華重樓離體胚培養及植株再生初探

陳瑤 周寒梅 何兵 李維

摘 要： 為探明華重樓離體胚培養及植株再生的基本體系，該文以華重樓離體幼胚為試驗材料，以MS培養基為基本培養基，研究不同光照、不同濃度梯度組合的植物生長調節劑對華重樓離體幼胚萌發、成苗的影響。結果表明：培養到60 d時，暗培養條件下華重樓離體幼胚的生長率和萌發率分別比光培養條件下高45.25%、19.17%，故暗培養比光培養更有利于華重樓離體幼胚生長發育。當GA3濃度相同時，離體幼胚萌發所需時間隨IAA濃度增加而延長。不同濃度的GA3都可促進離體幼胚萌發，促進作用由強到弱依次為5 mg·L-1 GA3>1 mg·L-1 GA3> 10 mg·L-1 GA3。在黑暗條件下，優選得到最適華重樓離體幼胚生長發育配方為1/2 MS+30 g·L-1 蔗糖+7 g·L-1瓊脂+0.5 g·L-1 活性炭+5 mg·L-1GA3+1 mg·L-1 IAA。此配方可誘導華重樓離體幼胚在2個月左右萌發，萌發率達50%需80 d左右。在華重樓成熟胚出苗培養時發現，高濃度的植物生長調節劑會抑制華重樓成熟胚生長發育，高濃度GA3甚至會導致華重樓成熟胚死亡。優選得到最適華重樓成熟胚出苗配方為MS+30 g·L-1 蔗糖+6.2 mg·L-1 硼酸+7 g·L-1 瓊脂+0.7 g·L-1 活性炭+0.5 mg·L-1 2，4-D+1.5 mg·L-1 IAA + 1.5 mg·L-1 ZT+5mg·L-1 GA3，誘導成熟胚出苗需43 d左右，75 d左右可形成真葉。

關鍵詞： 胚培養， 離體幼胚， 成熟胚， 光照， 植物生長調節劑

中圖分類號： Q945

文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）11-1681-10

Abstract： Light and plant-growth regulators have a great influence on the regeneration efficiency of somatic embryos and the growth of regenerated plants. In this study， the effects of light and plant-growth regulators on the regeneration of in vitro embryos and the growth of regenerated plants were examined in immature in vitro embryos from Paris polyphylla var. chinensis seeds. The main purpose was to explore the basic system of in vitro embryos culture and growth of regenerated plants in P. polyphylla var. chinensis. In order to study the effects of plant-growth regulators on the growth and development of immature in vitro embryos and the growth of regenerated plants， supplemented with plant-growth regulators with different kinds and concentrations to MS mediums. In order to study the effect of light on the growth and development of immature in vitro embryos of P. polyphylla var. chinensis， the immature in vitro embryos were cultured in light and dark conditions. The results showed that dark conditions were more conducive to the growth and development of immature in vitro embryos in P. polyphylla var. chinensis than light conditions. When cultured for 60 d， the growth rate and germination rate of immature in vitro embryos of P. polyphylla var. chinensis under dark culture conditions were 45.25%， 19.17% higher than those under light culture conditions， respectively. When the concentration of GA3 was the same， the germination time of immature in vitro embryos was prolonged as the concentration of IAA increased. Different concentrations of GA3 promoted the germination of immature in vitro embryos. The promoting effect was 5 mg·L-1? GA3>1 mg·L-1? GA3> 10 mg·L-1? GA3. Under dark conditions， the best formula for immature in vitro embryos of P. polyphylla var. chinensis germination was 1/2 MS + 30 g·L-1 sucrose + 7 g·L-1 agar + 0.5 g·L-1 activated carbon + 5 mg·L-1 GA3+ 1 mg·L-1 IAA. This induced in vitro embryo P. polyphylla var. chinensis germination in about two months. The germination rate reached 50% after about 80 d. In the mature embryos emergence experiment， a high concentration of plant-growth regulators inhibited the growth and development of mature embryos in P. polyphylla var. chinensis. A high concentration of GA3 in particular led to the death of mature embryos. The best formula for seedlings of mature embryos was MS + 30 g·L-1 sucrose + 6.2 mg·L-1 boric acid + 7 g·L-1 agar + 0.7 g·L-1 activated carbon + 0.5 mg·L-1 2，4-D + 1.5 mg·L-1 IAA + 1.5 mg·L-1? ZT + 5 mg·L-1? GA3. Mature embryos could produce seedlings within only 43 d. True leaves were formed after around 75 days.

