放療與腫瘤微環(huán)境的相關(guān)進(jìn)展

蘇琳琳 周歡娣 薛曉英

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

手術(shù)、放療、化療是癌癥的三大主要治療手段。世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，三者對(duì)癌癥治療的貢獻(xiàn)率分別為27%、22%、和6%，其中放療的作用與手術(shù)相當(dāng)。另?yè)?jù)WHO統(tǒng)計(jì)，腫瘤患者中近70%患者需要放射治療。放療會(huì)影響腫瘤發(fā)生特異性免疫，包括顯著增加 CD8+T細(xì)胞啟動(dòng)〔1〕、增強(qiáng)腫瘤特異性抗原釋放〔2〕、誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡(ICD)〔3〕、促使主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ和新抗原表達(dá)〔4〕、促進(jìn)Ⅰ型干擾素(IFN)〔5〕和補(bǔ)體生成〔6〕、提高活化性受體凝集素樣同型二聚體(NK2GD)配體表達(dá)〔7〕。放療誘導(dǎo)的ICD會(huì)導(dǎo)致胞外鈣網(wǎng)蛋白過(guò)表達(dá)，并釋放損害相關(guān)性分子模型(DAMPs)高機(jī)動(dòng)性組盒(HMGB)1和三磷酸腺苷(ATP)。這些分子可募集并激活抗原提呈細(xì)胞，進(jìn)而啟動(dòng)與腫瘤特異性抗原相關(guān)的T細(xì)胞反應(yīng)〔8，9〕。由此可見(jiàn)，放療與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系十分密切。其中，放療過(guò)程中出現(xiàn)的遠(yuǎn)隔效應(yīng)就是這一復(fù)雜關(guān)系的產(chǎn)物之一。而外泌體作為腫瘤免疫微環(huán)境成員之一，對(duì)腫瘤的生物學(xué)行為及輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)影響重大。本文對(duì)放療與腫瘤微環(huán)境的相關(guān)進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 放療與外泌體

1.1外泌體概況 細(xì)胞可分泌各種酶類、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、局部介質(zhì)、血清蛋白、抗體、細(xì)胞外基質(zhì)等成分。此外，還可釋放一些囊泡類物質(zhì)，細(xì)胞釋放到胞外微環(huán)境的囊泡主要有三種類型：外泌體、細(xì)胞微泡和凋亡小體〔10〕。外泌體是一種膜性結(jié)構(gòu)的囊泡，直徑最小為50～150 nm，來(lái)自胞內(nèi)早期形成的多囊體，可由正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞釋放，內(nèi)含微小RNA、信使RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等成分〔11〕。外泌體的生物進(jìn)程包含四個(gè)主要步驟：起始膜形成、胞吞、多囊體形成、分泌至胞外或被溶酶體溶解。因其參與細(xì)胞之間的通信交流〔12〕、免疫反應(yīng)〔13〕和凋亡逃逸〔14〕，近些年最受關(guān)注。

1.2放療對(duì)外泌體形成分泌及構(gòu)成的影響 外泌體的前體是細(xì)胞膜形成的早期多囊體，釋放到細(xì)胞外通過(guò)吞噬或膜融合的方式由受體細(xì)胞攝取，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)某一特殊過(guò)程。電離輻射對(duì)外泌體釋放最顯著的兩個(gè)影響因素為：輻射誘導(dǎo)的DNA損傷及p53相關(guān)通路的激活。放療不僅會(huì)直接導(dǎo)致DNA的損傷，還可激活許多相關(guān)通路，p53就是其中之一。受環(huán)境應(yīng)力影響的p53蛋白可調(diào)節(jié)許多基因的轉(zhuǎn)錄，一些受此蛋白調(diào)節(jié)的分泌蛋白會(huì)參與相鄰細(xì)胞的信息交流。Yu等〔15〕應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法探測(cè)受照射的細(xì)胞培養(yǎng)基中依賴p53通路分泌的蛋白含量，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中除了已知的p53基因轉(zhuǎn)錄的蛋白，許多非p53基因轉(zhuǎn)錄的基因編碼蛋白在激活p53后也有所增加，這些蛋白由外泌體攜帶至胞外。并發(fā)現(xiàn)一種由p53調(diào)節(jié)的基因產(chǎn)物——血清總酸性磷酸酶可提高微環(huán)境中外泌體的形成分泌，進(jìn)而與臨近細(xì)胞甚至免疫系統(tǒng)細(xì)胞進(jìn)行信息交流。

