基于網絡藥理學與分子對接探討黃芪-女貞子藥對治療阿爾茨海默病的作用機制

陳博威，易 健，劉柏炎,3*，唐榮梅，曾 鋮

1湖南中醫藥大學，長沙 410208；2湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 410007；3益陽醫學高等專科學校，益陽 413000

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年性癡呆的主要類型，以認知、生活功能逐漸下降為主要臨床表現。隨著人口老齡化的逐漸加劇，我國AD的發病幾率逐年遞增，導致大量老年人日常生活質量難以逆轉的下降，給家庭、社會帶來了沉重的負擔。AD發病機制十分復雜，目前主要考慮與β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)的沉積和微管相關蛋白Tau的過度磷酸化有關，包括突觸丟失、特異性神經遞質減少、神經炎癥和神經元死亡等多種病理過程[1]。多年以來，美國FDA僅批準了極少數治療AD的藥物上市，即乙酰膽堿酯酶(acetyl cholinesterase，AChE)抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)拮抗劑，但目前的藥物效果均不理想。如今，如何有效的防治AD，延緩老年人記憶及認知功能的下降已成為研究熱點之一。

中醫藥治療AD在我國已有數百年的歷史，其療效已經得到認可[2]。有研究發現，相較既往單純以補腎填髓治療AD的方法，現代中醫常在此基礎上配伍益氣活血藥[3]，黃芪-女貞子藥對(Astragalus Radix-Ligustri Lucidi Fructus，AR-LLF)便是其思想體現。黃芪味甘性溫，可外固表虛、充盈腠理、升陽舉陷；女貞子味甘、苦、性涼，能滋補肝腎，長養精神。課題組前期研究表明，女貞子的活性成分齊墩果酸能夠促進神經干細胞增殖，發揮神經保護作用[4]，此外黃芪提取物黃芪多糖也具有減輕AD小鼠神經炎性反應，并改善認知功能的功效[5]。然而，既往的研究多針對單一靶點與單一機制，無法系統的分析黃芪女貞子配伍治療AD多成分、多靶點的協同作用特點。

網絡藥理學是一種新興的藥物研究方法，可有效彌合現代醫學與傳統醫學之間的鴻溝，極大地促進中藥協同作用的機理研究，能夠系統揭示中醫藥的多靶點效應。目前，研究者已將網絡藥理學廣泛應用于中藥藥效物質基礎研究、復方及藥對配伍規律的認識和新藥開發等[6]。因此，本研究擬通過網絡藥理學手段，輔以生物信息學與分子對接技術，希望進一步闡明黃芪女貞子藥對治療AD的分子機制。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分篩選與作用靶點預測

運用中藥系統藥理學數據庫(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取黃芪、女貞子的活性成分及預測靶點。依據藥物的藥動學特性，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug like，DL)≥0.18為篩選條件[7]，并通過手工篩選，保留部分有明確實驗依據證明其對神經有保護作用的成分。如有文獻報道黃芪甲苷可能通過抑制小膠質細胞活化介導的神經炎癥反應來改善AD小鼠的學習記憶功能[8]，而齊墩果酸能夠改善AD大鼠的突觸可塑性[4]，且對AChE有很好的抑制作用[9]。隨后在該數據庫中輸入各活性成分，查詢其潛在作用靶點，并將靶點導入Uniprot數據庫(http://www.uniprot.org)，獲取靶點官方基因名。

1.2 疾病靶點的收集

從基因表達數據庫(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下載編號為GSE28146的基因原始數據，該基因數據來自美國肯塔基州立大學，包含22個阿爾茨海默病患者的大腦標本，及8個健康捐獻者的大腦標本，基因探針平臺為GPL570(http://www.agilent.com)。通過R語言(https://www.r-project.org)“limma”包進行基因數據挖掘，得出差異表達基因，并用R語言“pheatmap”包繪制火山圖及熱圖。同時以“Alzheimer’s disease”為關鍵詞，檢索人類基因數據庫(GeneCards，https://www.genecards.org)，獲取AD已知靶點后，將上述已知標靶與GEO篩選出的差異表達基因合并，構建AD的靶點庫。