Key words： embryos culture， immature in vitro embryos， mature embryos， light， plant-growth regulator

華重樓（Paris polyphylla var. chinensis）是我國Ⅱ級保護植物、名貴中藥材。重樓中主要活性物質為甾體皂苷，具有抗腫瘤（Huang et al.， 2007;Wu et al.， 2013）、抗菌（Qin et al.， 2012）、抗氧化（張寧，2016）、止血（李洪梅等，2017）等作用。干燥重樓根莖是云南白藥、季德勝蛇藥片、宮血寧等65種中成藥的重要原料（武珊珊等，2004;楊天梅等，2017;張翔宇等，2017）。由于重樓藥用功效不斷被開發，市場價格不斷攀升，導致重樓野生資源遭到無規律、大量的采挖，野生資源急劇減少。20世紀80年代，干燥重樓根莖價格約每千克2.5元（何良艷等，2011），近年來已上漲到每千克400元（趙庭周等，2014）。在巨大經濟利益的驅使下，重樓野生資源陷入“越挖越少、越少越貴、越貴越挖”的惡性循環。我國80%的野生重樓已被開發利用（黃希等，2016）。為緩解重樓野生資源困境，必須加快重樓人工繁殖速度。但如何打破重樓種胚形態休眠和生理休眠、提高種子萌發率等方面仍沒有取得突破性進展。因此，研究重樓屬植物組織培養技術是解決重樓屬植物快繁瓶頸的有效途徑。不同學者分別以重樓根狀莖（熊海浪等，2012;宋發軍等，2013;王躍華等，2014;劉銀花等，2015b）、莖尖、子房、莖段（李群等，2006）、芽（楊麗云等，2008;王躍華等，2014）、芽軸（劉銀花等，2015a）、葉片（熊海浪等，2012;王躍華等，2014）、種胚（熊海浪等，2012;王躍華等，2015）、種子（宋發軍等，2013;楊淋等，2013）等為材料建立了重樓組織培養體系，但都存在愈傷組織誘導和增殖率低、幼苗移栽成活率低等問題，實用價值不高。

胚培養是在離體無菌條件和適宜培養基中使離體胚發育成苗的技術（王蒂，2004），且對促進植物育種和遺傳學研究具有重要意義（Yao et al.， 2016;Liu et al.， 2016）。進行胚培養的主要目的之一是打破種子休眠加速萌發，縮短育種周期（王雪玲，2014）。胚培養受很多條件的影響，如胚的品種、胚齡、培養基種類、激素種類和濃度、碳水化合物種類和濃度、光照、溫度、pH值等（田玲，2007; 雷秀娟，2013）。胚培養技術已經在浙貝母（蘇新，1995）、人參（雷秀娟，2013）、伊貝母（李麗，2017）、橄欖（Germana et al.， 2014）等藥用植物研究中取得成功。目前未見有關華重樓種子離體胚培養的報道。

重樓屬（Paris）植物結籽量大，種子數量多，是繁殖的好材料。但由于其植物本身特殊的生物學特性，種子在自然條件下，需要兩冬一夏才能萌發并且萌發率低、植株生長緩慢（李運昌，1982），常規育種難以保證市場的需要。能否利用重樓種子數量多的特點和組織培養具有高繁殖效率的優點，直接誘導重樓離體幼胚發育形成植株？本試驗通過離體胚培養技術來克服重樓種子難以萌發的缺點，縮短育種周期。用胚培養技術研究光照和植物生長調節劑對華重樓種子離體幼胚萌發及成苗的影響，旨在使發育不完全的胚快速發育，縮短萌發時間和出苗時間，同時也為重樓屬植物的繁殖研究探索出一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

華重樓種子采自峨眉山生物資源實驗站，挑選新鮮健康、大小均勻一致的華重樓種子備用。

1.2 方法

1.2.1 華重樓種子預處理 將去除外種皮的華重樓種子用流水沖洗30 min，用濾紙將種子表面的水分吸干，在超凈工作臺中用0.1%的HgCl2消毒10 min、無菌水沖洗5次、每次1 min。消毒后接種在MS培養基中，放入人工氣候箱培養6個月。人工氣候箱條件設置：溫度20 ℃，光照1 500 lx，11 h·d-1，濕度65%;溫度4 ℃，光照0 lx，濕度75%，13 h·d-1。

1.2.2 華重樓種胚剝離 將雙目體視鏡下置于超凈工作臺中，用手術刀和解剖針在雙目體視鏡下將處理6個月后的華重樓種胚取出并接種于裝有“華重樓離體幼胚生長發育培養基”的培養皿中。

1.2.3 植物生長調節劑對華重樓離體幼胚生長發育的影響 離體幼胚生長發育培養基：1/2 MS+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂+0.5 g·L-1 活性炭+ IAA+GA3，pH為5.8～6。采用2因素3水平L9（23）實驗設計研究IAA、GA3對華重樓離體幼胚生長發育的影響，并以不添加IAA、GA3的“離體幼胚生長發育培養基”為對照組（表1）。每個培養皿接種4顆華重樓離體幼胚，用封口膠密封培養皿后倒置于人工氣候箱中培養，每個組重復6次。

