奧沙利鉑聯合地西他濱通過Wnt/β-Catenin信號通路抑制胃癌細胞作用的研究

朱理輝 徐彩云 李國慶 陳汶 廖文秋 陳宏輝 張琍

南華大學附屬第二醫院消化內科（湖南衡陽421001）

胃癌已成為威脅人類健康的重要殺手，治療的關鍵在于早發現、早診斷、盡早手術切除。目前我國早期胃癌診斷率低，大多數胃癌患者就診時已為進展期，喪失最佳的手術機會，需依賴化療等綜合治療方法來延長患者生命。有關晚期胃癌的化療方案繁多，一線化療方案的最佳選擇為兩種藥物的組合。已有的研究發現奧沙利鉑可廣泛應用于消化道惡性腫瘤的治療［1］。地西他濱是一種胞苷類似物，是一種DNA 甲基轉移酶抑制劑，DNA 甲基轉移酶被地西他濱結合而不能起作用，在重復復制后導致顯著的去甲基化［2］，主要用于急性白血病、卵巢癌等惡性腫瘤的治療［3］。研究報道，奧沙利鉑和地西他濱抗腫瘤機制與調控Wnt/β-Catenin 信號轉導通路有關。奧沙利鉑聯合氟尿嘧啶通過調控Wnt/β-Catenin 信號轉導通路，可抑制人肝癌SK-HEP1 細胞的增殖及誘導細胞調亡，發揮協同抗腫瘤作用［4］。地西他濱也可通過下調β-Catenin蛋白表達抑制Wnt/β-Catenin信號通路，誘導宮頸腺癌Hela 細胞凋亡［5］。目前國內外有關奧沙利鉑聯合地西他濱抗腫瘤作用研究較少，其機制是否與調控Wnt/β-Catenin 信號通路有關仍有待研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 胃癌細胞株MKN-28 購自中科院上海細胞所；胎牛血清及DMEM 培養基購自美國Hyclone 公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自國藥集團；PBS 購自武漢博士德生物工程有限公司；Triton-100 購自美國Sigma Aldrich公司；細胞培養板購自美國Hyclone 公司；胰蛋白酶購自美國Sigma Aldrich 公司；兔抗Wnt 一抗購自Cell Signaling 公司；兔抗β-Catenin 一抗購自SANTA CRUZ 公司；DAPI 及MTT 購自美國Sigma Aldrich 公司；Wnt/β-Catenin 信號通路抑制劑XAV-939 購自Selleck 公司；二氧化碳細胞培養箱購自上海新苗醫療器械制造有限公司；倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯；超凈工作臺購自蘇凈集團；垂直電泳儀和凝膠成像儀購自美國Bio Rad 公司；低溫高速離心機購自美國貝克曼庫爾特公司；熒光顯微鏡購自萊卡公司；其余試劑均為市售。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 人胃癌MKN-28 細胞為貼壁生長細胞，常規培養于含10%小牛血清、100 μ/mL 青霉素的RPMI-1640 培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養。每日顯微鏡下觀察，細胞呈單層生長，鋪滿培養瓶時傳代。傳代時常規吸去培養液，PBS洗2 ～3 遍，以0.25%胰酶消化適度，吸去胰酶，加適量培養液吹打成單細胞懸液，分瓶繼續培養，取對數生長期細胞制成細胞懸液。

1.2.2 實驗分組 細胞培養良好后隨機分為五組：對照組（n= 6）、奧沙利鉑組（n= 6）、地西他濱組（n=6）、奧沙利鉑聯合地西他濱組（n=6）、Wnt/β-Catenin信號通路抑制劑XAV-939組（n=6）。奧沙利鉑、地西他濱分別溶于DMSO 配制成20 mmol/L儲存液，-80 ℃保存，使用時用改良伊格爾培養基DMEM 稀釋至所需濃度，DMSO 在培養體系中的終濃度低于0.1%。將4 組細胞培養良好后棄培養液后，其中對照組、奧沙利鉑組、地西他濱組細胞內預加入培養液100 μL，再將對照組細胞給予DMSO（100 μg/mL，100 μL）處理，奧沙利鉑組給予奧沙利鉑（10 mg/L，100 μL）處理，地西他濱組細胞給予地西他濱（20 mg/L，100 μL）處理；奧沙利鉑聯合地西他濱組細胞給予二者處理（二者濃度分別為10 mg/L 和20 mg/L，各100 μL），抑制劑XAV-939 組給予XAV-939（10 mg/L，100 μL）處理。各組細胞處理4 h 后進行相應的后續處理。

