昆蟲激素對家蠶血淋巴和體壁酚氧化酶活性及其基因表達水平的影響

楊偉克 唐芬芬 劉增虎 董占鵬

摘要：【目的】研究外源昆蟲激素對家蠶酚氧化酶活性及其基因表達水平的影響，明確昆蟲激素對酚氧化酶的調控作用，為深入解析家蠶酚氧化酶的功能及基因表達調控機制提供參考依據。【方法】對五齡第3 d發育良好的家蠶幼蟲注射蛻皮激素20E和保幼激素JH，以注射等量0.1%二甲基亞砜（DMSO）為對照，分別在注射3、6、12和24 h后解剖家蠶幼蟲采集血淋巴和體壁，檢測分析家蠶酚氧化酶活性及其基因表達的變化情況。【結果】注射外源JH和20E均能促進家蠶血淋巴酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的表達，有效增加酚氧化酶活性。家蠶血淋巴PPO1和PPO2基因對JH和20E的響應時間存在一定差異，其中，經JH處理后2個酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2）僅在處理6和12 h時顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）上調表達;而經20E處理后PPO1和PPO2基因從3 h開始一直持續到12 h均呈上調表達趨勢。JH和20E對家蠶體壁PPO1和PPO2基因的影響恰好相反，具體表現為：JH能有效抑制家蠶體壁PPO1和PPO2基因的表達，降低酚氧化酶活性;20E則促進家蠶體壁PPO1基因上調表達，但不影響PPO2基因表達。【結論】家蠶酚氧化酶原基因PPO1和PPO2表達受JH和20E的調控，且激素對酚氧化酶原基因表達水平的影響與其酶活性變化規律一致，提示酚氧化酶不僅參與昆蟲激素的代謝，還與激素協同調控家蠶的蛻皮變態。

關鍵詞： 家蠶;昆蟲激素;酚氧化酶;血淋巴;體壁;蛻皮變態

中圖分類號： S883.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）10-2573-07

Effects of insect hormone on activity of phenoloxidase and its gene expression inhemolymph and integument of Bombyx mori

YANG Wei-ke1， TANG Fen-fen2， LIU Zeng-hu1， DONG Zhan-peng1*

（1Sericulture and Apiculture Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Mengzi， Yunnan? 661101， China; 2College of Life Science and Technology， Honghe University， Mengzi， Yunnan? 661101， China）

Abstract：【Objective】To clarify the regulation effect of insect hormones on phenoloxidase activity and gene expression of Bombyx mori， and study regulation effect of insect hormones on phenoloxidase， which could provide a theoretical reference for further research on the function of phenoloxidase and gene expression regulation mechanism. 【Method】Ecdysone 20E and juvenile hormone JH were injected into the silkworm at day 3 of 5th instar larva and the same amount of 0.1% dimethyl sulfoxide （DMSO） was injected as a control group. The phenoloxidase activity and gene expression level were determined in hemolymph and integument of silkworm at 3 h， 6 h， 12 h and 24 h after injection. 【Result】The results showed that the expression of prophenoloxidase genes PPO1 and PPO2 in hemolymph of silkworm were up regulated by 20E and JH， and the phenoloxidase activity was also higher than the control group. There was difference in response times of PPO1 and PPO2 in hemolymph of silkworm to 20E and JH. The expression of PPO1 and PPO2 were only significantly up-regulated at 6 h（P<0.05） and extremely up-regulated at 12 h（P<0.01） after JH treatment. While the expression of PPO1 and PPO2 were up-regulated from 3 h to 12 h after 20E treatment. The effects were opposite of JH and 20E on the expression of PPO1 and PPO2 in integument of silkworm. The expression of PPO1 and PPO2 were inhibited by JH and the phenoloxidase activity was decreased at the same time. 20E could induce the expression of PPO1，but did not affect the expression of PPO2 in integument of silkworm. 【Conclusion】The PPO1 and PPO2 expression in silkworm are regula-ted by JH and 20E. In addition， the effects of JH and 20E on the gene expression are consistent with the change rule of phenoloxidase activities. It is suggested that the phenoloxidase are involved in the metabolism of insect hormones and coordinately regulates the molting metamorphosis with JH and 20E in silkworm.