1.2.4 光照對華重樓離體幼胚生長發育的影響 為研究不同光照對華重樓離體幼胚生長發育的影響， 將1.2.3中接種的每組培養皿平均分為兩部分，分別置于光培養和暗培養條件下進行培養。光培養條件：光照1 500 lx，溫度20 ℃，濕度 65%，11 h·d-1;光照0 lx，溫度15 ℃，濕度75%，13 h·d-1。暗培養條件：光照0 lx，溫度20 ℃，濕度65%，11 h·d-1;光照0 lx，溫度15 ℃，濕度75%，13 h·d-1。此后，每隔2 d分別取樣在雙目體視鏡下觀察華重樓離體幼胚的形態變化。

1.2.5 植物生長調節劑對華重樓成熟胚出苗的影響 子葉長出0.1～0.2 cm視為離體胚發育成熟。將健康、長勢一致的成熟胚轉接到出苗培養基中誘導成熟胚出苗。出苗培養基：MS+30 g·L-1蔗糖+6.2 mg·L-1硼酸+7 g·L-1瓊脂+0.7 g·L-1活性炭+2，4-D+IAA+ZT+GA3，培養基pH為5.8～6，每組重復3次。采用4因素3水平L9（34）實驗設計研究2，4-D、IAA、ZT、GA3對華重樓成熟胚出苗的影響，并以不添加2，4-D、IAA、ZT、GA3的“出苗培養基”為對照組（表2）。培養條件：光照1 500 lx，溫度22 ℃，濕度60%，11 h·d-1;光照0 lx，溫度15 ℃，濕度75%，13 h·d-1。

2 結果與分析

2.1 光照對華重樓離體幼胚發育的影響

由表3可知，光照條件下，培養到60 d時離體幼胚生長率僅為22.25%，萌發率僅為7.5%，絕大多數離體幼胚在生長過程中褐化死亡。暗培養條件下，培養到60 d時離體幼胚生長率為67.5%，萌發率為26.67%。由此可見暗培養更有利于華重樓離體幼胚生長發育。

2.2 植物生長調節劑對華重樓離體幼胚萌發的影響

由圖1可知，對照組處理下華重樓離體幼胚需要194 d才能萌發，不同濃度的GA3+IAA組合處理都能顯著促進華重樓離體胚萌發。當GA3濃度相同時，離體幼胚萌發所需時間隨IAA濃度增加而延長。說明低濃度IAA促進作用強于高濃度IAA。當IAA濃度相同時，不同濃度的GA3都可促進離體幼胚萌發， 促進作用由強到弱依次為對不同處理組下華重樓離體幼胚萌發率達50%所需時間進行統計。除A9組外，其他處理組都能顯著促進華重樓離體幼胚萌發，A4組萌發率達50%所需時間最短，僅需79.67 d，比對照組提前168.66 d（圖2）。

綜上所述，A4組配方（1/2 MS+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂+0.5 g·L-1活性炭+5 mg·L-1 GA3 +1 mg·L-1 IAA）最有利于華重樓離體幼胚萌發。

2.3 A4組中華重樓離體幼胚形態變化

接種時華重樓離體胚為球形胚（圖版Ⅰ： A， 圖版Ⅱ：A）。在A4中培養24 d離體幼胚分化出胚柄（圖版Ⅰ：B）。對照組需培養75 d才能分化出胚柄（圖版Ⅱ：B），且其胚柄比A4組的胚柄短。在A4組中培養35 d離體幼胚分化出胚根，平均長3 mm（圖版Ⅰ：C），而對照組培養130 d才初步分化出胚根，平均長0.5 mm（圖版Ⅱ：C）。A4組中培養54 d離體幼胚分化出子葉（圖版Ⅰ：D），對照組培養154 d離體幼胚才可初步分化出子葉（圖版Ⅱ：D）。在A4組中繼續培養11 d離體幼胚繼續長大，胚根、胚軸、子葉分化更明顯，芽原基初步形成，離體幼胚發育成熟（圖版Ⅰ：E）。此時子葉平均長2 mm，胚根平均長5 mm。離體幼胚在對照組中需繼續培養24 d左右才可形成芽原基（圖版Ⅱ：E）。

2.4 植物生長調節劑對華重樓成熟胚出苗的影響

由表4可知，B3、B4、B8處理下成熟胚都不能正常出苗，可能是由于這三組培養基中赤霉素濃度過高（GA3為10 mg·L-1）。除這三組外，其他處理組都可誘導成熟胚出苗。B2組平均出苗時間最短，僅需43 d，比對照組快38 d。在對照組中不能形成真葉。雖然B2組與B9組誘真葉形成所需時間最短且無顯著差異，但是B2組中華重樓幼苗莖葉生長速度比B9組快。

