干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog基因檢測(cè)在肺癌免疫診斷及預(yù)后中的意義

郭婧瀾 譚蓓蓓 葉婷 劉靳波

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1檢驗(yàn)科，四川 瀘州 646000；2核醫(yī)學(xué)科)

近幾年我國(guó)在腫瘤干細(xì)胞領(lǐng)域上做出許多大的突破，干細(xì)胞理論逐漸成熟，引起腫瘤的主要原因是干細(xì)胞異常〔1〕。目前研究認(rèn)為，惡性腫瘤發(fā)病時(shí)，干細(xì)胞取決于腫瘤的發(fā)展，其表達(dá)分子在基因產(chǎn)物上起重要作用〔2〕。目前對(duì)Nanog基因的研究主要集中在誘導(dǎo)細(xì)胞及腫瘤研究〔3〕，但對(duì)肺癌方面的研究相對(duì)較少〔4〕。本文擬分析Nanog基因檢測(cè)在肺癌免疫診斷及預(yù)后中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2016年4月至2017年5月收治的腫瘤患者100例，年齡22～76歲，平均(58.43±10.44)歲；男50例，女50例。所有患者進(jìn)行肺部CT、磁共振成像(MRI)、胸部X線片、纖維支氣管鏡檢查與痰液細(xì)胞學(xué)檢查等確定為肺癌，排除其他疾病。其中肺腺癌組50例，男27例，女23例，年齡22～75〔平均(58.42±10.42)歲〕；40歲以下17例，40～60歲16例，60歲以上17例；Ⅰ期9例，Ⅱ期13例，Ⅲ期11例，Ⅳ期17例；21例出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。肺鱗癌組50例，男32例，女18例，年齡23～74〔平均(58.53±9.58)〕歲；40歲以下16例，40～60歲17例，60歲以上17例；Ⅰ期10例，Ⅱ期11例，Ⅲ期15例，Ⅳ期14例。兩組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2腫瘤干細(xì)胞Nanog基因檢測(cè) 采用RT-PCR實(shí)時(shí)定量檢測(cè)Naong，將兩組mRNA使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行完整性檢測(cè)，使用1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄基因。具體操作流程：使用20 μl體系加入PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶在42℃下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)45 min，70℃保溫10 min，逆轉(zhuǎn)錄酶滅活后在冰上冷卻。隨后把合成的cDNA -20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ訥enebank數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)，以BLAST程序進(jìn)行引物特異性檢測(cè)，同時(shí)選用β-actin為內(nèi)參考。Nanog正義鏈：5′-ATGCCTGCATTTTTCATCC-3′；反義鏈5′-GAGGCAGGTCTTCAGAGGAA-3′，長(zhǎng)度189 bp；β-actin正義鏈：5′-CAGAGCAAGAGAGGCATCC-3′；反義鏈：5′-CTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3′，長(zhǎng)度217 bp。PCR在反應(yīng)管中配備，Naong、2×SYBR Premi×E×Tag 10 μl，cDNA模版2 μl，β-actin上游物引物0.4 μl，然后加入滅菌水，總體積為20 μl。采用臨床SYRBGreeenI燃料法針對(duì)RealtimePCR進(jìn)行擴(kuò)張，操作過(guò)程中使用全自動(dòng)熒光定量PCR儀AB17500 RealTimePCR System，溫度58℃,進(jìn)行39個(gè)循環(huán)，觀察結(jié)束后可根據(jù)電腦自行操作，并及時(shí)記錄數(shù)據(jù)。詳細(xì)參照β-actin的相關(guān)CT值〔5～8〕。

1.3觀察指標(biāo) 比較兩組年齡、性別、疾病分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，采取實(shí)時(shí)定量RT PCR反應(yīng)檢測(cè)兩組癌組織與癌旁組織中Nanog基因表達(dá)。并比較不同分化程度各組織中Nanog基因表達(dá)量。采用RT-PCR凝膠電泳，檢測(cè)肺癌干細(xì)胞中Nanog基因的表達(dá)；采用生存曲線比較兩組5年內(nèi)生存率。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)患者肺癌細(xì)胞進(jìn)行染色。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)及非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Nanog在肺癌干細(xì)胞CD44+細(xì)胞中的表達(dá) 在肺癌干細(xì)胞CD44+細(xì)胞中，Nanog表現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，見圖1。

圖1 Nanog在肺癌干細(xì)胞CD44+細(xì)胞中的表達(dá)

