葫蘆茶提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用研究

何貝橋，張園園，莊遠杯，魏愛紅，李榕娣，張聲源2,*

1北京中醫藥大學中藥學院，北京 100049；2廣東省山區特色農業資源保護與精準利用重點實驗室；3嘉應學院醫學院客家藥用生物資源研究所，梅州 514031

非胰島素依賴型(2型，T2DM)糖尿病患者占90%以上，由于胰島素分泌和(或)胰島素作用缺陷以及蛋白質和脂質代謝紊亂，常出現餐后血糖持續升高癥狀[1]。持續性高血糖是引起腎病、心血管疾病等并發癥的主要原因，有效控制餐后高血糖是預防糖尿病、減少并發癥以及降低死亡率的重要措施之一[2,3]。α-葡萄糖苷酶是引起餐后血糖升高的主要酶之一，抑制α-葡萄糖苷酶活性已成為控制餐后高血糖的主要治療策略[4]。微生物來源的阿卡波糖、伏格列波糖為臨床降低餐后血糖的首選藥物，但其制備工藝繁瑣成本高，合成研究進展緩慢，且長期服藥會引發腸胃脹氣、腹部不適等不良反應[5]。因此，開發藥效好毒副作用低的新型天然α-葡萄糖苷酶抑制劑已成為研究熱點[6-8]。

葫蘆茶為豆科葫蘆茶屬植物葫蘆茶Tadehagitriquetrum(L.)Ohashi 的全草，別名牛蟲草、百勞舌、咸魚草等，主要分布于廣東、廣西、海南等地區[9]。葫蘆茶始載于《生草藥性備要》，味苦、澀，性涼，具有清熱解毒，消痰散瘀，消積殺蟲等功效，臨床上主要用于急性扁桃體炎、風濕關節痛、小兒疳積等疾病[10,11]。現代研究表明，葫蘆茶具有抗糖尿病、抗炎、抗氧化、抗菌等藥理作用，富含黃酮類、酚類、萜類成分[12]。葫蘆茶在梅州客家地區資源豐富，民間藥用歷史悠久，但一直未得到深入研究與開發。本實驗首次評價了葫蘆茶各溶劑提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，并運用酶動力學探討了正丁醇萃取物對酶的抑制機制，為進一步綜合利用葫蘆茶資源提供實驗數據。

1 材料

1.1 藥材

葫蘆茶于2016年8月采自廣東省陰那山自然保護區，經嘉應學院醫學院藥學系聶華副教授鑒定為豆科葫蘆茶屬植物葫蘆茶Tadehagitriquetrum(L.) Ohashi全草，標本存放于嘉應學院醫學院客家藥用生物資源研究所(編號：20160866)。

1.2 試劑

對-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(上海源葉科技有限公司，批號MZ1M7E15108，pNPG)；阿卡波糖(拜耳公司，德國，批號 BJ31578)；α-葡萄糖苷酶(Sigma公司，美國，批號：1002515，EC 3.2.1.2，面包酵母，活性≥10 U/mg) ；甲醇和乙腈(色譜純，Fisher Scientific公司，美國)；無水碳酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等均為分析純。

1.3 儀器

Waters Alliance 2695 型高效液相色譜儀(Waters公司，美國)；XBridge Peptide BEH C18色譜柱(Waters公司，美國，250 mm × 4.6 mm，5 μm)；PHSJ-3F型pH計(上海精科儀器有限公司)；BT125D型電子分析天平(Sartorius公司，德國)。

1.4 動物

健康昆明種小鼠80只(♂)，由廣東省醫學實驗動物中心提供，生產合格證號：SCXK(粵)2018-0002，體質量18～22 g。實驗前飼養于濕度45%～75%、室溫25 ℃的動物室內，飼養期間自由飲食，適應性喂養1周后用于實驗。本研究得到嘉應學院醫學院倫理委員會批準，在整個實驗中遵守《實驗動物管理條例》，做到減輕小鼠痛苦，增加其舒適度[13]。

2 方法

2.1 葫蘆茶不同提取物樣品的制備

干燥葫蘆茶藥材5.0 kg，粉碎，用3倍量95%乙醇超聲提取4次，合并提取液，減壓濃縮得到95%乙醇浸膏226.4 g，加適量水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚提取物0.1 g、乙酸乙酯提取物16.6 g、正丁醇提取物102.2 g和水提取物107.2 g。將各提取物放置于4 ℃冷藏，備用。使用磷酸鹽緩沖液(PBS，0.067 mol/L、pH6.8)溶解樣品并制備成不同質量濃度的溶液(質量濃度均以提取物計)。

