的飼料，除脂肪源不同其他飼料原料和用量都相同，8種脂肪源分別為魚油、磷蝦油、豆油、玉米油、1∶1魚油—豆油、1∶1魚油—玉米油、1∶1磷蝦油—豆油和1∶1磷蝦油—玉米油。飼料配方見表1，試驗飼料脂肪酸組成見表2。所有飼料原料過40目篩，原料混勻后依次加入脂肪源和水，經過制粒機(華南理工大學)制成2.5 mm的沉性飼料顆粒，密封于4 ℃備用。

1.2 試驗材料和試驗設計

640尾規格均一、體質健康的卵形鯧鲹[體質量(82.85±2.36) g]采自中國南海水產研究所海南熱帶水產研究開發中心，隨機放入32個1.0 m×1.0 m×1.5 m網箱中，每個網箱20尾魚，隨機分成8組，每組4個平行，分別投喂8組試驗飼料。飼養8周，日飽食投喂2次(7:00,16:00)。試驗期間，鹽度約35，海水溫度27～31 ℃，pH 7.5～8.2，溶解氧>5 mg/L。

1.3 樣品采集和DNA提取

試驗結束后，將魚饑餓24 h，每個網箱隨機挑選3尾卵形鯧鲹，在低溫下解剖取出腸道樣品，剔除脂肪組織，放入液氮后于-80 ℃保存。

按照天根DNA試劑盒[天根(北京)生化科技有限公司]說明書提取卵形鯧鲹腸道細菌總DNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，利用Nanodrop2000檢測DNA的含量。

表1 試驗飼料原料及營養組成(干質量) %Tab.1 Ingredients and proximate composition of the experimental diets (dry weight)

注：1.預混料(聯鯤生物科技有限公司)為每千克日糧提供維生素、微量元素和抗氧化劑: 維生素A(375 000 IU) 119.81 mg，維生素D3(77 000 IU) 1.925 mg，維生素E 3000 mg，維生素K3930 mg，維生素B1600 mg，維生素B2600 mg，葉酸 185 mg, 維生素D 7.5 mg, 肌醇 4500 mg, 鋅 1750 mg, 錳 1100 mg, 銅 410 mg, 鐵 1300 mg, 鈷 60 mg, 碘 50 mg, 硒 15 mg. Premix (Guangzhou Nutriera Biotechnology Co, Ltd) provides vitamins, trace elements and antioxidants per kg diet: vitamin A (375 000 IU) 119.81 mg, vitamin D3(77 000 IU) 1.925 mg, vitamin E 3000 mg, vitamin K3930 mg, vitamin B1600 mg, vitamin B2600 mg, folic acid 185 mg, vitamin D 7.5 mg, inositol 4500 mg, zinc 1750 mg, manganese 1100 mg, copper 410 mg, Fe 1300 mg,Co 60 mg, I 500 mg, and Se 15 mg.

2.營養水平為實測值. Nutritional level is measured.

表2 試驗飼料脂肪酸組成 g/kgTab.2 Fatty acid composition of the experimental diets

1.4 PCR擴增

用515F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′和907R:5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′引物對細菌16S rDNA V4～V5可變區進行PCR擴增[17]。PCR采用PrimeSTAR HS DNA Polymerase，20 μL反應體系：10 μL的5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus)、4 μL的dNTP Mixture (2.5 mmol/L)、0.5 μL的PrimeSTAR HS DNA Polymerase、1 μL的正向引物(5 μmol/L)，1 μL的反向引物(5 μmol/L) 和10 ng 的DNA模板、ddH2O補足20 μL。PCR反應條件為：98 ℃預變性1 min；98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環27次；72 ℃延伸5 min。使用AxyPrepTMDNA 凝膠回收試劑盒純化PCR產物，在本試驗中30 ng的PCR純化產物用來進行基于illumina平臺的高通量測序。

1.5 序列分析

根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣品數據，截去Barcode序列和引物序列，對樣品的reads進行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數據。Raw Tags經過濾操作，去掉低質量、不符合長度的Tag以及嵌合體，得到高質量的Tags數據。