1.3 篩選藥物-疾病核心作用基因

通過Perl軟件相關腳本，將黃芪、女貞子的預測靶點與AD的相關靶點取交集，獲取藥物-疾病關鍵作用基因。運用Cytoscape軟件創建活性成分-靶點網絡圖。接著通過String數據庫，輸入上述獲得的關鍵作用基因，物種設定為“Homo sapiens”，最低互動得分設置為0.4，得到蛋白互作網絡圖。String數據庫是一個儲存蛋白質相互作用的數據庫，可對每個蛋白相互作用信息進行評價賦分，由此可以得到黃芪-女貞子藥對治療AD中排名前列的核心作用基因。

1.4 核心作用基因的富集分析

運用R語言將得到的關鍵作用基因進行基因本體(GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。GO功能富集分析描述了基因產物可能形式的分子功能，參與的生物過程和所處的細胞環境。KEGG通路富集分析是指通過將已知的基因組注釋信息進行分類，得出最顯著的生物學過程。由此可以預測黃芪-女貞子活性成分治療AD的可能作用機制。

1.5 分子對接分析

先用ChemOffice 16.0軟件將主要活性成分的3D結構保存為mol2格式并使其能量最小化。從PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載主要靶點的3D結構PDB格式，運用PyMOL軟件(www.pymol.org)對蛋白質進行去水、加氫等操作，利用Auto Dock 4.2軟件將化合物及靶蛋白格式轉換為pdbqt格式，最后進行對接，能量范圍設置為3，精度為8，輸出9個預測結果，并選取其中結合能最小的對接模型。一般認為結合能小于-5 kJ/mol時[7]，配體與受體可以較好結合。

2 結果

2.1 藥物活性成分篩選與作用靶標預測

通過TCMSP數據平臺得到黃芪、女貞子的活性成分及預測靶點，輔以手工檢索，刪除重復或暫無靶點的活性成分后，共計獲得活性成分26個，挖掘作用靶點213個，藥物活性成分詳見表1。

2.2 阿爾茨海默病的相關靶點的收集

基于GSE28146的GEO基因原始數據，以Log2(FC)的絕對值大于1.5和P<0.05為篩選條件，總共得出372個差異基因(見圖1和圖2)。同時檢索GeneCards數據庫中AD的預測靶點，與GEO篩選出的差異表達基因合并，刪除重復項后共計挖掘出阿爾茨海默病的靶點937個。

圖1 差異表達基因的火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes

圖2 差異表達前50位基因的熱圖Fig.2 Heat map of top 50 differentially expressed genes

2.3 篩選藥物-疾病核心基因

運用Perl軟件，將AD的疾病相關基因與黃芪、女貞子的預測作用靶點取交集，獲取有效成分21個，疾病-藥物關鍵作用基因41個。運用Cytoscape軟件創建包含62個節點及144條邊的活性成分-靶點網絡圖，見圖3。其中，活性化合物的節點度排名依次為槲皮素(quercetin，MOL000098)、山奈酚(kaempferol，MOL000422)、木犀草素(luteolin，MOL000006)及芒柄花黃素(formononetin，MOL000392)(見表2)。借助String數據庫，輸入上述已獲得的關鍵作用基因，繪制包含41個節點及330條邊的蛋白互作網絡圖，見圖4。另外節點度排名前列的核心作用基因依次為AKT1、IL6、CASP3、JUN、IL1B、MAPK1、PTGS2、VEGFA、MAPK8、CCL2等(見圖5)。

圖3 活性成分-靶點網絡圖Fig.3 Active component-target network注：圖中綠色代表黃芪的有效成分；黃色代表女貞子的有效成分；紅色為共有的有效成分；橙色代表基因。 Note:Green:Astragalus Radix;Yellow:Ligustri Lucidi Fructus;Red:Multidrug;Orange:Gene.

