NIMA相關蛋白激酶7、Nod樣受體蛋白3與多囊卵巢綜合征炎癥指標相關性研究

王耀琴，許素銘，齊改梅，畢星宇，李艷宏，張新，武學清

（山西省兒童醫院 山西省婦幼保健院生殖醫學中心，太原 030013）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是育齡期婦女常見的內分泌紊亂型疾病，常伴隨有肥胖、血脂異常、胰島素抵抗及慢性炎癥。研究指出，大部分PCOS患者由于外周血中炎性因子［C反應蛋白（CRP）、白細胞介素－1β（IL－1β）、IL－18、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、單核細胞趨化蛋白－1（MCP－1）、可溶性細胞間黏附分子（sICAM）和可溶性內皮白細胞黏附分子（sE－selectin）等］高表達，使PCOS機體處于慢性炎癥狀態［1］。另外，有研究顯示PCOS卵巢功能異常的病理改變與炎性細胞在卵巢中的侵潤和慢性炎癥有關［2－4］。因此，研究炎癥對PCOS發生發展的作用至關重要。

目前，Nod樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體激活機制是大家關注的熱點。NLRP3炎性小體識別病原體相關分子模式，活化半胱氨酸蛋白酶－1（caspase－1），導致IL－1β和IL－18的成熟和分泌，介導炎癥反應誘導細胞凋亡［5－6］。2016年有研究顯示，NIMA相關蛋白激酶7（NEK7）是NLRP3炎性小體激活過程必需的調節物質［7－8］。NEK7 作為NLRP3炎性復合體參與炎性小體的激活，調節炎性疾病的進展。研究顯示，鉀離子外流激活NEK7，調節NLRP3的寡聚化和激活，而NEK7一旦沉默，NLRP3炎性小體（包括NLRP3、caspase－1和IL－1β）表達則被抑制［9］。更為重要的是，NEK7作為一個細胞開關，在細胞周期有絲分裂和炎癥小體的激活中起著重要的作用［5］。因此，NEK7可能成為炎癥疾病治療和預防的新靶點。

盡管關于NEK7和NLRP3調節關系的研究受到廣泛關注，但到目前為止，針對PCOS中NEK7／NLRP3炎性小體激活關系的研究甚少。本研究旨在通過檢測PCOS患者卵巢顆粒細胞中NEK7、NLRP3在mRNA水平表達量的變化，探討其與PCOS各指標的相關性和預測價值，為PCOS慢性炎癥的治療及預防提出新策略。

資料和方法

一、研究對象

選取2018年8月至2019年3月于山西省兒童醫院／山西省婦幼保健院生殖醫學中心就診的PCOS患者為研究組（n＝30），選擇同期非PCOS不孕患者為對照組（n＝34）。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

研究組納入標準：PCOS患者均符合鹿特丹診斷標準，即：（1）稀發排卵或不排卵；（2）高雄或高雄激素血癥；（3）卵巢的多囊樣改變（卵巢存在≥12個直徑2～9mm的卵泡或卵巢體積＞10cm3）。至少符合其中2項，并除外3個月內接受過促排卵治療，曾接受過放化療治療或卵巢手術，合并子宮內膜異位癥、先天性腎上腺增生、庫欣綜合征、垂體腫瘤或糖尿病等。

對照組納入標準：（1）因男方因素或輸卵管因素不孕就診的患者；（2）月經周期規則；（3）內分泌激素水平正常；（4）無發熱及炎癥性疾病。排除標準：所有患者均排除吸煙、飲酒、最近6個月內服用影響炎癥反應的藥物及其他炎癥性疾病，如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、高血壓、潰瘍性結腸炎或惡性血液系統疾病等。

二、方法

1．促排卵方案：根據每個患者自身情況綜合評估，定期監測卵泡大小和血清LH、E2水平，并調整用藥，進行促排卵。當B超監測到至少3個卵泡直徑≥18mm時，于當日注射HCG（珠海麗珠醫藥）5 000～10 000U，36h后經陰道超聲引導下穿刺取卵。

2．基礎性激素水平檢測：月經來潮的第2～3天，空腹抽取患者靜脈血，采用化學發光酶聯免疫法（自動酶聯免疫分析儀AIA－2 000ST，日本東曹株式會社）進行性激素（PRL、LH、FSH、E2、P 和 T）測定。

3．卵巢顆粒細胞及卵泡液上清液的收集：參照前期發表文章［10］收集卵巢顆粒細胞冷凍保存用于實時定量PCR（qPCR）檢測，并收集離心所得卵泡液上清，用于后續酶聯免疫（ELISA）檢測炎癥因子IL－1β和IL－18的表達。

