葛根素對人炎性因子腫瘤壞死因子-α誘導的小細胞肺癌細胞遷移和侵襲促進作用的影響及機制

楊潔 鄭鳳龍 任喜尚

(鄭州澍青醫學高等專科學校臨床醫學系，河南 鄭州 450064)

小細胞肺癌(SCLC)多發于重度抽煙人群，其發病率在世界范圍內呈不斷上升趨勢，嚴重威脅人類的生命健康〔1〕。臨床多見非NSCLC和小細胞肺癌這兩種肺癌類型，其中NSCLC約占20%。NSCLC惡性程度高、容易轉移、預后較差，約2/3患者就診時已進入廣泛期〔2,3〕。目前的治療手段主要包括手術、放療、化療等，但治療效果并不理想。因此，亟待找尋有效的治療方法。腫瘤壞死因子(TNF)-α來源于內皮細胞或活化的巨噬細胞，是一種具有多種生物學功能的多肽調節因子，在人體免疫過程中發揮重要作用，但過量的TNF-α則會對人體造成損傷，破壞免疫平衡，誘導炎癥發生〔4〕。葛根素(SP)是從傳統中藥葛根根部提取的一種異黃酮-C-葡萄糖苷，藥用價值很大〔5〕。有研究表明SP具有抗癌活性，可降低腫瘤細胞活力并激活Caspase-3誘導結腸癌細胞凋亡〔6〕。另有研究SP可通過減少Wnt/β-catenin信號通路活化抑制宮頸癌細胞增殖、誘導凋亡〔7〕。基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9同屬于MMPs家族，均可擾亂腫瘤微環境平衡，促進腫瘤細胞的侵襲、轉移，與腫瘤侵襲密切相關〔8〕。本研究探究SP對人炎性因子TNF-α誘導的SCLC細胞遷移和侵襲促進作用的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 H446細胞購自北京北納創聯生物技術研究院，編號為BNCC100065。

1.1.2主要試劑 RPMI1640培養液，胎牛血清(FBS)和SP單體(美國Gibco-BRL公司，批號分別為SH30809、10099-141和110752-201318)；胰蛋白酶(美國Hyclone公司，批號為J140028)；TNF-α(美國Peprotech公司，批號為300-01A)；Transwell小室和Matrigel基質膠(美國BD公司，批號分別為2500659和354238)；Trizlol reagent(美國Ambion公司，批號為15596026)；反轉錄試劑盒和PCR試劑盒(日本Takara公司，批號分別為RR047A和RR02MA)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；全蛋白提取試劑盒，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號分別為BC3711和PC0020)；鼠抗MMP-2，鼠抗MMP-9和鼠抗β-actin(美國Santa Cruz公司，批號分別為sc-13594、sc-21733和sc-58673)；羊抗鼠二抗(普利萊基因技術公司，批號為C1059)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所，批號為CK04)。

1.1.3主要儀器 MCO-18AC型CO2培養箱(日本SANYO公司)；Nanodrop2000型超微量分光光度計(美國Thermo公司)；TS100型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；Mx3000P型PCR儀(美國Agilent公司)；Mini-PROTEAN型電泳及轉膜系統，Gel Doc XR+型凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2細胞培養與分組 H446細胞置于RPMI1640培養液中(含10% FBS)，于37℃、5%CO2培養箱中培養。將對數期、生長狀態良好的H446細胞，接種于含RPMI1640培養液24孔板上(終濃度為5×104個細胞/ml)，每孔100 μl，于37℃、5%CO2條件下培養。24 h后，加入200 μl含不同濃度TNF-α或SP的培養液，使TNF-α終濃度為10 ng/ml(為TNF-α組)，SP終濃度分別為40、80、160、320、640 μg/ml，TNF-α終濃度為10 ng/ml+SP終濃度為320 μg/ml(為TNF-α+SP組)。對照組加入200 μl RPMI1640培養液(為Con組)。

1.3集落形成試驗檢測各組細胞集落形成能力 用含有10% FBS的RPMI1640培養液將Con組和TNF-α組H446細胞制成懸浮液，調整細胞密度為5×107/L，接種于內含4 ml完全培養液的24孔板中繼續培養，每個處理組細胞設置5個平行孔。每孔接入100 μl懸浮液。待培養至出現肉眼可見的集落后，棄培養液；用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入4 ml甲醇在室溫條件下固定15 min；棄甲醇，每孔加入1 ml結晶紫染液，避光染色15 min；自來水沖洗，晾干后于顯微鏡下計數。