表2 主要活性成分的節點度排名Table 2 Node ranking of main active ingredients

2.4 關鍵作用基因的富集分析

將篩選出的41個關鍵作用基因進行GO功能及KEGG通路富集分析，共獲得1 205個GO功能富集與136個KEGG通路富集，富集的分子功能為血紅素結合、輔因子結合及四吡咯結合等(見圖6)；生物過程主要富集在對脂多糖、細菌及氧化應激的反應(見圖7)；細胞組成主要富集在細胞膜、細胞膜膜筏及細胞膜小窩上(見圖8)。KEGG主要富集在阿爾茨海默病通路、糖尿病并發癥中的晚期糖基化終末產物及其受體(AGE-RAGE)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、白介素-17(IL-17)信號通路及細胞凋亡等(見圖9)。最后將排名前20的KEGG富集結果可視化(見圖10)。

圖4 蛋白互作網絡圖Fig.4 Protein-protein interaction network map

圖5 核心作用基因排名Fig.5 Core gene ranking

2.5 分子對接分析

依據活性成分-靶點網絡圖的節點度值排名并查閱相關文獻，課題組將主要活性成分黃芪甲苷、齊墩果酸、山奈酚、槲皮素、木犀草素及芒柄花黃素分別與治療AD的公認靶點AChE(PDB ID：1B41)、NMDAR(PDB ID：2HQW)進行分子對接。分子對接結果可知，各化合物與目標受體蛋白對接的結合能均小于-5 kJ/mol，說明各分子與目標受體均能較好結合，結果見表2。其中主要活性成分黃芪甲苷和齊墩果酸的分子對接圖見圖11～14。

3 討論

網絡藥理學通過構建“藥物-靶點-疾病”多層次網絡，來觀察藥物對疾病的干預和影響，具有整體性和系統性特點；而生物信息學則在基因組學的基礎上系統的分析了疾病的基因變化，這與中醫辨證論治的整體思想不謀而合。本研究篩選出黃芪-女貞子藥對的有效成分21個，主要包括黃芪甲苷、齊墩果酸、山奈酚、槲皮素、木犀草素及芒柄花黃素等，關鍵靶點有AKT1、IL6、CASP3、JUN、IL1B及MAPK1等。相關基礎研究也證實了上述成分及靶點的作用，如黃芪甲苷能夠通過減輕氧化應激和神經炎癥，改善AD患者的記憶能力[10]；齊墩果酸能夠改善AD大鼠的突觸可塑性，且對AChE有很好的抑制作用[9]；山奈酚能夠調控MAPK通路的活性，降低AD模型的氧化應激并抑制AchE活性，從而改善其認知功能[11]。槲皮素能夠延緩Aβ沉積速度，促進神經干細胞發生，并改善AD大鼠記憶功能[12]。木犀草素能通過減輕大腦神經炎性病變，降低細胞凋亡及抑制Aβ和Tau的聚集[13]，從而改善AD大鼠的記憶功能。芒柄花黃素可通過MAPK、TNF及PI3K/Akt等信號通路，抑制AD腦內炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達，并改善海馬區血管內皮細胞結構[14]，發揮神經保護作用。分子對接結果亦表明黃芪甲苷、齊墩果酸、山奈酚、槲皮素、木犀草素及芒柄花黃素均能與AD標志性靶點AChE和NMDAR結合，一定程度上驗證了本研究的準確性。此外，通過圖2，發現黃芪與女貞子在治療過程中既有自己單獨的活性成分與作用靶點,亦有共同的活性成分與作用靶點，并且不同活性成分可以作用于共同的靶標，同一活性成分亦可同時從網絡上影響不同的靶點，體現出了兩藥具有多成分、多靶點，可協同治療的作用特征。

圖6 GO富集分析(分子功能)Fig.6 GO enrichment analysis (molecular function)

圖7 GO富集分析(生物過程)Fig.7 GO enrichment analysis (biological process)

圖8 GO富集分析(細胞組成)Fig.8 GO enrichment analysis (cellular component)

圖9 KEGG富集分析Fig.9 KEGG enrichment analysis

圖10 KEGG富集分析的可視化圖Fig.10 Visualization diagram of KEGG enrichment analysis

表3 主要有效成分分子對接的結合能Table 3 The binding energy of active molecules and related core targets