得到Tags數據后，一方面對每個運算分類單元的代表序列做物種注釋，得到對應的物種注釋信息和基于物種的豐度分布情況。另一方面，對運算分類單元進行豐度、Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析，得到樣品內物種豐富度和均勻度信息，獲得不同樣品和分組的群落結構差異信息。

利用QIIME (v1.7.0)計算Alpha多樣性(ACE指數、chao1指數、香農—威納指數、辛普森指數)指數和Beta多樣性(主坐標分析和主成分分析)，利用R軟件(v2.15.3)繪制稀釋曲線。試驗數據采用平均值±標準誤表示，采用SPSS 22.0對數據進行單因素方差分析，若差異達到顯著水平，則采用Tukey′s進行多重比較，顯著水平為0.05。

2 結 果

2.1 序列分析

經過組裝、質量篩選和修飾后，在卵形鯧鲹腸道中共獲得1 087 662個序列，每個樣品平均獲得45 319個序列(2 998～58 918)。在所有試驗組中，運算分類單元稀釋曲線趨于平緩，表明測序深度已基本覆蓋到樣品中所有的物種(圖1)。

圖1 卵形鯧鲹腸道微生物稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of intestinal microbiota in golden pompano T. ovatus

2.2 Alpha多樣性分析

卵形鯧鲹腸道菌群Alpha多樣性指數見表3。Chao1和ACE指數反映群落豐富度，數值越大，表明群落的豐富度越高。香農—威納指數和辛普森多樣性指數反映群落的多樣性，數值越大，表明群落的多樣性越高。Alpha多樣性結果顯示,磷蝦油組的ACE和Chao1指數顯著高于1∶1磷蝦油—玉米油組(P<0.05)，其他組之間沒有顯著性差異(P>0.05)。香農—威納指數在1∶1魚油—豆油組中顯著高于豆油和1∶1磷蝦油—玉米油組(P<0.05)。辛普森多樣性指數在磷蝦油、1∶1魚油—豆油和1∶1磷蝦油—豆油組中顯著高于豆油和1∶1磷蝦油—玉米油組 (P<0.05)，其他組之間沒有顯著差異(P>0.05)。

表3 卵形鯧鲹腸道微生物Alpha多樣性指數Tab.3 Intestinal microbial Alpha diversity index in golden pompano T. ovatus

注：同行數據不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

Note: means with different letters in the same line are significant difference (P<0.05).

2.3 腸道菌群組成及其相對豐度分析

腸道菌群在卵形鯧鲹中的組成見圖2。在所有組中的腸道菌群中注釋到4個門水平上的菌群，包括擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和軟壁菌門，變形菌門豐度最高。在魚油組、磷蝦油組、玉米油組、1∶1魚油—豆油組、1∶1磷蝦油—豆油組和1∶1磷蝦油—玉米油組組中變形菌門為優勢菌群，在豆油組和1∶1魚油—玉米油組中軟壁菌門為優勢菌群。

圖2 卵形鯧鲹腸道微生物在門水平上的相對豐度聚類堆疊圖Fig.2 Bacterial relative abundance in intestine of gdden powpano T. ovatus at the Phylum level

2.4 Beta多樣性分析

主坐標分析是將進化結構中聚類相近的物種組合在一起，聚在一起的樣品是物種進化程度方面較為類似的樣品。主成分分析是將分布較為類似的物種組合在一起，聚在一起的樣品是在物種組成方面較為類似的樣品。卵形鯧鲹腸道微生物主坐標分析結果(圖3)表明，在卵形鯧鲹腸道中微生物沒有聚集，親緣關系較遠，且受脂肪源影響較大。卵形鯧鲹腸道微生物主成分分析結果(圖4)表明，不同組間距離較遠脂肪源對卵形鯧鲹腸道微生物菌群結構具有顯著影響，組間物種組成方面差異較大。

圖3 卵形鯧鲹腸道微生物主坐標分析Fig.3 Principal co-ordinates analysis of intestinal microbiota in golden pompano T. ovatus

圖4 卵形鯧鲹腸道微生物主成分分析Fig.4 Principal component analysis of intestinal microbiota in golden pompano T. ovatus

