探析參附注射液治療新型冠狀病毒肺炎合并急性腎損傷的網絡藥理分子機制

張 廈，姜茗宸，陶嘉磊，袁 斌

南京中醫藥大學附屬醫院，南京 210029

由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)是一種具有強傳染性的急性呼吸道疾病，主要是以呼吸道飛沫和密切接觸的途徑傳播，人群普遍易感，潛伏期約為1～14天，常合并其他器官功能損害[1]。COVID-19早期病程的癥狀與一般病毒性感冒十分相似，主要表現為發熱、干咳、乏力、肌肉酸痛。隨著病情的發展，嚴重者可出現呼吸困難、低氧血癥等，危重者可發生多器官功能障礙，如：急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)、急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克等[2]。AKI作為新型冠狀病毒肺炎的主要并發癥之一，與患者住院死亡率增長呈正相關[3]。COVID-19 病原體基因序列與嚴重急性呼吸綜合癥(sever acute respiratory syndrome，SARS)的病原體相似性高達79%，據報道，有6.7%的SARS患者發展為AKI，而AKI患者的死亡率為91.7%[4]。COVID-19與SARS均可通過血管緊張素轉換酶II(angiotensin-converting enzyme II，ACE2)感染細胞，由于ACE2在腎臟中的高濃度表達，使其成為病毒侵犯的重要靶器官之一[5]。目前多項臨床研究報告顯示，在所有COVID-19住院患者中AKI合并發生率為3%，當患者被送入ICU時，AKI的發生率增加到了19%，大多數患者在入院后第7天出現AKI[6]。所以在COVID-19的常規治療中，無論過去是否有腎臟病史，臨床醫生都應采取措施保護患者腎臟功能。

目前臨床對于COVID-19合并AKI的治療方案包括一般治療、支持治療以及腎臟替代治療，尚無有效的抗病毒治療，中醫藥在臨床治療中發揮著“未病先防、既病防變”的防治特色，這對于減少COVID-19所致AKI患者的死亡率具有重要意義。由國家衛生健康委員會出臺的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》從試行第五版開始，明確提出不同階段可根據中醫辨證療法進行中醫藥干預，在危重癥患者治療中，推薦使用參附注射液。參附注射液在國家、各省市出臺的23種中醫藥防治COVID-19的治療方案中都有重要地位[7]。參附注射液由紅參和附子兩味中藥組成，是由古方“參附湯”衍變制成的中藥注射劑。參附注射液具有回陽救逆，益氣固脫的功效，主治厥脫及陽虛諸證，可應用于各種休克、心力衰竭、心律不齊、急性腎損傷等臨床病癥中[8]。對于COVID-19合并AKI患者，參附注射液具有維持促炎/抗炎平衡，雙向調節嚴重膿毒癥免疫紊亂的作用，可改善臨床療效[9]，但是其藥理分子機制尚不明確。

網絡藥理學是基于“疾病—基因—靶點—藥物”相互作用網絡的基礎上，中藥研究通過網絡分析，可以系統綜合地觀察藥物對疾病網絡的干預與影響，揭示多分子藥物協同作用于人體的奧秘，與中藥及其復方的多成分、多途徑、多靶點協同作用的原理殊途同歸[10]。再通過分子對接驗證網絡藥理學主要活性成分與關鍵蛋白結合，為今后實驗方向提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

TCMSP數據庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)；Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)；Gene Cards數據庫(https://www.genecards.org/)；STRING數據庫(https://string-db.org/)；PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)；Venny 2.1在線軟件作圖平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)；Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Cytoscape 3.8.0軟件；DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)；Open Babel 2.3.2軟件；PYMOL 2.3.4軟件；Autodock 4.2.6軟件；AutoDock Vina 1.1.2軟件等。

1.2 方法

1.2.1 參附注射液中化合物篩選與潛在靶點預測

在TCMSP數據庫[11]中檢索紅參、附子的化學成分，再結合相關文獻補充。每個化合物通過Pubchem數據庫獲得2D化學結構文件，保存為SDF格式用于靶點預測。因參附注射液給藥方式為靜脈注射，故將收集到的化合物全部納入分析[12]。將化合物的SDF文件導入Swiss Target Prediction數據庫[13]，以“homo sapiens”為研究物種，篩選得到預測靶點。通過UniProt數據庫對獲得的靶點信息進行規范統一。整合、去重后得到參附注射液的潛在作用靶點。

