閩西地區豬輪狀病毒流行情況分析

董 波，李靜楠，傅云扉，戴愛玲，李曉華，楊小燕

閩西地區豬輪狀病毒流行情況分析

董 波1,2，李靜楠1，傅云扉1，戴愛玲1,2，李曉華1,2，楊小燕1,2

（1. 龍巖學院 生命科學學院，福建 龍巖 364012；2. 福建省生豬疫病防控工程技術研究中心，福建 龍巖 364012）

對2014~2017間來自閩西地區規?；i場的173份腹瀉病例，進行了豬輪狀病毒（RV）的實驗室診斷。結果表明，豬輪狀病毒病主要發生在冬季（4.05%），其次是在春季（2.89%）。其中，與PEDV混合感染率13.51%，與TGEV混合感染率為13.51%，RV、TGEV和PEDV混合感染2.70%。2014~2017年間RV的陽性率分別為22.22%、30.90%、23.80%、2.70%。

豬輪狀病毒；流行情況；RT-PCR；陽性檢出率

豬病毒性腹瀉病是由一種或多種病毒單獨或混合感染各年齡段豬只所引發的伴有腹瀉、嘔吐和脫水等典型癥狀的消化道機能紊亂的疾病，嚴重阻礙了豬養殖業的發展[1]。豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus, TGEV）和豬輪狀病毒（Porcine Rotavirus, RV）是引起豬病毒性腹瀉的三種主要病原，三種病毒皆為接觸性傳播，在致病性和流行病學上極為相似，皆以嘔吐、腹瀉、脫水為主要特征，臨床上不易分辨[2]。目前，有關仔豬腹瀉的研究多以PEVD和TGEV為主[3-5]，對RV的研究較少[6]。本文對2014~2017年間閩西地區規模化豬場的173份腹瀉病例，進行實驗室診斷，統計RV感染情況，以期為RV的有效防控提供資料基礎和理論支持。

1 材料與方法

1.1 樣品

2014年1月至2017年12月間，龍巖學院動物醫學研究所接診的腹瀉仔豬173例，均來自福建龍巖及周邊地區規?；B豬場。取送檢病例腸道組織及內容物，放置于無菌器皿中保存，并立即送往實驗室診斷。

1.2 主要試劑

AxyPrep總RNA小量制備試劑盒、AxyPrep質粒DNA小量試劑盒、AxyPrep凝膠回收試劑盒，購自康寧生命科學（吳江）有限公司，dNTP、反轉錄酶M-MLV、5×M-MLV Buffer、pMD18-T Vector，購自寶生物工程（大連）有限公司；DL2000 DNA Marker、10×Loading Buffer，購自廣州瑞真生物技術有限公司，Oligo(dT)18、Murine RNase Inhibitor、T4DNALigase、10× Ligase Buffer，購自南京諾唯贊生物科技有限公司，胰蛋白酶（Tryptone）、酵母（Yeast Extract），購自OXOID公司，Ampicillin（100 mg?mL-1）、NaCl、瓊脂粉，購自Biowest公司，異丙醇、氯仿、乙醇，購自廣東省汕頭市西隴化工股份有限公司。

1.3 提取病毒總RNA及逆轉錄

剪取少量病豬的腸道組織約30 mg于研缽中，加入500 μL RNA裂解液，充分研磨，按照試劑盒操作說明書提取RNA并在-80 ℃下保存。取潔凈EP管，加入RNA 11 μL、Oligo(dT)18 1 μL，12 000×g離心40 s，于70 ℃水浴10 min，加入5×M-MLV Buffer 5 μL、M-MLV 1 μL、dNTP 1 μL、DEPC水6 μL，混勻后，42 ℃水浴30 min，95 ℃水浴10 min。cDNA于-80 ℃下保存。

1.4 一步法RT-PCR

參考GenBank上已發表基因序列，使用Premier Premier 5.0生物軟件設計合成一對特異性引物，

RV-F：AAAGATGCTAGGGACAAAATTG，

RV-R：TTCAGATTGTGGAGCTATTCCA。以cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應程序：45 ℃作用30 min，94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 sec，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環35次；72 ℃延伸10 min。使用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，觀察并記錄結果。

2 結果

2.1 PCR擴增結果

采用特異性引物，PCR擴增病毒總RNA，將產物通過凝膠電泳鑒定，結果顯示獲得大小約為309 bp基因片段，如圖1所示。將純化產物與pUM19-T vector連接，送往上海生工生物工程技術服務有限公司測序，序列結果正確。