外泌體不僅是內(nèi)含細(xì)胞殘骸的質(zhì)膜性胞外囊泡，還包含某些特殊的分子。ExoCarta 2012數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)總結(jié)了不同來(lái)源外泌體的分子構(gòu)成情況，包括外泌體的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA〔16〕。外泌體的構(gòu)成主要取決于分泌細(xì)胞的類型，也受分泌細(xì)胞暴露條件的影響，其中最主要的暴露因素是電離輻射。有研究認(rèn)為電離輻射對(duì)外泌體構(gòu)成的影響取決于細(xì)胞模型和電離輻射模式的不同：Arscott等〔17〕用4 Gy的電離輻射(IR)照射24～48 h多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞U87MG，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子mRNA及 胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2抗體蛋白表達(dá)水平顯著提高；Lehmann等〔18〕用4 Gy的IR照射前列腺癌細(xì)胞(22Rv1)96 h，檢測(cè)到B7-H3蛋白含量顯著增多；Hurwitz等〔19〕證明經(jīng)放療的病人血清中熱休克蛋白72含量增多；Jelonek等〔20〕則用以2 Gy的劑量照射人頭頸部鱗癌細(xì)胞(FaDu)18 h后，參與翻譯轉(zhuǎn)錄的蛋白真核起始因子(EIFs)，葉酸水解酶(PSMs)，核糖體蛋白(RPLs)和核蛋白體蛋白(RPSs)、與細(xì)胞周期或細(xì)胞分裂有關(guān)的蛋白(分子伴侶、泛素化相關(guān)蛋白和蛋白酶)及細(xì)胞信號(hào)蛋白核糖基化作用因子(ARFs)，Rab蛋白(RABs)及Ras蛋白(RASs)含量增多，而載脂蛋白類和免疫球蛋白類表達(dá)水平則降低。盡管上述研究的對(duì)象和結(jié)果不同，但一致認(rèn)為外泌體運(yùn)載的物質(zhì)確實(shí)反映了電離輻射導(dǎo)致的細(xì)胞特定變化。

1.3外泌體的功能及對(duì)放療的影響 正常細(xì)胞的外泌體參與啟動(dòng)免疫調(diào)節(jié)活動(dòng)。外泌體攜帶的MHC-肽復(fù)合物與同源T細(xì)胞受體結(jié)合激活致敏性CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞〔21，22〕，進(jìn)而協(xié)助啟動(dòng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免受腫瘤等異物傷害。外泌體激活免疫反應(yīng)的能力與其攜帶的膜抗原有關(guān)〔23〕，免疫效應(yīng)則取決于細(xì)胞的生理狀態(tài)〔24〕。

腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體也可能攜帶免疫抑制肽復(fù)合體，通過(guò)某些機(jī)制抑制機(jī)體免疫反應(yīng)。有研究證明外泌體能夠減慢自然殺傷細(xì)胞〔25〕或CD4+/CD8+T細(xì)胞〔26〕的增殖、促進(jìn)骨髓細(xì)胞〔27〕和調(diào)節(jié)T細(xì)胞〔28〕的變異，從而抑制或干擾機(jī)體的免疫反應(yīng)，幫助腫瘤逃脫免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。來(lái)自腫瘤細(xì)胞的外泌體還與腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究表明〔17〕，照射引起的外泌體特定變化在一定程度上通過(guò)加強(qiáng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)-酪氨酸蛋白激酶(Trk)A及黏著斑激酶(FAK)信號(hào)通路的激活促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷徙和轉(zhuǎn)移。

近來(lái)有研究強(qiáng)調(diào)環(huán)境應(yīng)力對(duì)外泌體調(diào)節(jié)細(xì)胞間信息交流影響重大，并證明電離輻射可通過(guò)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)顯著影響細(xì)胞之間的信息交流。外泌體通過(guò)向周圍或遠(yuǎn)處靶細(xì)胞傳遞與細(xì)胞凋亡、生存、分裂、生長(zhǎng)、變異有關(guān)的或多重或獨(dú)特的信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的信息交流〔29〕，進(jìn)而影響腫瘤生物學(xué)行為及治療效果。與輻射相關(guān)的細(xì)胞間信息交流對(duì)放療影響最明顯的是輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)，是指通過(guò)細(xì)胞接觸或細(xì)胞間通訊將直接受照射細(xì)胞的應(yīng)答傳遞給周圍未受輻射的細(xì)胞，后者也表現(xiàn)出與受照射細(xì)胞類似的生物學(xué)效應(yīng)〔30～35〕。外泌體在RIBE中發(fā)揮著關(guān)鍵作用：Al-Mayah等〔36，37〕先后證明受照MCF7 細(xì)胞的旁效應(yīng)，與輻射引起的基因不穩(wěn)定性和外泌體的含量及其攜帶的RNA、蛋白質(zhì)息息相關(guān)。

此外，受照細(xì)胞對(duì)外泌體的攝取也受影響。有研究〔38〕表明，暴露于電離輻射的人骨髓源性細(xì)胞會(huì)通過(guò)CD29/CD81絡(luò)合物的生成和依賴p38絲裂原活化蛋白激酶的胞吞和胞飲增加對(duì)外泌體的攝取。