1.2.2 COVID-19與AKI疾病靶點的獲取

利用Genecards數據庫，以“novel corona virus ”、“acute kidney injury”為關鍵詞檢索，得到COVID-19和AKI的相關作用靶點。

1.2.3 參附注射液治療COVID-19及AKI共同靶點的篩選

將化合物、COVID-19和AKI的相關基因通過Venny2.1在線作圖工具平臺繪制韋恩圖，得到三者交集，獲得參附注射液治療COVID-19及AKI的共同靶點。

1.2.4 (蛋白相互作用)PPI網絡構建與分析

將“1.2.3”項下篩選得到的共有靶標蛋白上傳至STRING平臺，選擇“multiple proteins”模式，蛋白種屬設為“homo sapiens”，篩選條件為“medium confidence(0.400)”，得到PPI網絡數據，將其導入Cytoscape軟件，繪制PPI網絡圖，根據 Degree值篩選出核心靶點，圖中節點的大小與Degree值呈正相關。

1.2.5 基因富集分析

利用DAVID 6.8數據庫，將“1.2.3”項下獲得的潛在共同靶點上傳進行GO和KEGG的富集分析。選取“gene ontology”，進行生物過程、細胞組分和分子功能的富集分析；選取“pathways”進行KEGG通路分析，以FDR≤0.05作為條件篩選，P值從小到大排列，選取與疾病相關的前20條進行可視化分析。

1.2.6 構建中藥-成分-靶點-通路網絡

將“1.2.5”項下得到的前20條通路、其包含的靶點、靶點對應的藥物活性分子及成分對應的中藥，利用Cytoscape 3.8.0軟件構建為中藥—成分—靶點—通路網絡，用Network Analyzer功能對方中的主要活性成分、靶點、通路進行分析。篩選出大于中位度值的核心活性分子。

1.2.7 分子對接驗證

通過Pubchem數據庫下載主要活性成分的結構，保存為SDF文件并利用Open Babel 2.3.2將SDF文件轉化為PDB文件，從PDB數據庫中檢索獲得受體蛋白ACE2(PDB ID:1R42)、Mpro(PDB ID:6LU7)，利用PYMOL 2.3.4對受體蛋白進行去水、去配體等操作，采用Autodock 4.2.6對兩個受體蛋白進行加氫以及計算電荷處理，將受體蛋白和配體小分子分別轉化為pdbqt格式，利用AutoDock Vina 1.1.2進行核心相關活性成分的分子對接。

2 結果

2.1 參附注射液潛在活性成分與潛在靶點預測

根據TCMSP數據庫搜索結合文獻補充，紅參中化合物74種、附子65種，共139種。刪除重復項后共有137種。通過Swiss Target Prediction數據庫預測潛在作用靶點，去重后共有714個。

2.2 疾病靶點預測及共同靶點篩選

檢索GeneCards數據庫得到COVID-19的相關靶點 351個，AKI的相關靶點6 354個。將參附注射液、COVID-19及AKI的相關靶點輸入Venny 2.1在線作圖工具平臺獲得韋恩圖，得到三者交集靶點共64個，韋恩圖見圖1。

圖1 參附注射液、COVID-19、AKI靶點的韋恩圖Fig.1 Venn diagram analysis of Shenfu Injection and COVID-19 with AKI

2.3 PPI網絡分析及核心靶點篩選

在STRING中錄入參附注射液治療COVID-19合并AKI的64個共同靶點。除PCSK7、F10、ENPP1、PTGDR與其他蛋白之間無相互作用被排除。由圖2可知，該網絡包括60個節點、495條邊、平均度值(degree)為15.5，節點的度值越大說明其在網絡中發揮的作用越重要。排名前十的靶點見圖3，為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素 6(IL6)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、胱天蛋白酶3(CASP3)、表皮生長因子受體(EGFR)、白細胞介素2(IL2)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)，提示可能是通過這些關鍵靶點使參附注射液發揮治療COVID-19合并AKI的臨床療效。

圖2 參附注射液治療COVID-19合并AKI的PPI網絡圖Fig.2 Target PPI network of Shenfu Injection in treatment of COVID-19 with AKI

圖3 關鍵靶點信息Fig.3 Information of key targets注：：PPI網絡所有靶點度值平均值；：靶點度值。 Note::The average value of all target degree values of PPI network;:Target degree value.