3 討 論

由于腸道微生物在宿主營養吸收和分解中起著重要的作用[18-19]，因此腸道微生物和宿主的關系越來越受到關注。Han等[20]發現，腸道微生物來源于環境，且受遺傳背景和食物等因素的影響。基于腸道微生物在脂肪的吸收和分解方面發揮的重要作用，本研究利用Illuniana 16S rDNA高通量測序分析不同脂肪源對卵形鯧鲹腸道菌群的影響。

3.1 Alpha多樣性和Beta多樣性分析

本研究主要采用Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析對卵形鯧鲹腸道微生物群落進行分析。Alpha多樣性反映豐富度和均勻度的綜合指標，Alpha多樣性指數包括菌群豐度(Chao1、ACE指數和運算分類單元)和菌群多樣性(香農—威納指數和辛普森多樣性指數)。試驗結果表明，飼料中脂肪源類型能夠調節腸道微生物的多樣性和豐富度。磷蝦油含有豐富的n-3多不飽和脂肪酸，包括二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸[21-22]，并且在抗氧化、抗高血脂等方面起著關鍵作用。得益于磷蝦油產生的有益影響，磷蝦油組腸道中更有利于微生物的聚集；同時，由于磷蝦油組中的豐富n-3多不飽和脂肪酸，腸道微生物尤其是變形菌可能更有助于對其分解利用。1∶1磷蝦油—玉米油是磷蝦油和玉米油的混合物，玉米油富含豐富的n-6和n-9多不飽和脂肪酸，磷蝦油和玉米油的混合物使得腸道內微生物的豐富度和多樣性顯著下降，這可能說明兩者的混合物不利于腸道微生物的生存。

3.2 腸道菌群組成及其相對豐度分析

測序結果表明，在卵形鯧鲹腸道中主要有擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和軟壁菌門4種菌群，且變形菌是優勢菌群，這與許多研究結果是一致的[23-24]。研究發現，變形菌在斑馬魚[25]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[26]和大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[21]等魚類中是優勢菌群，而擬桿菌門、厚壁菌門在人和小鼠腸道中是優勢菌群。在不同研究中，不同物種的腸道微生物的組成和豐度確實存在很大差異，這可能與物種種類和環境有關。在本試驗中，8組飼料除脂肪源種類不同外其他原料組成都是相同的，因此脂肪源種類是決定優勢菌群的主要因素。擬桿菌的主要功能是幫助宿主降解碳水化合物(尤其是多糖)、蛋白質和其他物質,以提高宿主的營養利用率，厚壁菌有助于膳食纖維的降解,并將纖維降解為揮發性脂肪酸以供宿主利用[27]。本研究結果表明，豆油和1∶1魚油—玉米油有益于軟壁菌的生長，而其他脂肪源有益于變形菌的生長。據報道，中國沿海地區水產養殖區水域中變形菌門為主要優勢菌[28]，這表明，卵形鯧鲹腸道微生物組成與水體微生物組成有很大的相似性。在本研究中，變形菌和軟壁菌可能與脂肪酸代謝有關。從脂肪酸組成來看，豆油和1∶1魚油—玉米油組含有中等水平的單不飽和脂肪酸，推測可能中等水平的單不飽和脂肪酸有利于軟壁菌的生長，而軟壁菌可能有利于其代謝。關于微生物與脂肪源種類之間的關系還需要進一步探討。

3.3 主坐標分析和主成分分析

主坐標分析和主成分分析表明，脂肪源顯著影響腸道菌群，且不同脂肪源之間腸道菌落構成差異顯著，表明脂肪源在調節腸道菌群中發揮著重要的作用。有研究顯示，食物來源和宿主的發育系統是導致腸道微生物菌群差異的兩個重要因素[29-30]，在本試驗中飼料成分可能是導致腸道菌群差異的最重要因素。由主坐標分析和主成分分析圖可見，1∶1魚油—玉米油組和1∶1磷蝦油—玉米油組聚在一起，這表明兩組在物種進化方面和物種組成方面較為類似，這可能與飼料中的多不飽和脂肪酸含量和種類有關。

利用16S rDNA測序技術對卵形鯧鲹腸道微生物多樣性進行分析，結果表明，飼喂磷蝦油和1∶1磷蝦油—豆油的魚具有較高的腸道微生物多樣性，且不同脂肪源對腸道微生物多樣性影響顯著，這些結果對促進卵形鯧鲹生長和確定合適脂肪源具有重要的指導意義。