Key words： Bombyx mori; insect hormone; phenoloxidase; hemolymph; integument; molting metamorphosis

Foundation item： Modern Agricultural Sericulture Industrial Technology System Construction（Chief Scientist） Project of Yunnan（2019K-JTX006）; Applied Basic Research Project of Yunnan Academy of Agricultural Sciences（YJM 201710）

0 引言

【研究意義】酚氧化酶（Phenoloxidase，PO）是一類能將酚類氧化成鄰苯醌或對苯醌的酶，廣泛分布于動植物界，在生物體內發揮著極其重要的生理功能作用（陳曉宇等，2015;苑勝壘等，2016）。昆蟲酚氧化酶通常以非活化狀態的前體酚氧化酶原存在，主要分布在血淋巴和體壁等組織中（Yang et al.，2018）。酚氧化酶原通過酚氧化酶原激活系統轉變為具有活性的酚氧化酶，參與調控昆蟲的一系列生理過程，包括免疫防御、傷口愈合、表皮的鞣化和黑化等（Jearaphunt et al.，2014;Wu et al.，2017）。保幼激素和蛻皮激素是調控家蠶（Bombyx mori）生長發育與蛻皮變態的主要激素，研究家蠶酚氧化酶活性及其基因表達在外源激素處理后的變化規律，可為闡明激素對酚氧化酶基因的分子調控機制提供理論依據。【前人研究進展】當昆蟲機體遭受病原微生物、殺菌劑和殺蟲劑等外源異物刺激時，其體內的酚氧化酶活性及基因表達水平均會受到一定程度的影響（楊偉克等，2019a）。杜育哲等（2002）以蛻皮激素類殺蟲劑處理棉鈴蟲四齡幼蟲6 h，結果發現血淋巴蛻皮激素滴度下降，幼蟲蛻皮困難，酚氧化酶活性顯著降低。金華超等（2013）研究表明，三唑酮、肟菌脂、咪鮮胺和申嗪霉素4種殺蟲劑能有效激活赤眼蜂酚氧化酶活性，說明殺菌劑不僅對赤眼蜂產生毒害作用，在一定程度上還能激活其免疫應答反應。龐海玉等（2013）研究發現，以0.1和0.5 mg/L的20-羥基蛻皮甾酮（20E）處理異色瓢蟲，不影響其生理狀態及酚氧化酶活性;但1.0、5.0和10.0 mg/L的20E均導致幼蟲生長緩慢，死亡率增加，且過氧化物酶和酚氧化酶活性受到抑制。張道偉和陳靜（2014）采用大腸桿菌刺激德國小蠊，結果發現其血淋巴和表皮中的酚氧化酶基因均顯著上調表達，酚氧化酶活性也隨著誘導時間的延長而逐漸增強。柴連琴等（2015）研究表明，20E不僅能提高棉鈴蟲血細胞的運動能力，還能通過激活血淋巴酚氧化酶活性，進而增強血細胞對外源微生物的吞噬能力。李一波等（2017）研究發現，喂食曲酸不僅能抑制飛蝗酚氧化酶活性，還會影響飛蝗的其他代謝酶活性。Zhang等（2018）研究表明，南亞寡鬃實蠅ZtPPO1基因在幼蟲到蛹的變態過程中高效表達，但喂食曲酸能抑制蛻皮激素的合成，降低酚氧化酶活性，導致化蛹蛻皮困難，暗示ZtPPO1基因表達及其酶活性受蛻皮激素20E調控。家蠶機體內存在2個酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2），其幼蟲酚氧化酶活性變化具有明顯的發育時期和組織特異性，且組織表達譜分析顯示酚氧化酶原基因在血淋巴和體壁中均高效表達（毛鈺霞等，2017）。唐芬芬等（2016）研究發現，喂食家蠶核型多角體病毒（BmNPV）能誘導家蠶血淋巴酚氧化酶原基因（PPO1和PPO2）上調表達，且酚氧化酶活性顯著增加。楊偉克等（2019b）研究表明，經口添食大腸桿菌或金黃色葡萄球菌均能誘導家蠶血淋巴酚氧化酶原基因上調表達及酶活性增加，說明酚氧化酶在家蠶抗病毒及抵御細菌等病原微生物的過程中發揮重要作用。此外，已有研究發現家蠶酚氧化酶原基因PPO1在蛻皮變態階段呈上調表達，但在蛻皮結束后其表達量下降，即干涉PPO1基因表達可導致家蠶無法正常化蛹（Wang et al.，2013;Xu et al.，2015）。【本研究切入點】家蠶酚氧化酶原基因表達水平及其活性在四齡眠前期較高，眠中減弱，眠后期增強，說明酚氧化酶活性變化與昆蟲激素水平存在一定相關性（楊偉克等，2019a），但至今有關昆蟲激素對家蠶酚氧化酶活性影響及其基因表達調控的研究相對較少。【擬解決的關鍵問題】研究外源昆蟲激素對家蠶酚氧化酶活性及其基因表達水平的影響，明確昆蟲激素對酚氧化酶的調控作用，為深入解析家蠶酚氧化酶的功能及其基因表達調控機制提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試家蠶品種為大造，恒溫培養箱26 ℃，相對濕度（75±5）%，光照周期（12 h光∶12 h暗），新鮮桑葉飼育。蛻皮激素20E（Y0002054）和保幼激素（JH）類似物（33375）購自Sigma公司，動物組織總RNA抽提試劑盒（ER501-01）購自北京全式金生物技術有限公司，反轉錄試劑盒（RR047A）購自TaKaRa公司，熒光定量試劑Hieff TM qPCR SYBR? Green Master Mix（11201ES03）購自上海翊圣生物科技有限公司，酚氧化酶測試盒（A136-1-1）購自南京建成生物工程研究所。