1.2.3 DAPI 染色法檢測細胞凋亡 將五組細胞處理4 h后，用無菌的PBS沖洗3次，每次沖洗15 min。沖洗完畢后用冰丙酮（-20 ℃冰箱中預置2 h，待用）固定30 min。各組細胞中均加入適量DAPI 溶液至覆蓋細胞表面，20 ℃無菌條件下（置于超凈工作臺上）染色10 min。棄去DAPI 染色液，用無菌的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞3 次，每次沖洗15 min。每次沖洗過程中輕輕振搖（置于脫色搖床上實現）。沖洗完畢后將玻片置于熒光顯微鏡下觀察拍照（染色至拍照時間控制在2 h 內）。設置的激發波長為360～400 nm。

1.2.4 MTT 法分析細胞增殖抑制率 取對數生長期細胞用0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液，吹打重懸細胞成濃度為5 × 104個/mL 細胞懸液，平行接種于96 孔培養板中，待細胞接近70%融合時，將胃癌細胞株MKN-28 按照1.2.2 分組方法隨機分為4 組，各組加入相應處理物共培養。于1、2、4 h 輕輕棄去各組細胞培養孔內的培養液，加入20 μL 的MTT 繼續于37 ℃、5%二氧化碳培養箱條件下培養。PBS 沖洗后在各組細胞中加入150 μL DMSO，震蕩處理。用酶標儀檢測培養后細胞培養板各個培養孔的吸光度值，并計算抑制率。細胞的增殖抑制率，抑制率＝（對照組OD值-試驗組OD值）/對照組OD值×100%。

1.2.5 Western Blotting 法檢測蛋白分子表達 各組細胞進行相應的處理后采用IP 細胞裂解液裂解貼壁細胞（碧云天生物工程研究所），提取細胞的總蛋白并進行總蛋白定量。然后各組細胞均進行等量總蛋白上樣后進行十二烷基苯磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（電泳的電壓設置為100 V，電泳的時間約為90 min），各點樣孔中的溴酚藍電泳至凝膠底部時斷開電源并停止電泳。電泳結束后小心取下凝膠并進行半干法PVDF 轉膜（轉膜電流為300 mA，轉膜的時間45 min）。轉膜后對PVDF 膜進行小沖洗。用純化水配置的5%的胎牛血清進行封閉10 min。在20 ℃的室溫條件下將PVDF 膜與Wnt 和β-Catenin 第一抗體（稀釋倍數為300×）培養60 min，無菌PBS 沖洗（每次5 min，共沖洗3 次）后，與二抗（稀釋倍數為800×）共培養50 min。PBS沖洗3 次后DAB 顯色，拍照。

1.2.6 免疫熒光細胞化學法分析Wnt/β-Catenin信號通路蛋白表達 取在無菌蓋玻片上生長良好胃癌細胞株MKN-28，經上述4 組相應處理4 h 后，用無菌的PBS 沖洗3 次，然后參考1.2.4 方法進行細胞的冰丙酮固定。固定后的胃癌細胞在無菌凈化工作臺上吹干，用1.0%體積分數的Triton-100增加各組細胞通透性。用5.0%的胎牛血清白蛋白溶液封閉。分別用相應濃度的第一抗體稀釋液于20 ℃條件下處理細胞3 h，無菌PBS 漂洗3 次。將漂洗后的細胞載玻片與FITC 標記二抗避光37 ℃孵育2 h，無菌磷酸鹽緩沖液漂洗3 次后用熒光顯微鏡拍照（二抗孵育完畢至拍照時間控制在160 min）。