2.4 GO生物過程和KEGG的基因富集分析

將“2.2”得到的參附注射液治療COVID-19合并AKI的共同靶點導入DAVID數據庫，得到(FDR≤0.05)GO生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細胞組分(cellular component，CC)條目分別為24、15、6條。按P值從小到大排列，各選取前5條進行可視化，見圖4。KEGG富集分析以FDR≤0.05作為條件篩選得到條目67條，按P值從小到大排列，選取與COVID-19合并AKI疾病相關的前20條進行可視化分析，見圖5。在之前得到的64個共同靶點中，有46個靶點基因參與了這前20條相關通路富集，主要涉及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT(蛋白激酶B)信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子(JAK-STAT signaling pathway)信號通路、血管內皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)、低氧誘導因子-1 信號通路(HIF-1 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、鞘脂信號通路(sphingolipid signaling pathway)、T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)、mTOR信號通路(mTOR signaling pathway)、細胞凋亡(apoptosis)等。

2.5 構建中藥—成分—靶點—通路網絡

經1.2.5篩選后，利用Cytoscape 3.8.0軟件構建為中藥—成分—靶點—通路的多維網絡，見圖6。篩選出大于中位度值的活性成分和靶點作為核心活性分子和核心靶點，活性分子有21種，其中紅參14種、附子6種、紅參和附子的共有成分1種，見表1。推測這21種成分是參附注射液治療COVID-19合并AKI的主要活性成分，用于后續的分子對接驗證。

圖4 參附注射液治療COVID-19合并AKI靶點GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of Shenfu Injection in treatment of COVID-19 with AKI

圖5 參附注射液治療COVID-19合并AKI靶點KEGG信號通路分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of Shenfu Injection in treatment of COVID-19 with AKI

2.6 參附注射液主要活性成分與COVID-19關鍵靶點的分子對接驗證

ACE2是SARS-CoV-2感染細胞的必需蛋白，SARS-CoV-2與SARS-CoV均可與ACE2結合進入細胞[5]。SARS-CoV-2 3CL水解酶(Mpro)是單正鏈RNA病毒前體多聚蛋白水解的核心蛋白酶，在單正鏈RNA病毒復制過程是十分依賴于Mpro活性的，并且人體內缺乏同源的蛋白酶，使其成為一個有吸引力的蛋白酶抑制劑作用靶標[14]。故在“2.5”獲得的21種核心相關活性成分后，與目前臨床COVID-19治療推薦用藥利巴韋林(ribavirin)、洛匹那韋(lopinavir)分別與COVID-19關鍵靶點Mpro、ACE2進行分子對接，配體和受體結合的構象越穩定，結合能越低，結合力越強，各活性成分的結合能顯示于圖7。分子對接的結果顯示，參附注射液的主要活性成分都能與ACE2和Mpro結合，其中人參皂苷Rc(ginsenoside Rc)、人參皂苷Rh2(ginsenoside Rh2)、人參皂苷Rg3_qt(ginsenoside Rg3_qt)、人參皂苷Rg3(ginsenoside Rg3)、烏頭生物堿-苯甲酰萘胺(benzoylnapelline)與ACE2和Mpro的結合能較低，且在中藥—成分—靶點—通路網絡中度值較高，可能是參附注射液治療COVID-19合并AKI的主要成分。其中ACE2受體蛋白與人參皂苷Rc配體小分子結合能最低(-9.4 kcal/mol)、Mpro受體蛋白與人參皂苷Rh2配體小分子結合能最低(-9 kcal/mol)，利用PyMOL進行三維展示，見圖8、9。

圖6 參附注射液治療COVID-19合并AKI的中藥—成分—靶點—通路網絡Fig.6 Drug-composition-target-pathway diagram of Shenfu Injection in treatment of COVID-19 with AKI

表1 參附注射液中大于中位度值的活性成分Table 1 Compounds in Shenfu Injection greater than the median degree

3 討論

參附注射液具有回陽救逆、益氣固脫的功效，因注射針劑起效迅速、使用方便、避免了因煎煮不當而附子中毒可能性，已成為多地中成藥防治COVID-19推薦用藥。為了探究參附注射液治療COVID-19合并AKI的作用機制，通過研究參附注射液(紅參、附子)的有效成分，構建中藥—成分—靶點—通路網絡，分析活性成分、靶點、通路相互作用的關系，結合分子對接的驗證、為參附注射液多成分、多靶點、多通路治療COVID-19合并AKI提供了理論基礎。