4．NEK7和NLRP3mRNA表達量的檢測：參照EZNA 提取試劑盒（OMEGA，美國）說明書操作，提取卵巢顆粒細胞總RNA，檢測RNA濃度與純度。使用反轉錄試劑盒（北京全式金生物）將1μg總RNA進行逆轉錄，產物用于qPCR擴增，引物退火溫度為60℃，擴增循環設定為40個循環，GAPDH作為內參，采用2－△△Ct計算mRNA的相對表達量，引物序列見表1所示。

表1 實時定量PCR引物序列及產物長度

5．炎癥相關指標檢測：應用酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物）檢測卵泡液上清中炎癥相關指標IL－1β、IL－18的表達水平，操作按試劑盒說明書要求進行。

三、統計學方法

所得數據采用SPSS 19．0軟件進行統計學分析。計量資料用均值±標準誤（珔x）表示，并采用獨立樣本t檢驗；各因素間關系分析采用Spearman相關性分析；應用ROC曲線分析NEK7、NLRP3的診斷效能；以P＜0．05為差異具有統計學意義。

結 果

一、兩組患者的一般資料及促排卵實驗室指標比較

本研究共納入64例患者，研究組30例，對照組34例。兩組間年齡、不孕年限、月經初潮年齡、基礎FSH、E2、P水平比較，差異均無統計學意義（P＞0．05），而研究組的BMI、基礎LH、LH／FSH和T顯著高于對照組（P＜0．05）；促排卵實驗室指標比較顯示，兩組的MⅡ卵率和受精率比較無顯著性差異（P＞0．05），研究組的獲卵數顯著高于對照組（P＜0．05）（表2）。

二、兩組患者卵泡液中炎癥相關因子的表達比較

結果顯示，研究組卵泡液中炎癥因子IL－1β的表達水平［（3．43±0．50）pg／ml］顯著高于對照組［（1．17±0．11）pg／ml］（P＝0．000 1），研 究 組IL－18的表達水平［（143．6±26．32）pg／ml］顯著高于對照組［（56．35±3．61）pg／ml］（P＝0．002 4）（圖1）。

表2 兩組患者一般臨床資料及促排卵指標比較（x ）

表2 兩組患者一般臨床資料及促排卵指標比較（x ）

注：與對照組比較，＊P＜0．05，＃P＜0．001

組 別 例數 年齡 不孕年限 初潮年齡 BMI（kg／m2）基礎LH（U／L）基礎FSH（U／L） LH／FSH對照組 34 30．03±0．82 4．69±0．56 13．65±0．26 22．37±0．45 5．35±0．56 8．66±0．41 0．64±0．06研究組 30 29．40±0．68 4．55±0．59 13．43±0．24 26．10±0．64＃ 8．30±0．94＊ 8．22±0．48 1．19±0．18＊組 別 例數 基礎E2（pmol／L）基礎P（nmol／L）基礎T（nmol／L） 獲卵數 MⅡ卵率 受精率對照組 34 302．06±17．57 1．87±0．35 1．36±0．11 17．59±1．76 0．79±0．04 0．84±0．03研究組 30 295．98±35．58 2．00±0．22 1．79±0．18＊ 25．40±2．73＊ 0．80±0．04 0．87±0．03

圖1 兩組卵泡液中炎癥因子IL－1β、IL－18的表達水平比較

三、卵巢顆粒細胞中NEK7及NLRP3mRNA的相對表達量比較

研究組患者卵巢顆粒細胞中NEK7及NLRP3 mRNA的表達量均顯著高于對照組［分別為（1．39±0．17）vs．（0．94±0．13）；（1．70±0．26）vs．（1．06±0．10）］（P＜0．05）（圖2）。

四、顆粒細胞中NEK7、NLRP3mRNA表達量與各指標的相關性分析

將研究組患者顆粒細胞中NEK7、NLRP3mRNA表達量分別與各指標進行相關性分析，結果表明顆粒細胞NEK7、NLRP3mRNA表達水平與基礎LH、LH／FSH 及炎癥因子IL－1β、IL－18呈顯著正相關（P＜0．05）（表3）。