圖1 PCR擴增結果

M：DNA Maker DL2000 1：目的片段；2：陰性對照

2.2 RV單一感染以及與PEDV、TGEV混合感染情況

表1 RV感染情況統計

實驗室診斷173份樣品，對RV的感染情況及與PEDV、TGEV混合感染情況進行統計后顯示，RV檢出率為9.24%，與PEDV和TGEV混合感染檢出率分別為2.89%和1.73%，詳見表1。

2.3 RV發病季節統計結果

表2 各季節RV感染情況

閩西地區一年四季均有RV的感染情況，其中，RV的感染率在冬季較高，檢出率為4.05%，詳見表2。

2.4 RV感染年份統計結果

閩西地區2014年RV的陽性率為22.22%，2015年RV的陽性率為30.90%，2016年RV的陽性率為23.80%，到2017年RV的感染率大幅度下降2.70%，詳見表3。

表3 各年份 RV感染統計

3 討論

數據統計分析結果表明，173份病例中，共檢出16份陽性病例，檢出率為9.24%。閩西地區RV的感染方式為單一感染或混合感染，在混合感染病例中，與PEDV混合感染率2.89%，與TGEV混合感染率為1.73%，RV、TGEV和PEDV混合感染率為0.57%。在RV感染總病例中，混合感染率達到56.25%，表明在預防RV病的時候要重點防治RV的混合感染。

從研究結果還可知，閩西地區RV感染主要發生在冬季（4.05%），其次是在春季（2.89%），與國內學者的結論基本相符[7]。因此，豬場在冬季和春季應特別注意RV的防控。RV陽性率在2014年為16.67%，2017年為2.70%，隨著年份的進程而呈現下降趨勢，說明閩西地區規?；i場在逐漸重視RV的防控。

4 結論

豬病毒性腹瀉疾病仍然是影響我國養豬業的主要疾病之一。冬季和春季應特別注意對RV的預防。一是加強飼養管理，做好衛生清潔工作，確保有一個良好的飼養環境條件。二是定期給母豬注射疫苗，增強母豬免疫力，提高母豬體內的抗體水平和母乳抗體水平。

[1] 姜晶,吳丹,李男.豬輪狀病毒的分子流行病學研究進展[J].吉林畜牧獸醫,2015,36(4):24-28.

[2] 王冰,高玉琢,張勇力.豬輪狀病毒病的流行,診斷及防治[J].現代畜牧科技,2014,42(6):142-142.

[3] 王艷豐,張丁華,李愛心,等.PEDV,TGEV,PoRV3種豬病毒性腹瀉病毒的流行現狀及控制策略[J].中國畜牧獸醫,2018,45(2):518-527.

[4] Elschner M, Prudlo J, Hotzel H, et al. Nested Reverse Transcriptase‐Polymerase Chain Reaction for the Detection of Group A Rotaviruses[J]. Zoonoses & Public Health, 2002, 49(2): 77-81.

[5] 郝興凡.豬輪狀病毒病的防制[J].當代畜禽養殖業, 2017,38(5):17-18.

[6] 方振華,沈振國,孫倩,等.豬輪狀病毒與豬傳染性胃腸炎病毒混合感染的實驗室診斷[J].安徽農業科學,2017, 45(14):89-90.

[7] 朱子健,閆麗輝,鞠妍,等.2015-2016年我國東北地區豬病毒性腹瀉流行病學調查[J].中國預防獸醫學報,2017, 39(5):356-360.

Epidemiological Analysisof Porcine Rotavirus in Western Fujian

DONG Bo1,2, LI Jing-nan1, FU Yun-fei1, DAI Ai-ling1,2, LI Xiao-hua1,2, YANG Xiao-yan1,2

(1. College of Life Science, Longyan University, Longyan 364012, China; 2. Fujian Engineering Research Center for Swine Disease Control and Prevention, Longyan 364012, China)

From 2014 to 2017, a total of 173 cases of diarrhea from large-scale pig farms in the western fujian province was collected to analyse. Results show that the main occurrence of RV occurred mainly in winter (4.05%), followed by spring (2.89%), of which the rate of mixed infection with PEDV was 13.51%, and the mixed infection rate with TGEV was 13.51%, and RV, TGEV and PEDV mixed infection 2.70%. The positive rate of RV was 22.22% in 2014, the positive rate of RVwas 30.90% in 2015, the positive rate of RV was 23.80% in 2016, while the infection rate of RV was 2.70% in 2017.

Porcine Rotavirus; epidemic situation; RT-PCR; positive detection rate

S855.3

A

1009-9115(2019)06-0059-03

10.3969/j.issn.1009-9115.2019.06.015

福建省高校自然基金青年重點項目（JZ160481），福建省教育廳中青年科技項目（JAT160483）

2019-03-19

2019-08-01

董波（1983-），男，天津人，博士，講師，研究方向為獸醫學。

（責任編輯、校對：李春香）