1. 2 激素處理及樣品采集

激素處理操作參照Gui等（2006）的研究方法。選取家蠶五齡第3 d發育良好的幼蟲，采用微量注射器在每頭家蠶幼蟲腹部分別注射2.0 μL保幼激素JH（0.5 μg/μL）和蛻皮激素20E（1.0 μg/μL），以注射等量0.1%二甲基亞砜（DMSO）為對照。分別在注射3、6、12和24 h后解剖家蠶幼蟲，采集血淋巴和體壁，每次取樣均設5次重復，每個重復取5頭蠶，樣品收集后置于-80 ℃保存備用。

1. 3 酚氧化酶活性測定

（1）酶液制備：家蠶體壁先用PBS清洗干凈，再以液氮充分研磨，加入適量的10 mmol/L Tris-HCL（pH 7.0），在4 ℃下10000 r/min離心10 min，上清液即為待測酶液。血淋巴直接在4 ℃下10000 r/min離心10 min，上清液即為待測酶液。（2）酶活性測定：按照酚氧化酶測試盒說明測定家蠶血淋巴和體壁酚氧化酶活性。

1. 4 總RNA提取及反轉錄

根據動物組織總RNA抽提試劑盒操作說明提取家蠶血淋巴和體壁總RNA，以分光光度計測定OD260/OD280，并取OD260/OD280在1.9～2.0的樣品按照反轉錄試劑盒操作說明將其反轉錄合成cDNA，用于實時熒光定量PCR檢測。

1. 5 實時熒光定量PCR檢測

以家蠶酚氧化酶原基因PPO1（GenBank登錄號BAA08368）和PPO2（GenBank登錄號BAA08369）為靶基因、RP49基因（GenBank登錄號NM_001098 282）為內參基因，利用Primer Premier 5.0設計實時熒光定量PCR引物（表1），并委托深圳華大基因科技有限公司合成。

參照熒光定量試劑Hieff TM qPCR SYBR? Green Master Mix說明進行實時熒光定量PCR檢測，其反應體系20.0 μL，擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環;65 ℃延伸5 s（而后每次加0.5 ℃，直至95 ℃）。以StepOne熒光定量PCR擴增儀記錄檢測結果，每個樣品設3次重復，并根據2-△△Ct計算家蠶酚氧化酶原基因相對表達量。采用Excel 2019進行數據處理及制圖，同時以SPSS 21.0進行統計分析。

2 結果與分析

2. 1 JH對家蠶血淋巴和體壁酚氧化酶原基因表達的影響

實時熒光定量PCR檢測JH處理后家蠶血淋巴和體壁酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的表達情況，結果如圖1和圖2所示。由圖1可看出，家蠶血淋巴PPO1和PPO2基因均在JH處理6和12 h后呈上調表達趨勢，且相對表達量明顯高于相應的對照組。其中，PPO1基因在JH處理6 h后出現表達高峰，與對照組間的差異達極顯著水平（P<0.01，下同），至處理12 h時其相對表達量雖有小幅度下調，但仍極顯著高于對照組;PPO2基因則在JH處理12 h后出現表達高峰。與相應的對照組相比，PPO1基因的相對表達量在JH處理6和12 h時分別上調2.8和2.3倍，而PPO2基因分別上調1.7和1.9倍，說明家蠶血淋巴PPO1基因對JH的響應更敏感。