圖11 黃芪甲苷-AChE分子對接圖Fig.11 Molecular docking pattern map of astragaloside-AChE

圖12 黃芪甲苷-NMDAR分子對接圖Fig.12 Molecular docking pattern map of astragaloside-NMDAR

圖13 齊墩果酸-AChE分子對接圖Fig.13 Molecular docking pattern map of oleanolic acid-AChE

圖14 齊墩果酸-NMDAR分子對接圖Fig.14 Molecular docking pattern map of oleanolic acid-NMDAR

本研究通過GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，發現生物過程主要與血紅素結合、輔因子結合、四吡咯結合及對脂多糖的反應等有關，而排名最前的KEGG通路富集結果即為阿爾茨海默病相關信號通路，體現出黃芪-女貞子配伍治療AD具有較強的靶向性。此外其他主要富集的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路及IL-17信號通路均與炎癥反應密切相關。有關研究表明，AD的主要病理特征為大腦出現Aβ蛋白沉積所形成的神經炎性斑即老年斑，而AD患者腦內所存在的免疫和炎癥反應，是Aβ蛋白沉積所致的慢性非可控性炎癥過程。目前，炎癥因子與老年斑之間的相互作用已經被證實：AD患者大腦中存在大量的炎癥介質，特別在老年斑塊周圍可見TNF-α與IL-1β炎癥因子大量表達；使用TNF-α、IL-1β抑制劑干預后，可顯著改善AD大鼠的運動認知功能，并抑制小膠質細胞活化，減少老年斑聚集[15]。AGE-RAGE信號通路是“損傷反應基因”的十字路口，研究發現AD患者大腦內老年斑中有AGEs聚積，同時與AD病理改變有關的異常結構成分如極低密度脂蛋白、C反應蛋白及載脂蛋白E均存在糖基化現象，此外AGE-RAGE信號通路可通過影響炎癥反應、細胞自噬及氧化應激等多種途徑促進AD的發生和發展[16]；而阻斷AGE-RAGE信號通路可以降低NF-κB的活性，抑制炎癥反應，并減少氧化應激，改善認知功能障礙[17]。此外，AD患者癥狀嚴重程度與腦內TNF-α的表達水平呈正性相關，相反抑制TNF-α的表達可以有效改善AD患者的認知功能[18]。IL-17是炎癥反應的早期啟動因子，AD患者大腦中IL-17的表達會顯著升高[19]。IL-17可通過影響下游NF-κB信號通路，進而激活小膠質細胞及促進細胞凋亡的方式，參與AD的神經炎癥反應，而封閉IL-17受體后可以降低炎癥反應并抑制細胞凋亡，產生神經保護作用[20]。綜上，課題組推測降低炎癥反應可能是黃芪女貞子配伍治療AD的作用機制之一。

此外，本研究亦發現抑制細胞凋亡可能是黃芪女貞子潛在治療途徑。細胞凋亡是神經元丟失的主要形式之一，也是AD的重要病理變化，有研究表明，Aβ蛋白會誘導大腦神經元的凋亡，加重腦損傷。近年來的研究也證實黃芪、女貞子的活性成分可以通過減少細胞凋亡，發揮其在治療AD上的優勢[21]。值得注意的是，本研究主要富集的AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路也均是調控細胞凋亡的上游信號位點[22]。而本次蛋白互作網絡中排名前列的核心作用基因如AKT1、CASP3、JUN、MAPK1與PTGS2等亦均與細胞凋亡密切相關[23]。這表明黃芪-女貞子藥對的治療靶標具有多網絡、多環節、相互交叉的協同作用特點，也體現出中醫“整體治療理念”的科學內涵。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學的方法，輔以生物信息學與分子對接技術，初步探討了黃芪-女貞子藥對治療AD的潛在分子機制。發現其治療機制涉及到有效成分21個和關鍵作用基因41個，主要與抑制炎癥反應和細胞凋亡等多個病理過程有關，并通過分子對接初步驗證了其主要有效成分黃芪甲苷、齊墩果酸、山奈酚、槲皮素、木犀草素及芒柄花黃素等均能與靶點結合，能夠為今后的臨床運用和藥物開發提供依據。但考慮中藥煎煮及在體內活性成分可能發生變化的復雜性，故仍有必要通過后續實驗進一步驗證。