OGF-OGFr通路與腫瘤治療研究進展

張穎 狄婷婷 胡建功

(1承德護理職業學院，河北 承德 067000；2天津中醫藥大學第二附屬醫院病理科)

傳統上，針對內源性和外源性阿片類肽及其受體的研究都集中在疼痛的介導及超量應用導致成癮上。阿片生長因子(OGF)是一種自分泌產生的內源性阿片類肽，它能與OGF受體(OGFr)相結合，下調細胞周期蛋白依賴性抑制性激酶，抑制DNA合成，使細胞周期阻滯于G(1)/S期〔1〕。OGF-OGFr是具有很強活性的抑制性通路，作為細胞增殖的調控因子，廣泛存在于動物和人的細胞和腫瘤中。OGF-OGFr通路在內環境穩定、上皮再生修復中起重要調節作用，對保持健康、疾病治療具有重要意義。研究顯示兩者相互作用的效應為抑制生長發育、腫瘤形成、血管形成及免疫效應〔2〕。OGF-OGFr通路失調使細胞增殖加速，導致自身免疫性疾病和腫瘤的發生發展。多種藥物和小分子物質可以調節OGF-OGFr通路，包括間斷或連續的使用阿片類拮抗劑納曲酮(naltrexone)、基因修飾OGFr的表達、OGF抗體中和OGF等。OGF對于惡性腫瘤的治療具有潛在的臨床價值。為了解其應用在腫瘤治療中的意義，現將其研究進展綜述如下。

1 OGF-OGFr通路的作用機制

為研究OGF如何進入細胞，用四甲基羅丹明-5(6)異硫氰酸酯(5，6-tetramethylrhodamine)標記OGF(RhoOGF)，COS-7細胞中加入RhoOGF，其在37℃時才能被細胞攝入，4℃時則無攝入，顯示了完全的溫度依賴性。作用15 min后RhoOGF即可檢測到，30 min內在細胞質和細胞核內都能觀察到，并能在細胞內存在5 h。加入100倍濃度的OGF或拮抗劑naltrexone，能減少RhoOGF進入細胞。用10-5～10-8mol/L RhoOGF培養的細胞，DNA合成減少24%～36%，與未標記的OGF作用結果相近(DNA合成減少了26%～39%)，表明RhoOGF同樣能發揮作用。施加網格蛋白(clathrin)siRNA，能減少RhoOGF的攝入，導致DNA合成下降。提示OGF是通過clathrin介導的入胞作用發揮功能。入胞作用與胞內高爾基體途徑無關〔3〕。OGF進入細胞是通過clathrin介導的主動轉運，且具有飽和性。

OGF需要通過與OGFr結合后進一步轉移到核內發揮功能，OGF-OGFr的核漿轉運依賴核定位信號。為觀察OGF-OGFr復合物從細胞質到細胞核的轉運過程，用OGFr全長的探針與強綠色熒光蛋白(eGFP)融合，并且用siRNA敲除了核轉運蛋白(karyopherin)α1,α2,α3,α4，α6,karyopherinα1，Ran，結果，頭頸部鱗癌(SCCHN)SCC-1細胞株的karyopherinβ1和Ran下調，沒有OGFr-eGFP被轉運到核內。溴脫氧尿苷(BrdU)標記指數在siRNA karyopherinβ1和Ran沉默組比對照組增加了44%，而karyopherinα1,α2,α3,α4和α6 siRNAs組則沒有變化〔4〕。顯示OGF-OGFr 通路調節細胞增殖依靠karyopherinβ1介導的核漿轉運，RanGTP/RanGDP以梯度變化穿過核膜，而不是依靠karyopherinα相關的適應分子。因此，OGF-OGFr復合物才能及時準確地穿過核膜轉運到核內進而發揮作用。核輸入物質分層的水平提供了對于OGF-OGFr精細調節多元化的通路，就像調節細胞和組織一樣。

研究顯示，內源性OGFr和外源性表達的OGFr-eGFP，在leptomycinB(LMB)作用下顯示明顯的核內累積，提示OGFr以染色體區維持(CRM)1依賴的方式轉運。一段核轉運信號相關的共有的DNA序列已被確認，其中亮氨酸(leucines)L217 L220 L223和L225到丙氨酸(alanine)的突變會導致核內蓄積減少。強綠色熒光蛋白標記的出核信號(NES-eGFP)對LMB發生反應，顯示該序列具有獨立的核轉運功能。OGFr的羧基端存在著串聯重復序列，6/7的串聯重復序列移除后形成三角區域(deltaTR)即顯示細胞抑制活性的缺失，提示此重復序列有助于受體的定位，并可能與其功能有關〔5〕。至于OGFr核轉運的詳細機制尚不明確。