2 遠(yuǎn)隔效應(yīng)

Mole〔39〕最初描述道，放療的遠(yuǎn)隔效應(yīng)是指照射原發(fā)腫瘤，照射路徑外的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤體也有反應(yīng)的現(xiàn)象。腫瘤免疫反應(yīng)的抑制支持了免疫系統(tǒng)對(duì)遠(yuǎn)隔效應(yīng)有影響的假設(shè)。我們認(rèn)為遠(yuǎn)隔效應(yīng)是由系統(tǒng)抗腫瘤免疫反應(yīng)引起的，但這種現(xiàn)象在臨床實(shí)踐中很罕見(jiàn)〔40〕。系統(tǒng)免疫反應(yīng)的缺失是由腫瘤微環(huán)境中局部免疫抑制造成的。免疫效應(yīng)細(xì)胞包括骨髓衍生抑制細(xì)胞(MDSC)、FoxP3+T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Tregs)、抑制性細(xì)胞因子(如：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、白細(xì)胞介素-10)和一些“免疫檢查點(diǎn)”分子，這些會(huì)引起局部T細(xì)胞抑制〔41〕及樹(shù)突細(xì)胞的亞最佳啟動(dòng)。

2.1遠(yuǎn)隔效應(yīng)的臨床證據(jù) 放療本身的遠(yuǎn)隔效應(yīng)臨床罕見(jiàn)且目前只有案例報(bào)告。繼1953年Mole之后，Ehlers、Rees、Ohba、Wers?ll、Postow、Golden等又先后在乳頭狀腺癌〔42，43〕、肝細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移〔44〕、腎細(xì)胞癌腦轉(zhuǎn)移〔45〕、黑色素瘤〔46〕、轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌〔47〕的放療過(guò)程觀察并報(bào)道了這種效應(yīng)。最近，Reynders等〔40〕總結(jié)了1973～2013年間23例在單獨(dú)放療中出現(xiàn)遠(yuǎn)隔效應(yīng)的案例，中位年齡為64.5(28～83)歲，腎細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的組織類型，原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤分別占35%、65%，中位劑量為32(12.00～60.75)Gy，1.2～26.0 Gy/f。出現(xiàn)遠(yuǎn)隔效應(yīng)的平均時(shí)間是開(kāi)始放療后5個(gè)月(1～24個(gè)月)，隨訪結(jié)束或疾病進(jìn)展前13個(gè)月。

2.2遠(yuǎn)隔效應(yīng)的基礎(chǔ)研究 遠(yuǎn)隔效應(yīng)確實(shí)是由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的。Demaria等〔48〕應(yīng)用小鼠乳腺癌67NR模型證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)，并證明這種效應(yīng)具有癌種特異性。其在試驗(yàn)中觀察到放療聯(lián)合生長(zhǎng)因子Flt3配體(Flt3-L可增加樹(shù)突細(xì)胞的數(shù)量)可在同一小鼠另一相同癌種的瘤體中觀察到遠(yuǎn)隔效應(yīng)，而同一小鼠不同癌種的瘤體、單獨(dú)應(yīng)用Flt3-L或在T細(xì)胞缺陷模型中均無(wú)此現(xiàn)象；而后又利用小鼠免疫缺陷型轉(zhuǎn)移性乳腺癌4T1模型〔49〕證實(shí)局部放療原位乳腺癌和抑制細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA)-4聯(lián)合應(yīng)用可提高對(duì)肺轉(zhuǎn)移癌的控制。Dewan等〔50〕在TSA小鼠乳腺癌模型和MCA38小鼠結(jié)腸癌模型中同樣證實(shí)分割放療聯(lián)合應(yīng)用CTLA-4抗體才可誘發(fā)遠(yuǎn)隔效應(yīng)。

長(zhǎng)期以來(lái)，我們一直認(rèn)為局部放療的作用機(jī)制為射線對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用，即導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA損傷。近來(lái)有學(xué)者證明，放療的“場(chǎng)域”效應(yīng)也依賴于免疫系統(tǒng)。包括促進(jìn)腫瘤抗原擴(kuò)增、改變和表達(dá)，激活免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答，調(diào)節(jié)腫瘤間質(zhì)細(xì)胞等。 Lee等〔1〕應(yīng)用小鼠模型研究證明放療會(huì)顯著增強(qiáng)淋巴組織中T細(xì)胞啟動(dòng)導(dǎo)致原位腫瘤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤體通過(guò)依賴CD8+T細(xì)胞的形式縮小甚至消失，并進(jìn)一步證明這種由放療啟動(dòng)的免疫反應(yīng)和瘤體縮小效果會(huì)隨著長(zhǎng)期傳統(tǒng)分割放療或輔助化療減弱，卻會(huì)因局部免疫治療增強(qiáng)。有研究還證明局部高劑量放療可引發(fā)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，進(jìn)而啟動(dòng)先天性和獲得性免疫反應(yīng)攻擊腫瘤〔51〕，但若樹(shù)突細(xì)胞中缺乏IFN-α/β 受體1則不能將免疫原性的腫瘤細(xì)胞抗原呈現(xiàn)給CD8+T細(xì)胞〔52〕。