由圖2可看出，注射外源JH能有效抑制家蠶體壁酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的相對表達量。經JH處理3 h后，家蠶體壁PPO1和PPO2基因均開始顯著下調表達（P<0.05，下同），且隨處理時間的延長，其相對表達量持續降低;至JH處理12 h時家蠶體壁酚氧化酶原基因的相對表達量降至最低值，與相應的對照組相比，其差異均達極顯著水平;處理24 h后由于JH可能逐漸被消耗代謝，PPO1和PPO2基因相對表達量得到一定程度的恢復。

2. 2 20E對家蠶血淋巴和體壁酚氧化酶原基因表達的影響

由圖3可看出，注射外源20E后家蠶血淋巴PPO1和PPO2基因的相對表達量均高于對照組，整體上呈先顯著上調再緩慢下調表達趨勢。PPO1和PPO2基因相對表達量均在20E處理3 h開始顯著上調表達，至處理6 h時其相對表達量達峰值;隨后家蠶血淋巴酚氧化酶原基因相對表達量開始下調，但至處理12 h時其相對表達量仍顯著高于對照組;20E處理24 h后家蠶血淋巴酚氧化酶原基因的相對表達量略高于對照組，但差異不顯著（P>0.05，下同）。由圖4可看出，家蠶體壁PPO1基因在20E處理6和12 h呈上調表達趨勢，與對照組的差異達極顯著水平;注射外源20E后家蠶體壁PPO2基因的相對表達量無明顯變化，表明體壁PPO2基因對外源20E無應答。

2. 3 JH和20E對家蠶血淋巴和體壁酚氧化酶活性的影響

注射外源JH和20E后，家蠶血淋巴和體壁酚氧化酶活性變化趨勢如圖5和圖6所示。由圖5可看出，經JH處理3 h后家蠶血淋巴酚氧化酶活性與對照組間無顯著差異，但至處理6 h時急劇升高至峰值，極顯著高于對照組;處理12 h后酚氧化酶活性有所下降但仍顯著高于對照組，至處理24 h時降至對照組水平。經20E處理后，家蠶血淋巴酚氧化酶活性在處理3 h后略高于對照組，但無顯著差異，從處理6 h開始逐漸升高，至處理12 h時酚氧化酶活性達峰值，與對照組的差異達極顯著水平，但在處理24 h后酚氧化酶活性又恢復至對照組水平。由圖6可看出，家蠶體壁酚氧化酶活性在JH處理6和12 h后顯著低于對照組，而經20E處理6和12 h后顯著高于對照組，說明JH和20E對家蠶體壁酚氧化酶活性的影響并不一致，即JH能抑制酚氧化酶活性，而20E能增強酚氧化酶活性。

3 討論

酚氧化酶作為一類免疫效應因子，能有效抵御病原微生物的入侵，并通過調節吞噬和黑化等過程，參與昆蟲先天性免疫防御反應（Yang et al.，2018）。酚氧化酶也是昆蟲體內的一類重要氧化酶，在體壁鞣化、硬化及著色過程中發揮著重要作用（Endler et al.，2018）。酚氧化酶能將表皮中的酚類物質氧化為醌，醌與相應的表皮蛋白發生鞣化，促使表皮硬化。此外，醌類物質可發生一系列的聚合反應，形成黑色素而致使表皮著色（Gibert et al.，2018）。研究發現，黃粉蟲幼蟲蛻皮初期，血淋巴酚氧化酶活性較高，隨著新表皮的不斷黑化和硬化，其活性逐漸下降，但在蛻皮結束后又逐漸升高，暗示酚氧化酶參與黃粉蟲幼蟲體壁的硬化（劉守柱等，2009）。楊偉克等（2019a）研究發現，家蠶四齡將眠時酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的表達量顯著升高，隨后逐漸減弱，但眠起后又逐漸增加，提示酚氧化酶原基因在家蠶蛻皮過程中發揮重要作用。