1.3 統計學方法 統計采用SPSS 21.0 統計軟件完成，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，總體比較有差異再采用SNK-q檢驗進行兩兩比較。組間P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 奧沙利鉑聯合地西他濱對MKN28 胃癌細胞株增殖的抑制作用 與對照組相比，奧沙利鉑組、地西他濱組、聯合組和XAV-939 組細胞在1、2 和4 h 的細胞抑制率明顯升高，呈時間依賴性，差異有統計學意義（P＜0.05）；同時與奧沙利鉑組、地西他濱組和XAV-939 組細胞相比，聯合組細胞在1、2 和4 h 的細胞抑制率最高，且差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 奧沙利鉑聯合地西他濱對胃癌細胞增殖抑制率分析Fig.1 Effect of Oxaliplatin combined with dicitabine on proliferation of gastric cancer cells

2.2 DAPI 染色分析MKN28 細胞的凋亡 DAPI染色分析細胞的凋亡形態時，發現與對照組細胞相比，其余4 組細胞的凋亡小體數量明顯增多（箭頭指向為凋亡小體），且聯合組細胞的凋亡小體數量最多。見圖2。

圖2 DAPI 染色分析細胞的凋亡情況Fig.2 DAPI staining analyzed the gastric cancer cell apoptosis

2.3 Western Blotting 法分析Wnt/β-Catenin 信號通路蛋白表達 采用Western Blotting 法檢測Wnt和β-Catenin 蛋白表達水平并計算出灰度值，初步得出，與對照組細胞相比，其余4 組細胞的Wnt 和β-Catenin 蛋白水平明顯降低（P＜0.05），且奧沙利鉑聯合地西他濱組上述蛋白表達降低最明顯（P＜0.05），見圖3、4。

圖3 WB 法分析Wnt 和β-Catenin 蛋白表達Fig.3 The expression of Wnt and β-Catenin in each group by western blot

2.4 免疫細胞化學法分析Wnt 和β-Catenin 蛋白表達變化 免疫細胞化學法分析發現，Wnt 和β-Catenin 蛋白主要定位在細胞漿中，與對照組細胞相比，其余4 組細胞的細胞漿中Wnt 和β-Catenin蛋白熒光強度減弱，提示四組細胞中Wnt 和β-Catenin 蛋白的表達明顯降低，且聯合組細胞上述蛋白細胞漿中熒光強度減弱最明顯。見圖5、6。

3 討論

胃癌是消化道惡性腫瘤的最常見和多發的類型，也是臨床上導致死亡主要原因。化療是晚期胃癌的主要治療方法之一。在NCCN 指南中，唯一的1 類化療方案推薦是5-FU 或卡培他濱與順鉑聯合使用，奧沙利鉑和地西他濱在臨床工作中已經廣泛應用于惡性腫瘤的治療，Sylwia 使用藥理學模型進行藥物-藥物相互作用分析發現，地西他濱與5-FU 或奧沙利鉑聯合在改善結直腸癌患者的治療效果中顯示出更具有吸引力的協同作用［6］。但是關于其聯合用藥的實驗證據及所涉及到的分子信號通路尚存在爭議。因此探索抗腫瘤細胞作用的細胞通路調控分子機制對抗胃癌新藥的研發和臨床診治具有重要的實踐價值。本研究用MTT法分析法得出，奧沙利鉑、地西他濱、奧沙利鉑聯合地西他濱能呈現時間依賴性抑制胃癌MNK-28細胞的增殖，兩者聯合抑制率最高。進一步采用DAPI 染色發現，奧沙利鉑、地西他濱、奧沙利鉑聯合地西他濱能誘導胃癌細胞凋亡，且兩者聯合誘導凋亡作用最明顯。初步得出奧沙利鉑聯合地西他濱能協同抑制胃癌細胞增殖，誘導細胞凋亡。