2.3如何增強(qiáng)放療的遠(yuǎn)隔效應(yīng) 免疫治療正在開(kāi)辟新前景以增強(qiáng)遠(yuǎn)隔效應(yīng)。上文已敘述放療與CTLA-4抗體、放療與Flt3-L聯(lián)合應(yīng)用在小鼠模型中均可促進(jìn)遠(yuǎn)隔效應(yīng)的出現(xiàn)。研究表明：當(dāng)前大部分免疫治療通過(guò)抑制CTLA-4、程序性死亡受體(PD)-1、TIM3等免疫抑制因子及抑制間質(zhì)細(xì)胞(如 MDSC)來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn) T細(xì)胞活化和應(yīng)答〔53〕。因此，PD-1、TIM3、MDSC有可能成為新的免疫位點(diǎn)與放療聯(lián)合應(yīng)用。

在臨床工作中，Postow等〔46〕首次報(bào)告了1例黑色素瘤轉(zhuǎn)移患者放療期間出現(xiàn)的遠(yuǎn)隔效應(yīng)，但在伊匹單抗(一種可以抑制T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)的單克隆抗體，CTLA-4) 維持治療期間疾病發(fā)生進(jìn)展。此外，Postow等〔46〕還證明腫瘤縮小和免疫抗體反應(yīng)具有時(shí)間相關(guān)性，并發(fā)現(xiàn)外周血免疫細(xì)胞(骨髓生成抑制細(xì)胞和激活的CD8+CD4+T細(xì)胞)也有變化〔46〕。此后，又有研究先后〔46，54～57〕報(bào)告了黑色素瘤患者在伊匹單抗治療時(shí)存在遠(yuǎn)隔效應(yīng)。總結(jié)得知，首次注射伊匹單抗和開(kāi)始放療的時(shí)間間隔為1.5～18個(gè)月，出現(xiàn)遠(yuǎn)隔效應(yīng)的時(shí)間是放療開(kāi)始后1～6個(gè)月。Stamell等〔55〕還觀察到在遠(yuǎn)隔效應(yīng)出現(xiàn)期間抗黑色素瘤抗體增加，MAGEA3也伴隨增多，并出現(xiàn)針對(duì)癌癥抗原PASD1的新反應(yīng)。

3 放療如何發(fā)展以提高治療效果

電離輻射不但能夠誘發(fā)免疫原性癌癥細(xì)胞死亡，還作為一種危險(xiǎn)因子發(fā)放免疫信號(hào)排斥腫瘤〔58〕。電離輻射可觸發(fā)腫瘤免疫排斥機(jī)制，首先將腫瘤轉(zhuǎn)化為獨(dú)特的原位疫苗并激發(fā)獲得性免疫反應(yīng)，通過(guò)外泌體及其介導(dǎo)的旁效應(yīng)和遠(yuǎn)隔效應(yīng)影響原位腫瘤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤體。但在許多情況下，僅靠電離輻射不能抵制腫瘤特異性免疫抑制。盡管已觀察到輻射會(huì)誘發(fā)遠(yuǎn)隔效應(yīng)并調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)，但這種反應(yīng)在臨床實(shí)踐中很少見(jiàn)。雖然放療本身足以提供細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)對(duì)腫瘤抗原交叉啟動(dòng)的必要信號(hào)，但這種輔助作用似乎相對(duì)較弱。放療會(huì)激活新的抗腫瘤CTLs，但對(duì)尚未治療的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移腫瘤，CTLs通常無(wú)法克服腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用。

但以上一系列研究已證實(shí)無(wú)論是放療使瘤體縮小的直接作用機(jī)制，還是由外泌體介導(dǎo)的旁效應(yīng)，亦或遠(yuǎn)隔效應(yīng)均與腫瘤免疫微環(huán)境密切相關(guān)甚至可通過(guò)聯(lián)合免疫治療強(qiáng)化放療療效。這給我們一個(gè)重大啟示：將系統(tǒng)免疫療法與放療相結(jié)合來(lái)提高腫瘤的治療效果。而免疫位點(diǎn)、放療模式與兩者結(jié)合的時(shí)機(jī)目前尚無(wú)定論，有待進(jìn)一步研究。