JH和20E是昆蟲機體極其重要的兩類激素，協同調控昆蟲的蛻皮、變態及生長發育（Kayukawa et al.，2017），并參與表皮黑色素的生成（Wu et al.，2016）。保幼激素類似物JHA能增強亞洲玉米螟五齡幼蟲的酚氧化酶活性，20E則抑制酚氧化酶活性（趙同偉，2015）。本研究結果表明，注射外源JH和20E均能促進家蠶血淋巴PPO1和PPO2基因的表達，顯著增加酚氧化酶活性。家蠶血淋巴PPO1和PPO2基因對JH和20E的響應時間存在一定差異，經JH處理后酚氧化酶原基因PPO1和PPO2僅在處理6和12 h時顯著上調表達;而經20E處理后PPO1和PPO2基因從處理3 h開始一直持續到12 h均呈上調表達趨勢。JH和20E對家蠶體壁PPO1和PPO2基因的影響恰好相反。JH抑制家蠶體壁PPO1和PPO2基因的表達，降低酚氧化酶活性;而20E能促進家蠶體壁PPO1基因上調表達，但不影響PPO2基因的表達。昆蟲體壁的著色及鞣化過程均需要酚氧化酶參與，同時受蛻皮激素和保幼激素的協同調控，體壁酚氧化酶主要在蛻皮變態時參與舊表皮融離及新表皮合成（Liu et al.，2015;Gibert et al.，2018）。家蠶蛻皮時其機體內的20E滴度較高，此時體壁PPO1基因受20E誘導作用，表達量增加，酚氧化酶被激活，參與家蠶蛻皮變態。JH的主要功能是維持蟲態及促進其生長發育，并拮抗20E的作用，因此家蠶體壁PPO1和PPO2基因表達受JH抑制。本研究還發現，不管是JH處理還是20E處理，家蠶血淋巴PPO1基因的相對表達量均高于PPO2基因，說明PPO1基因對JH和20E的響應更強，同時暗示PPO1在蠶體的激素代謝過程中可能發揮著更重要的作用。

已有的研究主要聚焦于JH和20E調控昆蟲絲腺相關基因P25、fib-H、fib-L和ser-1等的表達，且近年來發現昆蟲激素對機體其他基因也有一定的調控作用（Zhao et al.，2015）。楊歡歡（2016）研究發現，20E能促進五齡前期家蠶絲腺磷酸吡哆醛激酶基因（PLK）和磷酸吡哆醇氧化酶基因（PNOP）的表達，而JH對PLK和PNOP基因的表達具有抑制作用。Mai等（2017）通過研究家蠶抗菌肽基因Lebocin在其中腸的表達調控機制，發現20E可通過上調轉錄因子BmBR-CZ4和BmEts，進而啟動Lebocin基因表達。此外，黑腹果蠅抗菌肽基因Drosocin、Cecropin和Attacin的表達可通過轉錄因子BR-C直接被20E調控，而不依賴于IMD通路;JH通過拮抗20E而抑制抗菌肽基因的表達（Verma and Tapadia，2015）。在半變態昆蟲東亞飛蝗的相關研究中，發現20E可作為激活劑與EcR-RXR配體結合，通過激活PGRP-SA調控抗菌肽基因Defensin和Diptericin及溶菌酶基因lysozyme的表達（Han et al.，2017）。20E或JH可通過作用于基因啟動子區域的應答調控元件實現對靶基因的調控（洪芳等，2016）。本研究發現，在外源激素注射前期（3～12 h）家蠶酚氧化酶活性及其基因表達均顯著增加，但隨著時間的延長，激素逐漸被消耗代謝，酚氧化酶原基因的表達及其活性不再受其影響，逐漸恢復到對照組水平。由于本研究注射JH和20E的劑量較低，在設定的測定時間范圍內，蠶體并未出現病變及異常生理狀況，酚氧化酶原基因表達及其活性測定也局限在處理后的24 h內。因此，若想通過昆蟲激素調控蠶體酚氧化酶活性，增強蠶體免疫能力，進而培育抗逆新品種，則需對激素處理的劑量和時間進行更深入細致的探究。

4 結論

家蠶酚氧化酶原基因PPO1和PPO2表達受JH和20E的調控，且激素對酚氧化酶原基因表達水平的影響與其酶活性變化規律一致，提示酚氧化酶不僅參與昆蟲激素的代謝，還與激素協同調控家蠶的蛻皮變態。

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（責任編輯 蘭宗寶）