1.4Transwell實驗檢測H446細胞遷移、侵襲能力 分別于培養24 h后檢測Con組和TNF-α組細胞遷移、侵襲水平；72 h后檢測經320 μg/ml SP處理細胞遷移、侵襲水平。

將不同處理組H446細胞制成懸浮液。在Transwell小室的上室中加入300 μl由RPMI1640培養液稀釋的細胞懸浮液(約1×105個細胞，0.1% FBS)，下室中加入700 μl RPMI1640培養液(含20% FBS)，每個處理組細胞設6個復孔。置于37℃、5% CO2培養箱24 h，用甲醇固定后，0.1%結晶紫于室溫下染色20 min，倒置顯微鏡下隨機選取6個視野(200×)對細胞進行計數后取平均值，是為遷移細胞數。實驗重復4次。

細胞侵襲實驗需將40 μl稀釋過的Matrigel基質膠(基質膠與無血清培養液比例為1∶5)加入Transwell小室內，37℃孵育2 h。其余步驟與遷移實驗相同。實驗重復4次。

1.5RT-PCR 用TRIzol reagent提取Con組和TNF-α組(處理24 h)；Con組、TNF-α組和TNF-α+SP組(處理72 h)H446細胞總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書合成第一鏈cDNA。以此為模板參與PCR反應。以GAPDH作為內參基因，MMP-2和MMP-9 mRNA表達水平。MMP-2的上游引物序列為5′-CTCATCGCAGATGCCTGGAA-3′，下游為5′-CAGCCTAGCCAGTCGGATTTG-3′；MMP-9的上游引物序列為5′-ACGCACGACGTCTTCCAGTA-3′，下游為5′-CCACCTGGTTCAACTCACTCC-3′；GAPDH的上游引物序列為5′- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游為5′-GAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR反應程序為：94℃ 3 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min,共30個循環。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠系統電泳后用Bio-Rad凝膠成像儀掃描，Quantity One軟件分析條帶灰度值，計算MMP-2和MMP-9基因的相對表達量。

1.6Western印跡 提取Con組和TNF-α組(處理24 h)；Con組、TNF-α組和TNF-α+SP組(處理72 h)H446細胞總蛋白。定量后將蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉膜。取PVDF膜于5%脫脂牛奶中封閉1 h。分別加入1∶1 000倍稀釋的GAPDH、MMP-2和MMP-9抗體于4℃孵育24 h。洗膜后，加入1∶2 000倍稀釋的二抗于室溫孵育1 h。暗室內加入化學發光劑(ECL)顯影后，由凝膠成像系統掃描分析。

1.7CCK-8法檢測各組細胞活力 H446細胞經終濃度為40、80、160、320、640 μg/ml的SP處理72 h后，棄培養液，用PBS清洗3次，再加入100 μl無血清RPMI1640培養液和10 μl CCK-8檢測液，37℃避光孵育2 h，酶標儀檢測各孔450 nm處的OD值。細胞抑制率(%)=(1-處理組OD值/對照組OD值)×100%。

1.8統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行方差分析，LSD-t檢驗，t檢驗。

2 結 果

2.1TNF-α增強SCLC細胞H446的集落形成能力 如圖1所示，與Con組(克隆形成數143.39±21.03)相比，TNF-α組H446細胞集落形成能力明顯升高(克隆形成數286.94±31.33，P<0.05)。

2.2TNF-α促進SCLC細胞H446的遷移和侵襲 與Con組比，TNF-α組H446細胞遷移細胞數和侵襲細胞數均明顯升高(P<0.05)。見表1，圖2。

2.3TNF-α促進SCLC細胞中侵襲轉移相關基因的表達 與Con組相比，TNF-α作用后，H446細胞中MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)；Western印跡分析結果與RT-PCR結果一致，見圖3，表2。

圖1 TNF-α作用后SCLC細胞H446集落形成情況

組別遷移細胞侵襲細胞Con組139±1698±15TNF-α組203±201)189±211)