細胞因子是由基質細胞和免疫系統細胞分泌的一組小蛋白，主要用于細胞間信號傳遞和交流，并具有多種生物學功能，例如調節先天免疫、適應性免疫、細胞生長和分化以及修復損傷組織。細胞因子主要包括白介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子和生長因子等。當人體被細菌和病毒入侵時，免疫系統會釋放出大量的細胞因子，促炎性細胞因子的過度釋放和失控導致細胞因子風暴。這次COVID-19感染的患者在后期會突然惡化，細胞因子(如IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α和IFN-γ)明顯升高，尤其是IL-6，最終死于多器官功能衰竭，加重的主要原因是細胞因子風暴[15]。本研究再次強調了COVID-19炎癥反應異常，PPI網絡顯示TNF、IL-6、IL-2、FGF2、ICAM1等靶點，同時與參附注射液作用靶點產生交集。其中TNF是觸發全身炎癥反應的關鍵因子，能誘導如IL-6等其他細胞因子的釋放，而CCR1、CCR3等趨化因子受體則可介導更嚴重的炎癥反應，MAPK1、MAPK3等絲裂原活化蛋白激酶家族成員也影響著機體免疫反應。從GO生物富集結果和KEGG通路顯示，參附注射液治療COVID-19合并AKI的作用機制涉及了炎癥反應、蛋白質磷酸化、肽基絲氨酸磷酸化、血小板活化生物功能，以及JAK-STAT、VEGF、TNF信號通路，從生物功能及通路詮釋了炎癥的在病理過程中的重要性。事實上，蛋白質磷酸化主要發生在兩種氨基酸上，一種是絲氨酸，另一種是酪氨酸。絲氨酸磷酸化的主要作用是變構蛋白質以激活蛋白質的活力，主要是指酶活力。酪氨酸則結合蛋白提供一個結構基因，以促進其和其他蛋白質相互作用而形成多蛋白復合體，蛋白復合體的形成再進一步促進蛋白質的磷酸化。通路富集分析結果中的JAK-STAT信號通路似乎解釋了本研究的生物富集結果，當STAT蛋白被JAK磷酸化、二聚化后通過核膜轉運到細胞核中以調節相關基因的表達，這樣就以簡單有效的方式促進由過量細胞因子介導的細胞因子風暴[16]，而且各種細胞因子和生長因子都可通過JAK-STAT信號傳導途徑傳遞信號，包括表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)等，IL-6(依賴JAK-STAT的細胞因子)也可以通過JAK1、JAK2和/或TYK2發出信號，并激活T細胞中的STAT3[17]。因此，參附注射液可能通過減輕促炎性細胞因子的過度釋放，有助于防止進一步的傷害，眾所周知，有多種抗炎藥，包括JAK抑制劑。此類藥物在重癥COVID-19的治療中特別重要。

圖7 參附注射液主要成分分子對接結果Fig.7 Docking results of main components of Shenfu Injection注：: 各活性成分與ACE2的結合能；:各活性成分與Mpro的結合能。Note::The binding energy of each active ingredient and ACE2; : The binding energy of each active ingredient and Mpro.

圖8 人參皂苷Rc與ACE2受體蛋白的分子對接模式Fig.8 Molecular docking pattern of ginsenoside Rc with ACE2

圖9 人參皂苷Rh2與Mpro受體蛋白的分子對接模式Fig.9 Molecular docking pattern of ginsenoside Rh2 with Mpro

值得注意的是，GO生物富集結果涉及了PI3K信號轉導的調控，同時在KEGG通路研究中發現了PI3K/Akt/mTOR信號通路作為藥物—疾病交集靶點，PI3K/AKT/mTOR信號通路是細胞生長、存活、增殖、凋亡、逆轉錄和自噬的重要細胞內信號轉導途徑[18]。當病毒進入體內后，普遍對PI3K/AKT/mTOR信號通路產生影響，如：人類乳頭瘤病毒、粘液瘤病毒，包括與COVID-19同源性極高的中東呼吸綜合征冠狀病毒，在病毒感染期間都能夠維持激活AKT通路，從而激活mTORC1，這種持續激活是啟動病毒復制、存活必備條件之一，目前抑制PI3K/AKT/mTOR和ERK/MAPK的信號通路的持續激活，已被廣泛的作為病毒病原體的靶向治療和預防[19]。此外，眾所周知，在臨床上COVID-19及AKI患者最終威脅生命來自于肺纖維化、腎纖維化，PI3K/AKT/mTOR通路的異常激活在纖維化疾病中十分重要，因為mTOR信號不僅調節細胞自噬，還調節肺纖維化，研究表明抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路可以起到抗肺纖維化作用，藥物通過阻斷PI3K/AKT/mTOR通路上游TGF-β1信號傳導后，可以減少腎組織中系膜基質的積聚，防止腎組織的纖維化[20]，說明參附注射液可能通過對PI3K/AKT/mTOR信號通路進行干預，起到了減少病毒啟動/存活，減輕臟器(肺腎)的炎癥損傷，預防受損臟器纖維化作用，這從理論上似乎解釋了參附注射液臨床上對COVID-19合并AKI患者的部分療效機制。