圖2 兩組卵巢顆粒細胞中NEK7和NLRP3mRNA表達水平比較

表3 顆粒細胞中NEK7、NLRP3mRNA表達與PCOS指標的相關性

五、NEK7和NLRP3mRNA對PCOS的診斷價值

ROC曲線對比分析顯示，NEK7mRNA水平診斷PCOS的AUC為0．741，NLRP3mRNA診斷PCOS的AUC為0．694，而二者聯合診斷PCOS的AUC為0．728，且均有統計學意義（P＜0．05）。但NEK7和NLRP3mRNA的聯合使用并不能有效增加對PCOS的診斷價值（圖3、表4）。

圖3 ROC曲線分析

表4 各指標應用于PCOS診斷的ROC曲線統計描述

討 論

PCOS是臨床常見的導致排卵障礙性不孕的主要原因，臨床特征主要表現為：稀發排卵或不排卵、高雄和／或高雄激素血癥和卵巢的多囊樣改變。PCOS病因學復雜，目前認為慢性炎癥也是影響PCOS的一個重要因素。有研究指出高雄激素下，PCOS患者胰島素受體信號通路與炎性因子信號轉導相互影響［11］，刺激卵巢內炎癥因子IL－6、TNF－α分泌，造成卵巢組織慢性炎癥，引起卵泡閉鎖和退化過程受阻，最終導致排卵障礙和囊狀卵泡形成［3，12］。PCOS患者常伴有糖耐量異常，增加了脂質過氧化，導致患者氧化應激水平升高，而卵巢組織氧化應激又可引起卵泡細胞膜脂質過氧化，從而導致卵巢功能紊亂［13］。慢性炎癥和胰島素抵抗又可進一步加劇PCOS的病理進程［14］。因此，研究PCOS慢性炎癥的發生與發展至關重要。

然而，PCOS的炎癥機制目前尚未完全清楚。NLRP3炎癥小體是由胞內固有免疫受體NLRP3、接頭蛋白ASC和半胱氨酸蛋白酶caspase－1作為核心組成的多蛋白復合物，誘導炎癥因子IL－1β和IL－18的成熟和分泌，從而促進炎癥的發生，而NLRP3炎癥小體的激活需要NEK7的參與。目前關于NEK7及NLRP3在PCOS低度慢性炎癥中的炎癥激活通路的研究尚未見報道。在本研究中，我們利用qPCR技術發現研究組患者卵巢顆粒細胞中NEK7及NLRP3在mRNA水平表達量增加。

此外也有證據表明，通過體外受精（IVF）助孕的患者其炎癥因子不僅影響卵母細胞的受精，而且與妊娠能否成功密切相關［15］。在本研究中，我們發現研究組卵泡液中炎癥因子IL－1β和IL－18高表達。IL－1β是NLRP3炎癥小體激活的下游關鍵效應分子，影響系統或局部炎癥反應，IL－1β和TNF－α共同參與免疫和炎癥反應［16］。有研究報道IL－1β和TNF－α是影響排卵和妊娠成功的重要標記物［17］。炎性小體信號通路中另一個炎癥因子IL－18，可被半胱氨酸蛋白酶caspase－1激活并釋放［18］。IL－18是一個多功能炎癥因子，在對抗宿主感染中起重要防御作用，在卵泡液中有顯著表達［19］。有研究顯示，取卵日血清中高水平的IL－18可能預示PCOS和卵巢過度刺激綜合征的發生，而低水平的IL－18被發現是不明原因不孕的一個特征［20－21］。以上結果提示我們，PCOS卵巢顆粒細胞中NEK7及NLRP3的高表達可能促進卵泡液中炎癥因子IL－1β和IL－18的釋放，導致PCOS患者出現低度慢性炎癥。本研究中相關性研究結果顯示，NEK7及NLRP3mRNA表達水平與炎癥因子IL－1β、IL－18呈顯著正相關，進一步證明了NEK7與NLRP3炎癥小體激活通路在PCOS炎癥發生與發展中發揮一定作用。

另外，相關性研究結果顯示NEK7及NLRP3與LH和LH／FSH呈顯著正相關，提示NEK7及NLRP3可能與PCOS的發生相關。對此我們進行ROC曲線分析，研究結果顯示NEK7mRNA水平對PCOS具有良好的診斷價值，而二者聯合應用并不能有效增加對PCOS的診斷價值。

綜上，PCOS患者卵巢顆粒細胞中NEK7及NLRP3在mRNA水平高表達，其可能通過激活炎性小體信號通路，促進炎癥因子IL－1β、IL－18的釋放，導致PCOS慢性炎癥。同時NEK7對PCOS具有良好診斷價值，提示NEK7可能作為PCOS的治療靶點，為PCOS的治療提供新思路。