2.2癌旁組織與良性病變癌組織中Nanog表達(dá) Nanog蛋白在肺癌中的陽(yáng)性顆粒主要位于胞質(zhì)，胞核幾乎無(wú)表達(dá)，其在陽(yáng)性對(duì)照精原細(xì)胞瘤中主要表達(dá)于胞核，胞質(zhì)幾乎不表達(dá)。Nanog蛋白在肺癌中的表達(dá)顯著高于癌旁正常肺組織和良性病變肺組織。見圖2。

圖2 Nanog在癌組織、癌旁組織與良性病變肺組織中表達(dá)(免疫細(xì)胞化學(xué)染色，×400)

2.3Nanog基因表達(dá) 肺腺癌組癌組織Ⅲ、Ⅳ期Nanog表達(dá)顯著高于Ⅰ期(t=3.269、5.212)、Ⅱ期(t=3.265、5.231，均P<0.05)，癌旁組織Nanog基因表達(dá)在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期均明顯低于癌組織(P<0.05)。肺鱗癌Ⅰ期、Ⅱ期癌組織中較Ⅲ期、Ⅳ期明顯降低(P<0.05)，癌旁組織Ⅰ～Ⅳ期均明顯低于癌組織(P<0.05)，見表1。

表1 肺鱗癌、 肺腺癌兩者在不同時(shí)期Nanog基因的表達(dá)

與Ⅰ、Ⅱ期比較：1)P<0.05；與同期癌組織比較：2)P<0.05

2.4不同分化狀態(tài)Nanog檢出率比較 肺腺癌組中分化與高分化Nanog檢出率〔25.0%(4/16)、37.5%(3/8)〕顯著低于未分化與低分化〔88.9%(8/9)、41.1%(7/17)，P<0.05〕，肺鱗癌組中分化與高分化〔36.3%(4/11)、28.5%(2/7)〕顯著低于未分化與低分化〔57.14%(8/14)、50.0%(9/18)，P<0.05〕。

2.5兩組生存率比較 Nanog高表達(dá)組中位生存率(44%)顯著低于低表達(dá)組(60%，χ2=4.69，P<0.05)。

3 討 論

臨床研究表明，細(xì)胞異質(zhì)是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的主要原因〔8〕，而存在人體的一些特異性細(xì)胞是具有一定的自我更新與分化的潛能〔9〕，這類細(xì)胞存在人體中具有抗藥性與耐藥性等〔10〕，表現(xiàn)出了干細(xì)胞的一些特性〔11〕。腫瘤干細(xì)胞在臨床上屬于腫瘤細(xì)胞中的一種，本身具有更新增殖的能力〔12〕。可間接影響患者身體中的腫瘤生長(zhǎng)，因此對(duì)腫瘤控制及預(yù)防存在重要意義〔13〕。Nanog是胚胎干細(xì)胞(ESCs)的表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，也屬于一種原始性生殖細(xì)胞，存在于ESCs及生殖干細(xì)胞等相關(guān)腫瘤細(xì)胞中。相關(guān)研究表明，存在于人體的癌細(xì)胞會(huì)無(wú)限生長(zhǎng)產(chǎn)生低分化性〔14〕，本次實(shí)驗(yàn)表明Nanog基因的介入可以有效調(diào)節(jié)腫瘤患者的人體機(jī)制，在治療過(guò)程中Nanog起到了至關(guān)重要的作用。Nanog可以直接參與人體修復(fù)治療〔15〕。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Nanog、OCt4除正常保持修復(fù)人體干細(xì)胞的同時(shí)〔16～18〕，還可自行更新、調(diào)控，在分化上也起到了相關(guān)作用，如數(shù)據(jù)顯示越高，其干細(xì)胞在低分化及未分化的能力上表現(xiàn)就越強(qiáng)〔19，20〕。本研究結(jié)果說(shuō)明肺癌組織中含有可以表達(dá)Nanog基因的肺癌干細(xì)胞。數(shù)據(jù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胃癌干細(xì)胞(GCSCS)同時(shí)具有維持肺癌干細(xì)胞的能力，還可進(jìn)行自我繁殖不斷更新活性。研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)6例Nanog基因的陽(yáng)性表達(dá)，顯示這部分癌旁組織當(dāng)中有可能含有肺干細(xì)胞，當(dāng)肺上皮細(xì)胞進(jìn)行精原干細(xì)胞(GSSCS)轉(zhuǎn)變時(shí)，干細(xì)胞腫瘤將高于中分化組與高分化組，Oct4、Sox2及Nanog基因都將處于干細(xì)胞自我調(diào)控狀態(tài)，分化有關(guān)下游基因。本研究在肺腺癌、肺鱗癌與Nanog的基因表達(dá)上發(fā)現(xiàn)兩者相關(guān)性一致，人體細(xì)胞分化達(dá)到最低時(shí)，Nanog基因就越強(qiáng)。