2 阿片類拮抗劑的作用

由于其受體阻斷作用，阿片類拮抗劑，如naloxone和naltrexone，仍廣泛用于可逆性的毒品和酒精的過量應用。隨著OGF-OGFr通路調節細胞增殖的功能被發現，它們的作用就有了新的意義。有研究〔6〕建立了組織培養模型，用低劑量naloxone(LDN)和高劑量naltrexone(HDN)對卵巢癌細胞進行短期的和連續的受體阻斷，顯示受體阻斷的持續時間決定著對細胞增殖的反應。每天施加LDN可阻斷OGF-OGFr的作用4～6 h，上調OGF和OGFr 18～20 h。LDN間斷地阻斷OGFr使DNA合成受到抑制，而應用HDN造成持續性的受體阻斷，則導致細胞生長加速〔6〕。這可能是由于LDN上調了OGF和OGFr的表達，刺激產生足夠的OGF和OGFr發揮作用。表明OGFr受體阻斷持續的時間，而不是阻斷劑的劑量，決定著生物治療的結果。

LDN上調OGF和OGFr在翻譯水平而不是在轉錄水平。短期的受體阻斷后產生生長抑制作用需要p16和(或)p21細胞周期依賴性抑制性激酶，而不影響細胞生存。同時使用LDN和OGF比單獨使用一種能產生更明顯的抑制作用〔6〕。

OGF-OGFr通路失調，會造成人的一系列疾病，包括糖尿病、多發性硬化及腫瘤。應用拮抗劑干擾此通路，則能取得相應的治療效果。naltrexone造成持續的受體阻斷能加速1型糖尿病全層傷口愈合及其塑形期，對于治療糖尿病并發癥如角膜缺損、皮膚創傷已取得理想的效果〔7,8〕。LDN則可用來治療自身免疫性疾病和癌癥〔9〕。

naltrexone對細胞生長的作用同樣存在于胰腺癌、大腸癌及SCCHN細胞。研究〔10〕證實，應用LDN、單獨或聯合應用代表性的化療藥〔紫杉醇(taxol)/紫杉醇(paclitaxel)/順鉑(cisplatin)〕都能影響體內外實驗中的卵巢癌細胞增殖。每兩天給藥1次而不是連續給藥，能明顯減少DNA合成和細胞增殖。而且，LDN聯合taxol或cisplatin可產生疊加的抗腫瘤作用。接種卵巢癌細胞的裸鼠，在LDN的作用下，造成短暫的OGFr阻斷，能以非細胞毒方式通過減少DNA合成、血管形成，而不影響細胞生存；LDN聯合cisplatin而不是taxol，通過減少DNA合成、血管形成對腫瘤形成產生額外的抑制作用，并不產生體重減輕等細胞毒性〔10〕。這項臨床前的數據表明OGF-OGFr通路用于腫瘤的治療是非細胞毒性的、高效的。LDN應用能起到與OGF同樣的效果。

3 OGF-OGFr與腫瘤治療

3.1卵巢癌 研究〔11〕顯示，相對于卵巢表面上皮，OGF和OGFr的表達量在卵巢囊腫分別減少29%和34%(P<0.001)，在卵巢癌中分別減少58%和48%(P<0.001)。而OGF和OGFr的表達水平在原發、轉移和復發卵巢癌差異無顯著性〔11〕。提示OGF、OGFr的表達水平在卵巢癌中顯著減少，增強此通路的功能為卵巢癌的治療提供了有益的生物學基礎。

雌裸鼠皮下接種人卵巢癌SKOV-3細胞株，每天注射OGF(10 mg/kg)、低劑量的naltrexone(LDN，0.1 mg/kg)或等量的鹽水，用藥40 d后，結果顯示，OGF和LDN能顯著減少腫瘤負荷，包括腫瘤結節的數量和重量，其機制為抑制腫瘤細胞增殖和血管形成〔12〕。

有研究用siRNA敲除人卵巢癌SKOV-3細胞中的OGFr，OGFr蛋白表達比未轉染組(WT)和轉染空載體組(EV)減少73%，而腫瘤細胞量增加了33%～132%，倍增時間減少了29%～35%。施加OGF或naltrexone對于OGFr siRNA組細胞量沒有變化。OGFr siRNA組DNA合成增加了136%～146%，而細胞生存狀況沒有變化。裸鼠體內注射OGFr沉默后的卵巢癌細胞，腫瘤中OGFr表達減少，腫瘤發生率增加，腫瘤形成潛伏期縮短，腫瘤體積增加。用OGF治療的WT和EV組，而不是OGFr siRNA組，腫瘤形成減少，腫瘤體積和重量亦減少〔13,14〕。