與Con組比較：1)P<0.05,下表同

圖2 TNF-α作用后SCLC細胞H446遷移和侵襲情況(×200)

圖3 TNF-α作用后H446細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平

2.4SP抑制SCLC細胞H446的活力 不同濃度(40、80、160、320和640 μg/ml)的SP處理H446細胞72 h后，對H446細胞的抑制率分別是(1.23±1.00)%、(2.61±1.30)%、(7.59±1.40)%、(14.43±1.32)%和(22.74±1.31)%。H446細胞活力均受到抑制，且抑制率隨處理濃度的增大而增大。

為了保證實驗結果，選取抑制率≥10%的SP濃度(320 μg/ml)作為后續實驗的處理濃度。

2.5SP抑制TNF-α對H446細胞增殖、遷移和侵襲的促進作用 與Con組比較，TNF-α組集落形成能力及遷移和侵襲能力均顯著升高(P<0.05)，而TNF-α+SP組無明顯變化。見表3，圖4。

2.6SP抑制TNF-α對SCLC細胞中侵襲轉移相關基因的表達量的促進作用 與Con組相比，TNF-α組MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白表達量均明顯升高(P<0.05)，而TNF-α+SP組無明顯變化。見表4，圖5。

表2 TNF-α作用后SCLC細胞H466中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平

表3 SP與TNF-α共同作用后SCLC細胞H466集落形成和遷移侵襲情況個)

圖4 SP與TNF-α共同作用后SCLC細胞H446集落形成情況

表4 SP與TNF-α共同作用后H466細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平

圖5 SP與TNF-α共同作用后H446細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達水平

3 討 論

肺癌是一種重要的致死癌癥，現已成為世界范圍內日益嚴重的公共健康負擔〔9〕。SCLC是一種惡性程度較高的腫瘤，倍增速度快，極易產生耐藥性。目前，對于復發性SCLC暫無有效的治療方法，尋找針對SCLC有效治療靶點是近年來的研究熱點〔10〕。

TNF-α參與調控細胞凋亡和炎癥反應過程，在人類腫瘤中，可誘導前列腺癌細胞凋亡〔11〕。越來越多的研究發現，TNF-α可通過核因子(NF)-κB等信號通路，上調snail、twist等轉錄因子，下調E-鈣黏蛋白，促進乳腺癌、口腔癌的侵襲、轉移〔12,13〕。本研究結果提示TNF-α可促進H446細胞的增殖、遷移和侵襲。

SP是一種具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化功能的天然活性物質，受到學者們廣泛關注〔14〕。研究發現，SP以濃度依賴的方式抑制人膽管癌QBC939細胞的生長，其作用機制與抑制細胞中血管內皮生長因子(VEGF)-C和環氧合酶(COX)-2表達水平相關〔15〕。此外，SP可通過抑制轉化生長因子(TGF)-β1和NF-κB信號通路抑制大鼠肝星狀細胞HSC-T6細胞生長〔16〕。SP對表皮生長因子受體酪氨酸激酶(EGFR-TK)有特異的抑制活性，從而抑制肺癌細胞增殖和侵襲，并誘導細胞凋亡〔17〕。本研究發現SP對SCLC細胞H446的活力有明顯的抑制作用，且這種抑制具有明顯的濃度依賴性，并且抑制細胞的侵襲與遷移。

MMPs是一類含鋅內肽酶的蛋白家族，是機體維持正常生理發育和功能必不可少的因子，是腫瘤治療的重要靶點之一。MMPs是以酶原的形式產生，可被其他酶或自由基通過半胱氨酸開關機制激活。根據結構域及序列相似性的不同，MMPs可以分為四大類，其中MMP2和MMP9同屬于明膠酶類，均可降解基底膜的重要的組分Ⅴ型膠原，促進腫瘤轉移，在腫瘤浸潤和轉移中起重要作用〔18,19〕。其中，MMP9的主要生理功能包括促進VEGF的分泌和新血管的生成〔20〕。葉曉星等〔21〕研究發現，嬰幼兒型血管瘤組織中MMP-9的表達水平明顯高于正常嬰幼兒皮膚組織，推測MMP-9表達量可作為部分腫瘤的標志物。本研究提示SP對TNF-α誘導的SCLC細胞的抑制作用與MMP-2和MMP-9有關。