圖4 各組細胞中Wnt 蛋白及β-Catenin 蛋白灰度值Fig.4 Gray value of Wnt and β-Catenin in each group

圖5 免疫細胞化學法分析Wnt 蛋白表達變化Fig.5 The fluorescence intensity of Wnt in each group by immunocytochemistry

圖6 免疫細胞化學法分析β-Catenin 蛋白表達變化Fig.6 The fluorescence intensity of β-Catenin in each group by immunocytochemistry

以往的研究也發現毛細管形態發生基因2可以通過激活Wnt/β-Catenin 信號通路維持胃癌干細胞樣細胞的表型［7］。LIU 等［8］的研究也發現TIPE1 可以通過下調胃癌細胞株中Wnt/β-Catenin信號轉導通路進而發揮對腫瘤細胞侵襲和轉移過程的抑制作用。miR-324-3p 通過激活smad4 介導的Wnt/β-Catenin 信號通路干預胃癌細胞的增殖，且miR-324-3p/Smad4/Wnt 信號軸可能是預防胃癌進展的潛在治療靶點［9］。miR-302b 通過靶向EphA2/Wnt/β-Catenin/EMT 通路作為胃癌細胞腫瘤發生和轉移的關鍵抑制因子［10］，HOTAIR 通過上調miR-34a 抑制胃癌細胞的DDP 抗性，HOTAIR/miR-34a 軸對胃癌細胞的影響可能與PI3K/Akt 和Wnt/β-Catenin 信號通路有關［11］，表明Wnt/β-Catenin 信號轉導通路可能是胃癌發生與轉移的和化療藥物作用的關鍵通路。為進一步闡明奧沙利鉑聯合地西他濱是否通過Wnt/β-Catenin 信號轉導通路抑制胃癌增殖及誘導凋亡，本研究還使用蛋白印跡和免疫細胞化學法來檢測藥物干預后Wnt/β-Catenin信號通路相關蛋白的表達，結果均提示，奧沙利鉑、地西他濱、兩者聯合處理胃癌MNK-28 細胞4 h后，細胞Wnt 和β-Catenin 蛋白水平明顯降低，且聯合組的上述蛋白表達降低最明顯，Wnt/β-Catenin信號通路抑制劑XAV-939 組阻斷該信號通路后細胞上述蛋白表達水平也降低，說明阻斷Wnt/β-Catenin 信號轉導通路相關蛋白的表達與可以顯著抑制胃癌細胞的增殖并誘導細胞凋亡，這與目前大部分關于消化道惡性腫瘤與Wnt/β-catenin 信號通路關系的研究一致。奧沙利鉑聯合地西他濱處理胃癌細胞后，細胞Wnt 和β-Catenin 蛋白水平降低更明顯，表明奧沙利鉑聯合地西他濱協同抗胃癌細胞的作用可能與抑制Wnt/β-Catenin 信號通路Wnt 和β-Catenin 蛋白表達有關。

綜上所述，奧沙利鉑聯合地西他濱能明顯抑制胃癌細胞株MKN-28 增殖并呈時間依賴性，可誘導細胞凋亡，其協同抗胃癌機制可能與抑制Wnt/β-Catenin 信號通路Wnt 和β-Catenin 蛋白表達有關，這為兩者聯合優化用于抗胃癌的基礎研究和臨床實踐提供了理論依據。由于蛋白磷酸化形式是細胞內信號轉導的主要形態，可調節和控制相應的蛋白質活性，本研究僅僅進行了奧沙利鉑聯合地西他濱對Wnt/β-Catenin 信號通路Wnt 和β-Catenin 蛋白表達的影響，后續的研究中將進一步分析其對Wnt/β-Catenin 信號通路Wnt 和β-Catenin等相關蛋白磷酸化形式水平的變化，為進一步闡明奧沙利鉑聯合地西他濱協同抗腫瘤作用的分子機制提供更多理論依據。