研究〔10〕顯示，OGF-OGFr通路發揮作用是劑量依賴的、受體介導的、可逆的、蛋白和RNA依賴的，而與凋亡和壞死途徑無關。可以通過施加外源性OGF、基因修飾過表達OGFr、使用LDN治療卵巢癌。此通路可以作為卵巢癌治療一個的靶點，可先采取預防性的用藥，嗣后施行腫瘤細胞減滅術，再與標準化療結合，可能產生疊加的效果。總之，臨床前數據支持利用OGF-OGFr通路從實驗室到床旁的應用，為治療這種難治性疾病提供了有力的依據。

3.2胰腺癌 研究〔15〕顯示，胰腺癌MIA PaCa-2細胞轉染OGFr cDNA后，OGFr量比轉染空載體組多3倍，比未轉染組多4.3倍。OGFr cDNA轉染組OGFr表達比對照組增加30%，腫瘤發生率減少50%，腫瘤體積減少70%，DNA合成減少24%；同時施加外源性OGF比單獨轉染OGFr cDNA組腫瘤體積減少55%〔15〕。此結果支持OGF-OGFr調節胰腺細胞增殖，抑制腫瘤形成。為治療胰腺癌提供了分子生物學及藥理學的基礎。

使用外源性OGF或上調OGFr的表達，通過調節OGF-OGFr通路介導胰腺癌的病程，能抑制體內、外實驗中胰腺癌細胞的生長。單獨或與經典的化療藥聯用，如吉西他濱(gemcitabine)和5-氟尿嘧啶(fluorouracil)導致DNA合成及生長抑制作用增強。OGFr的分子變換證實此受體對于OGF的生長抑制活性是特異的。用OGF浸膏對進展期的不能手術的胰腺癌患者進行治療的臨床前Ⅰ、Ⅱ期實驗中已得到證實〔16〕。研究提示OGF用于治療進展期胰腺癌是安全的、無細胞毒性的、高效的。

3.3甲狀腺癌 免疫組化檢測顯示，OGF和OGFr在非髓樣甲狀腺癌組織及正常濾泡的胞質、胞核均可檢測到〔17〕。有研究檢測了人甲狀腺癌未分化(ATC)細胞株(KAT-18)、乳頭狀癌(PTC)細胞株(KTC-1)和濾泡癌(FTC)細胞株(WRO82-1)細胞株中OGF和OGFr的存在和定位，結果顯示，OGF和OGFr在3種細胞中均存在，10-6mol/L的OGF能抑制細胞生長，細胞量減少了30%；而應用naltrexone后細胞量比對照組增加了35%。用OGF抗體中和OGF，siRNA敲除OGFr均使OGF的生長抑制作用消失〔18〕。提示OGF-OGFr在甲狀腺組織及腫瘤中也發揮著細胞增殖的負調控作用，對此系統進行調節可能有助于甲狀腺非髓樣甲狀腺癌的治療。

3.4其他

3.4.1乳腺癌 有研究檢測了三陰性乳腺癌(TNBC)MDA-MD-231、BT-20細胞及人乳腺癌SK-BR-3、MCF-7細胞中OGF-OGFr的表達及對OGF的反應。結果顯示，OGFr是特異性受體，肽和受體在4種細胞株中均能檢測到。OGF能抑制所有細胞株的生長，減少暴露于紫杉醇中細胞的死亡〔19〕。表明OGF-OGFr通路在乳腺癌中具有相應的功能，可作為潛在的生物治療通路，為TNBC這一難治性疾病的治療提供了新的思路。

3.4.2頭頸部鱗癌 研究顯示，接種了SCCHN SCC-1細胞后肉眼可見腫瘤的裸鼠，分別接受①OGF或LDN每周1，3，7次，②Imiquimod每周1，3次，同時檢測腫瘤生長及DNA合成情況。OGF和LDN使腫瘤從可見到可測量的潛伏期延長了1.6倍。OGF和LDN、Imiquimod治療能明顯減小腫瘤的體積和重量并減少DNA合成〔20〕。OGF-OGFr通路的調節對SCCHN生長的影響代表一種新的非細胞毒性的高效的治療方法。

3.4.3肝細胞癌 集成的蛋白質組學和轉錄組學研究顯示，肝細胞癌中長鏈非編碼RNA同源異型核基因(HOX)轉錄反義基因RNA(HOTAIR)對細胞增殖的作用至少部分是通過調節OGFr的表達〔21〕。經檢測肝細胞癌SK-HEP-1、HepG2和Hep3B細胞株，存在著OGF-OGFr通路并發揮著功能。OGF在細胞增殖調節中發揮強大作用，特異性抗體中和OGF能夠促進細胞增殖，用siRNA沉默OGFr，甚至在加入了外源性OGF的情況下也能促進細胞增殖。證實了OGFr對介導OGF活性的重要性。OGF-OGFr通路對細胞數量的作用與DNA合成相關，并不通過促進凋亡或壞死通路。沒有發現OGF和OGFr在正常和腫瘤組織中表達存在差別〔22〕。研究對肝細胞癌生物治療戰略的制訂有重要的參考意義，同時也表明，不同腫瘤組織中OGF-OGFr的表達是不同的。