綜上所述，B2組配方（MS+30 g·L-1蔗糖+6.2 mg·L-1硼酸+7 g·L-1瓊脂+0.7 g·L-1活性炭+0.5 mg·L-1 2，4-D +1.5 mg·L-1 IAA +1.5 mg·L-1 ZT+ 5 mg·L-1 GA3）最有利于華重樓成熟胚出苗。

2.5 B2組中華重樓成熟胚出苗過程

在B2組培養條件下10 d左右子葉可轉綠且胚根明顯變長（圖版Ⅲ：A），43 d左右子葉展開形成幼苗（圖版Ⅲ：B）， 75 d左右形成真葉（圖版Ⅲ：C），培養到150 d時幼苗生長狀況良好（圖版Ⅲ：D）。在對照組培養條件下10 d左右子葉也可轉綠（圖版Ⅳ：A），但胚根生長緩慢，81 d左右才出苗（圖版Ⅳ：B），培養到150 d時也未見真葉形成，只見幼苗長大（圖版Ⅳ：C）。

3 討論與結論

光照是植物生長發育過程中的重要環境因子，在種子休眠過程中光通過光敏素系統對種子萌發起調控作用。雖然光照與離體胚生長發育間的關系還有待進一步探究，但已有很多研究表明光照會導致愈傷組織褐化。李樹麗（2014）發現光照強度越強，中華紅葉楊外植體褐化率越高，而暗培養10 d可將其褐化率降低到18%。楊爽等（2012）也發現野生手掌參離體芽暗培養5～10 d比直接光照培養好，褐化較輕，腋芽萌動時間早、長勢好。湯浩茹等（2000）在黑暗培養條件下成功取得了德國核桃No.120的幼胚、胚軸、子葉。本研究也表明黑暗培養條件更有利于華重樓離體胚生長發育。其原因可能是在離體胚培養條件下，黑暗條件模擬了華重樓種胚在種子中的生長環境。另外，采取完全黑暗培養可避免酚類物質的毒害（賴鐘雄等，1997）。但紅豆杉（Yang et al.，2010）和伊貝母（李麗，2017）的離體胚更適合在適宜光照條件下發育。

植物生長調節劑在植物組織培養中起關鍵作用，對培養基中植物生長調節劑種類和濃度進行調整，可有效地影響植物體內源激素水平，影響培養物本身基因表達，進而影響器官形成和組織分化過程，影響培養物形態重建（李麗等，2018;穆瑢雪等，2018）。生長素會影響胚發生、根發育，葉展開等植物生長發育過程（Woodward & Bartel，2005;Zhao，2010）。GA3能顯著提高西洋參雜種幼胚的萌發率（雷秀娟，2013），低濃度的IAA有利于伊貝母離體胚生長發育，而高濃度的IAA則不利于其離體胚的生長發育（李麗，2017）。本研究結果與此類似。植物生長調節劑不同組合方式不僅影響出苗率還影響出苗方式和幼苗生長狀態（李程，2013;Tang，2014;Raomai et al.，2014）。本研究中，離體胚成熟胚在B2配方中出苗所用時間最短，幼苗生長狀態最好。高濃度的GA3會導致成熟離體胚褐化死亡，在不添加植物生長調節劑的情況下不能誘導形成真葉。離體幼胚A4配方中能快速萌發，成熟胚在B2配方中能快速出苗可能是因為植物生長調節（GA3、IAA）調控了赤霉素和生長素信號轉導通路和生物合成途徑中相關基因的表達。本實驗室對GA3和IAA組合調控華重樓種子萌發機理進行了探究。經高通量轉錄組測序和pathway通路分析發現，外源施加GA3和IAA可使GA分解代謝基因GA2ox下調表達，GA合成基因GA20ox上調表達，GA信號通路中GID1下調表達，PIF4上調表達。外源施加IAA可使IAA合成通路中YUCCA、ALDH上調表達，生長素的受體蛋白AUX1、AUX/IAA、SAUR等上調表達。因此，在華重樓離體胚培養的培養基中添加GA3與IAA或許也可促進GA、IAA合成代謝和信號轉導，從而加速離體幼胚成熟與出苗。

綜上所述，黑暗條件有利華重樓離體胚的生長發育。在本研究條件下，適宜濃度的GA3與IAA組合可使華重樓離體胚快速生長發育，提前萌發。適宜濃度的2，4-D+IAA+ZT+GA3組合可縮短成熟華重樓成熟胚出苗時間，且誘導形成真葉。高濃度的GA3會導致成熟胚死亡。離體胚培養可明顯縮短華重樓種胚萌發、出苗時間。

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（責任編輯 何永艷）