2.2 小鼠小腸黏膜α-葡萄糖苷酶的提取

此部分方法參照本實驗室之前報道方法[13]。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

將樣品(石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物)分別配制成不同質量濃度的樣品液，其中石油醚提取物為100、200、300、400、500、600 μg/mL，乙酸乙酯提取物為100、150、250、350、450、500 μg/mL，正丁醇提取物為5、10、15、20、25、30 μg/mL，水提取物為10、20、30、40、50、60 μg/mL。陽性對照品阿卡波糖制備成質量濃度分別為100、150、200、250、500、1 000、2 000、3 000、4 000 μg/mL[13]。參考文獻[13,14]方法并作適當調整，采用基于HPLC的pNPG體外評價模型進行檢測，具體如下：先將0.067 mol/L pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液500 μL、待測樣品100 μL和0.1 U/mLα-葡萄糖苷酶(酵母來源和小鼠小腸來源)600 μL振蕩混勻，37 ℃恒溫孵育20 min，再加入4.0 mmol/L pNPG 400 μL，振蕩混勻，37 ℃恒溫反應30 min后，最后加入200 mmol/L Na2CO3溶液1 600 μL終止反應。經0.45 μm微孔濾膜過濾后，通過HPLC檢測對硝基苯酚(pNP)的變化，確定α-葡萄糖苷酶的活性。色譜條件[13]：色譜柱為XBridge Peptide BEH C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A為乙腈，B含0.1%甲酸的水溶液。梯度洗脫條件為：0～8 min，20%→30% A；8～13 min，30%→80% A；13～15 min，80%→20% A；15～25 min，20% A。流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；檢測波長為315 nm。每組實驗重復3次，抑制率計算公式[13]如下：

抑制率=[1-(A樣品-A樣品對照)/A陰性]×100%

式中，A陰性指在相同條件下以等體積磷酸鹽緩沖溶液(PBS)代替樣品測得的pNP峰面積，A樣品對照指在相同條件下以等體積PBS代替α-葡萄糖苷酶測得的pNP峰面積。

葫蘆茶不同溶劑提取物和阿卡波糖對酵母來源、小鼠小腸來源α-葡萄糖苷酶抑制活性的結果見圖1～3和表1。

2.4 α-葡萄糖苷酶抑制作用的動力學研究

因葫蘆茶正丁醇提取物抑制α-葡萄糖苷酶的能力最強，本研究選用葫蘆茶正丁醇提取物探究α-葡萄糖苷酶抑制作用的動力學。參考文獻[13,15]并做適當調整，具體方法如下：固定pNPG濃度為2.5 mmol/L，在葫蘆茶正丁醇提取物質量濃度為0、20、30、40 μg/mL的條件下，測定不同α-葡萄糖苷酶濃度(0.1、0.15、0.2、0.25 U/mL)時的酶促反應初速度作圖。橫坐標表示酶濃度(U/mL)，縱坐標表示反應初速度(μmol/L·min)，并利用圖的特征推斷酶的結合方式。再將pNPG濃度分別稀釋成0.125、0.25、0.5、1 mmol/L，固定α-葡萄糖苷酶濃度為0.2 U/mL，依次測定正丁醇提取物(質量濃度為0、20、40 μg/mL，以乙醇提取物計)的反應速率。以底物質量濃度的倒數(1/S)為橫坐標和反應速率的倒數(1/V)為縱坐標繪制Lineweaver-Burk曲線，經動力學參數(Vmax、Km)來推斷其抑制類型。葫蘆茶正丁醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制類型結果見圖4和圖5。