3.5聯合化療 腫瘤細胞的休眠是化療中的重要問題。由于它限制了只能以細胞分裂為靶點的抗腫瘤藥的效率。戰勝抗藥性的潛在方式之一就是喚醒這些休眠的腫瘤細胞。研究顯示，OGF-OGFr通路聯合化療對多種癌細胞，包括胰腺癌、乳腺癌均能起到疊加的生長抑制作用〔16,19〕。甲基納曲酮(MNTX)能夠通過阻斷細胞生長抑制通路加強多西紫杉醇(DOC)的作用。編碼OGF的PENK，其主要在彌漫性胃癌中表達，能抑制細胞生長。MNTX阻斷OGF通路的作用使細胞從被捕獲狀態釋放，并且增強了DOC的作用。與單獨應用DOC比較，兩者聯合應用顯著地延長生存期，減輕腹痛，并減輕DOC抗藥性〔23〕。研究顯示MNTX阻斷OGF-OGFr通路能增強抗癌藥DOC的作用，為減輕化療藥的毒性及增強療效提供了新的啟示。MNTX對更多藥物的作用及其詳細作用機制尚需進一步研究。

4 OGF-OGFr通路的調節

Imiquimod是低分子量的免疫反應調節劑。有研究觀察了T細胞免疫缺陷的裸鼠和免疫功能正常的C57BL/6鼠，局部應用Imiquimod后皮膚基底細胞DNA合成的變化。Imiquimod對裸鼠和C57BL/6鼠的DNA合成都顯示了相似的抑制功能。使用Imiquimod后，基底細胞中OGF和OGFr的表達都上調。在Imiquimod作用下，細胞DNA合成受到抑制，并且從第3天持續到第5天。DNA合成量的變化在第1,3,6天是相似的。naloxone能阻斷Imiquimod的作用。Imiquimod聯合OGF或LDN，比單獨應用并不能產生增強的抑制作用。傷害性測試顯示，Imiquimod既不是OGFr激動劑也不是拮抗劑，更不誘導凋亡或壞死〔24〕。結果提示Imiquimod對DNA合成的作用是依靠OGFr受體的介導，Imiquimod依靠OGF-OGFr通路調節細胞增殖。

用組織培養的除去了免疫體系的干擾及Toll樣受體的胰腺癌、大腸癌、SCCHN細胞，均顯示咪唑并喹啉(Imidazoquinolines)上調OGFr，隨之刺激OGF-OGFr通路的相互作用。繼而，通過調節細胞周期依賴性激酶抑制劑強力的激活調節細胞增殖抑制通路，導致細胞周期阻滯在G(1)-S期。中和OGF和(或)通過siRNA敲除OGFr能夠除去Imidazoquinolines對細胞增殖的抑制作用〔25〕。利用此種藥物能夠加強OGF-OGFr通路的作用,有重要的實用意義，但其詳細機制仍不清楚，需要進一步研究。至于其他的調節劑及其調節機制則需要進一步發現和研究。

5 OGF-OGFr通路的局限性

在癌癥數據庫中體細胞突變目錄中存在OGFr 13錯義突變。R444H和S378I，兩個突變位點被確認，它們與調節OGFr轉運到核內和改變其DNA合成的功能屬性有關。R444H顯示其核質比明顯減少，而S378I卻沒有變化。兩種突變的細胞都顯示出對OGF和長效拮抗劑naltrexone(NTX)缺乏反應。僅有R444H顯示了BrdU標記的抑制活性的缺失，還沒有確認是何種突變或突變如何改變OGF的抑制活性〔26〕。顯示OGFr的完整性對于用OGF進行生物治療的充分反應是必須的。找出腫瘤中影響治療反應的潛在的突變非常重要。

OGF-OGFr通路廣泛存在，對細胞存在著劑量依賴的、可逆的、受體介導、無細胞毒性的生長抑制作用，這無疑對腫瘤的生物治療有重要意義。但還需要對更多不同組織學類型和分化程度的癌癥進一步研究以積累更多的經驗。OGF-OGFr通路與更多治療方法的聯合應用效果及如何應用尚不明確。由于OGFr的突變會影響此通路的功能，這也使它在治療中的應用受到限制。隨著相應研究的深入和技術手段的進步，關于此通路更多的研究進展會被不斷發現，其局限性也將被逐漸克服，OGF-OGFr通路會在腫瘤治療中發揮更大的作用。