為了尋求參附注射液治療COVID-19合并AKI的物質基礎，進一步進行分子對接。ACE2充當SARS-CoV-2的Spike受體結合域(RBD)的特異性受體，靶向ACE2可以被認為是阻止SARS-CoV-2進入宿主細胞的宿主特異性療法，并且可能有助于設計用于治療COVID-19的新型附著抑制劑。Mpro蛋白，對于SARS-CoV-2的蛋白水解成熟至關重要。Mpro裂解病毒多蛋白，生成12種非結構蛋白(Nsp4-Nsp16)。抑制Mpro將阻止病毒復制，因此構成了潛在的抗冠狀病毒策略之一。經與ACE2、Mpro靶點對接后發現，與利巴韋林、洛匹那韋相比，選定的人參皂苷-Rc和人參皂苷Rh2都對ACE2、Mpro表現出更好的結合親和力，人參皂苷-Rc在SARS-CoV-2細胞受體ACE2的活性位點與Ala99、Phe399、Asn397、Asp382、Arg393和Gln102等相互作用，并產生結合能(-9.4 kcal/mol)，人參皂苷Rh2在Mpro的活性位點與Phe304、Thr304、Phe294、Arg298、Thr111和Gln110產生了結合能(-9 kcal/mol)。從對接模式來看，人參皂苷Rc與ACE2結合較好，人參皂苷Rh2則與Mpro結合較好，這些位點活性未見相關報道。可以推測人參皂苷Rc可能用作限制病毒附著于宿主細胞的治療和/或預防劑，人參皂苷Rh2則可以用于ACE2介導的SARS-CoV-2抑制進行深層次的研究。

以往研究表明，人參皂苷Rh1不但可以恢復輔助性T細胞的數量和功能，改善機體免疫防御能力[21]，也具有消除氧自由基、抗氧化損傷、增加NO含量、抑制中性粒細胞黏附、抑制 Na+內流的作用，起到了保護臟器正常生理功能，對急性肺損傷和急性腎損傷有防治作用[22]。SARS-CoV-2感染后，炎癥細胞吞噬活動頻繁，耗氧量增加，產生大量的氧自由基，活性氧(ROS)過多造成氧化應激及組織損傷，再灌注后的復氧過程對缺氧階段損傷具有加重效應，累及多臟器[22]。本研究結果顯示，人參皂苷Rb1通過醛固酮調節的鈉重吸收通路，作用于靶點ATP1A1，若可以抑制Na+內流，從而不激活Na+/Ca2 +互換系統，則可以減少細胞質中Ca2 +的堆積，減少細胞損傷[23]。通過分析中藥—成分—靶點—通路網絡圖，參附注射液中人參皂苷Rg1等紅參活性成分可作用于CASP3、BCL2、BCL2L1等凋亡相關靶點基因，若能下調促凋亡蛋白CASP3表達、上調抗凋亡蛋白BCL2表達，則能減少細胞的凋亡。即使再缺氧復氧后，腎小管上皮細胞的單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)也呈高表達狀態，單核巨噬細胞會聚集、黏附和浸潤，人參皂苷Rb1、Rg1可抑制MCP-1的表達，進而減輕炎癥反應[24]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學探究參附注射液治療COVID-19合并AKI的作用機制，并借助分子對接技術進行驗證，揭示了參附注射液減輕炎癥反應，對抗細胞因子風暴，預防臟器纖維化，改善氧化應激，減少細胞凋亡的治療機制。人參皂苷Rc、人參皂苷Rh2、人參皂苷Rg3_qt、人參皂苷Rg3可能是參附注射液發揮治療COVID-19合并AKI的物質基礎。但網絡藥理學尚有局限性，目前COVID-19并發AKI的致病機制尚不完全明確，仍需后續動物實驗和臨床治療加以驗證。