2.5 數據統計分析

3 結果

3.1 α-葡萄糖苷酶的抑制活性

圖1和表1結果顯示，阿卡波糖對酵母來源、小鼠小腸來源α-葡萄糖苷酶的抑制活性隨質量濃度的增大而增強，并呈量效關系，其IC50分別為5 012.62±18.49、3217.17±7.27 μg/mL。葫蘆茶各溶劑提取物抑制酵母來源、小鼠小腸來源α-葡萄糖苷酶的效果均顯著優于阿卡波糖，差異具有統計學意義(P<0.05)(表1)。葫蘆茶各提取物對酵母來源α-葡萄糖苷酶的抑制活性強弱為正丁醇提取物(IC50= 13.08±1.23 μg/mL)>水提取物(IC50= 33.73±2.21 μg/mL)>乙酸乙酯提取物(IC50= 237.37±3.24 μg/mL)>石油醚提取物(IC50= 253.53±3.42 μg/mL)；對小鼠小腸來源酶的抑制活性強弱則為正丁醇提取物(IC50= 221.21±3.75 μg/mL)>水提取物(IC50= 291.91±2.49 μg/mL)>乙酸乙酯提取物(IC50= 352.52±4.78 μg/mL)>石油醚提取物(IC50= 539.39±3.34 μg/mL)(圖2、圖3)。葫蘆茶各提取物對酵母來源、小鼠小腸來源α-葡萄糖苷酶抑制活性強弱一致，且與陽性對照阿卡波糖相比均具有顯著性差異(P<0.05)。

圖1 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.1 α-Glucosidase inhibitory activity of acarbose

圖2 葫蘆茶不同溶劑提取物對酵母 源α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig.2 Yeast α-glucosidase inhibitory activity of extracts from different solvents of T.triquetrum

圖3 葫蘆茶不同溶劑提取物對小鼠小腸 來源α-葡萄糖苷酶抑制活性Fig.3 Mice intestine α-glucosidase inhibitory activity of extracts from different solvents of T.triquetrum

3.2 葫蘆茶正丁醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制機制

結果顯示，葫蘆茶正丁醇提取物(20、30、40 μg/mL)的酶濃度-反應初速率圖是一組近似通過原點的直線，且直線斜率低于未加提取物的直線斜率，由此可推斷正丁醇提取物與α-葡萄糖苷酶和(或)酶底物復合物進行可逆性結合(圖4)。Lineweaver-Burk雙倒數作圖為一組相交于縱軸一點的線，Km(0.90、2.41、5.80 mmol/L)隨著葫蘆茶正丁醇提取物質量濃度(0、20、40 μg/mL)增大而增大，但Vmax(0.028 1 mmol/L/min)保持不變，表明正丁醇提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為競爭性抑制(圖5)。

表1 葫蘆茶提取物和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制作用IC50值比較Table 1 Comparison of extracts and acarbose IC50 values of inhibition on α-glucosidase

圖4 酶濃度-反應初速率圖Fig.4 Picture of enzyme concentration-initial velocity

4 討論

本實驗采用基于HPLC的體外α-葡萄糖苷酶抑制活性評價模型比較葫蘆茶不同溶劑提取物對小鼠小腸來源、酵母來源α-葡萄糖苷酶抑制活性的差異，綜合篩選有效活性提取物并確定其抑制類型。實驗結果顯示，葫蘆茶各溶劑提取物對酵母來源、小鼠小腸來源的α-葡萄糖苷酶均有不同程度的抑制活性且強于陽性對照阿卡波糖(P<0.05)。從整體上看，各提取物對兩種來源的α-葡萄糖苷酶抑制作用強弱趨勢相同，但抑制酵母來源酶的活性明顯強于小鼠小腸來源，可能與小鼠小腸來源的α-葡萄糖苷酶包含蔗糖酶、麥芽糖酶、海藻糖酶和異麥芽糖酶等有關[16,17]。同時，葫蘆茶各溶劑提取物中，正丁醇提取物抑制α-葡萄糖苷酶的能力明顯優于葫蘆茶其他提取物(P<0.05)，結果提示葫蘆茶中抑制α-葡萄糖苷酶的藥效物質主要集中在大極性部位，可能與該部位富含黃酮類、酚類等極性較大的化學成分有關[12]。此外，經葫蘆茶正丁醇提取物的酶促動力學研究，發現其能有效地競爭性抑制α-葡萄糖苷酶，研究結果將有利于明確葫蘆茶提取物的具體降糖機理。

圖5 葫蘆茶正丁醇提取物的Linweave-Burk雙倒數曲線Fig.5 Lineweaver -Burk plot of n-butanol extract from T.triquetrum

本研究證實葫蘆茶提取物對α-葡萄糖苷酶有良好的抑制作用，并發現其對α-葡萄糖苷酶的作用機制為競爭性抑制，是天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑資源，后續應深入開展葫蘆茶特別是極性較大的提取物化學成分研究，并進行體內藥效學驗證，有望從中發現高效、新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑。