木香烴內酯和去氫木香內酯對小鼠B16黑色素瘤細胞增殖和凋亡的影響

劉 蕊，張景照，王丹丹，劉海霞，唐旭東*

1深圳清華大學研究院創新中藥及天然藥物研究重點實驗室；2廣東省創新中藥及天然藥物研究工程中心，深圳 518057

黑色素瘤，又稱惡性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)，被稱為“皮膚癌王”，是皮膚癌當中最危險的一種，增殖能力極強，是導致死亡人數最多的皮膚癌[1.2]。中國黑色素瘤檢出率增加，每年新發病持續增長[3]。目前，常規治療黑色素瘤的主要方法是手術、放療和化療，但存在創傷大、不良反應明顯。木香烴內酯和去氫木香烴內酯是木香的主要活性物質。木香是我國知名傳統中藥。《中國藥典》(2015版)收錄木香為菊科植物木香AucklandialappaDecne.的干燥根[4]。《中國植物志》將木香置于菊科風毛菊屬Saussurea，所以木香的拉丁名又為Saussureacostus(Falc.) Lipech.。藥典記載具有行氣止痛，健脾消食。用于胸脅、脘腹脹痛，瀉痢后重，食積不消，不思飲食。煨木香實腸止瀉。用于泄瀉腹痛[4]。《本草通玄》記載木香外用研末調敷或密汁涂，可“理疝氣”。木香外用還具有抑菌，治療乳腺增生等功效。現代研究表明木香提取物、木香烴內酯和去氫木香內酯等具有多種藥理活性，如抗炎[5]、促胃動力作用[6,7]、利膽[5,8]、抗支氣管痙攣[9]和抗腫瘤[10]等。但是，目前對木香提取物、木香烴內酯(圖1)和去氫木香烴內酯抗黑色素瘤的研究甚少。僅有報道稱木香烴內酯能抑制IBMX-誘導的B16細胞黑色素的生成[11]，文中側重點是木香中單體化合物的分離和鑒定，并從美白化妝品的角度分析化合物對黑色素產生的影響。本文將研究木香烴內酯和去氫木香內酯單體化合物抗黑色素瘤增殖和凋亡的影響，并進一步深入研究其作用機制，旨在為抗黑色素瘤創新藥物的研發提供理論依據。

圖1 化合物結構式Fig.1 The structure of compounds

1 材料與儀器

1.1 材料

小鼠B16黑色素瘤細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)；木香烴內酯和去氫木香烴內酯(純度﹥98%)(成都曼思特生物科技有限公司)；RPMI 1640培養基、胰酶、雙抗、PBS、胎牛血清(Gibco公司)；噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒和DAPI染色液(碧云天生物技術研究所)；抗體Ki-67、PI3K、Bax、Bcl-2、β-Actin(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2 儀器

二氧化碳培養箱(日本SANYA公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；高壓濕熱滅菌器(日本SANYA公司)；酶標儀(美國Thermo公司)；Airstream II級A2型生物安全柜(新加坡藝思高公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；Tanon化學發光圖像分析系統(上海天能公司)。

2 方法

2.1 細胞培養

小鼠B16黑色素瘤細胞培養于含10%胎牛血清和1%雙抗(100 U/mL鏈霉素及100 U/ mL青霉素)的RPMI 1640培養基中，37 ℃，5% CO2的細胞培養箱中培養，1～2天更換培養基，細胞長至70%～80%融合度時，細胞傳代培養。

2.2 細胞增殖測定

取對數生長期的小鼠B16黑色素瘤細胞，顯微鏡下細胞計數后，細胞濃度調整為1×105個/mL，接種到96孔板，每孔100 μL細胞液，即1×104個/孔，細胞貼壁生長過夜后，分別加入100 μL含藥的新鮮培養基，藥物濃度設置為3.125、6.25、12.5、25、50 μM，同時設有未加藥的空白對照組，每組設置6個復孔，分別培養24、48和72 h，每孔加入20 μL MTT溶液，細胞培養箱中繼續培養4 h，棄去舊培養基，每孔加入200 μL DMSO，酶標儀A570nm測定吸光度值。

細胞增殖抑制率=(A空白組-A給藥組)/A空白組

×100%

2.3 DAPI染色

取3 mL 1×105個/mLB16細胞液，接種到置有玻片的60 mm培養皿中，貼壁生長過夜后，棄去舊培養基，加入含不同濃度藥物的新鮮培養基，設置空白對照組，置于細胞培養箱中繼續培養48 h后，用PBS洗兩次，加入預冷的75%的乙醇，4 ℃冰箱內固定過夜，棄去固定液，加入PBS洗3次，加入DAPI染色液，37 ℃避光30 min，PBS洗后，熒光倒置顯微鏡下觀察細胞形態，并拍照分析。

2.4 流式細胞儀FCM檢測分析細胞凋亡

取3 mL 1×105個/mL B16細胞液，接種到的60 mm培養皿中，貼壁生長過夜后，棄去舊培養基，加入含不同濃度藥物的新鮮培養基，設不加藥物組為對照組。置于細胞培養箱中繼續培養48 h后，用不含EDTA的胰酶消化細胞，1 000 rpm離心5 min，棄上清，用PBS洗兩遍，用PBS重懸細胞，取1×104個重懸細胞，離心后，加入195 μL Annexin V-FITC結合液，輕輕重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻，加入10 μL PI，輕輕混勻。室溫避光孵育20 min，隨后置于冰上，流式細胞儀檢測，進行凋亡率分析。

2.5 Western blot檢測凋亡蛋白

分別收集對照組細胞，及不同濃度藥物處理48 h的B16細胞，加入配置好的含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA細胞裂解液冰上充分裂解，提取蛋白。BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。按照蛋白樣品與5×loading buffer體積比4∶1制備，95度8 min變性。取40 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋好的一抗(表2)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，加入顯影液，Tanon化學發光圖像分析系統，采集圖像，進行條帶分析。

2.6 統計學分析

數據以平均值±標準差來表示。用SPSS軟件進行統計分析，用One-way ANOVA進行分析，方差齊性采用F檢驗，組間兩兩比較采用Fisher’s Protected LSD test分析，P<0.05判定為統計學上差異顯著，P<0.01判定為統計學上差異極顯著。

3 結果與討論

3.1 對B16細胞增殖的影響

木香烴內酯(CL)和去氫木香內酯(DL)處理小鼠B16黑色素瘤細胞24、48 h后，和未給藥空白對照組相比，能明顯抑制小鼠B16黑色素瘤細胞增殖(圖2和圖3)。CL和DL在0～100 μmol/L處理B16細胞時，抑制率隨著濃度的增加而增大；且隨著時間的增加，抑制率也在增大。如濃度為25 μmol/L的CL對B16細胞24 h時的抑制率為42.01%，48 h時抑制率為62.23%(圖2)。CL處理B16細胞24 h，48 h的IC50值分別為28.34 μmol/L和19.21 μmol/L。如濃度為25 μmol/L 的DL對B16細胞24 h時的抑制率為40.21%，48 h時抑制率為60.06%(圖3)。DL處理B16細胞24 h，48 h的IC50值分別為29.54 μmol/L和21.22 μmol/L。可見，CL和DL均具有抗B16黑色素瘤細胞的潛在能力，值得進一步深入研究。

圖2 木香烴內酯(CL)對B16細胞增殖的影響Fig.2 The effect of costunolide on proliferation of B16 cells注：與空白對照組比較，*P<0.05，具有顯著性差異； **P<0.01，具有極顯著性差異，下同。Note:Compared with blank control,*P<0.05,significant difference;**P<0.01,extremely significant difference,the same below.

圖3 去氫木香內酯(DL)對B16細胞增殖的影響Fig.3 The effect of dehydrocostus lactone on proliferation of B16 cells

3.2 細胞形態變化

CL和DL處理B16細胞后，顯微鏡下觀察細胞的數目明顯減少，出現收縮，消解現象。DAPI染色后在倒置顯微鏡下觀察CL對B16細胞形態的影響(圖4)，CL處理B16細胞48 h后，細胞形態發生明顯變化，主要是凋亡相關形態學的改變，包括細胞收縮、高染色質凝聚、凋亡體的可見形成和核降解。說明CL引起了B16細胞凋亡。

3.3 流式細胞儀分析B16細胞凋亡率

流式細胞儀檢測CL誘導B16細胞凋亡，不同濃度的CL處理B16細胞48 h后，流式檢測結果發現CL能顯著誘導B16細胞凋亡，增加細胞凋亡數目，而且隨著濃度的增加，細胞凋亡率也在增加。CL處理細胞48 h后，濃度為25 μmol/L的CL誘導35.1%的B16細胞凋亡；濃度為50 μmol/L的CL誘導50.2%的B16細胞凋亡；濃度為100 μmol/L的CL誘導57.6%的B16細胞凋亡(圖5)。流式結果，結合顯微鏡觀察結果，明確了CL能夠誘導B16黑色素瘤細胞凋亡。

圖4 CL對B16細胞形態變化的影響(DAPI染色)Fig.4 Effect of CL on morphology of B16 cells (DAPI staining)

圖5 流式細胞儀分析木香烴內酯對B16細胞的凋亡率Fig.5 The apoptosis rate analysis of FCM in B16 cells

3.4 凋亡蛋白

Western blot實驗結果表明，CL處理組B16細胞48 h后，不同濃度(25、50、100 μmol/L)CL組細胞內Cyt-C、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達明顯升高，并成濃度依賴性促進B16細胞凋亡，與空白對照組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖6)。

圖6 Western blot分析木香烴內酯對B16凋亡相關蛋白表達Fig.6 The apoptosis protein changes of CL in B16 cells analyzed by Western blot

3.5 PI3K/AKT通路

Western blot實驗結果表明，不同濃度木香烴內酯(25、50、100 μmol/L)處理B16細胞48 h后，能夠抑制B16惡性黑色素瘤細胞中PI3K和AKT蛋白的表達(圖7)。這種抑制作用呈現出濃度趨勢，濃度越高抑制作用越明顯。PI3K/AKT信號通路調控細胞增殖和凋亡，對該通路的調控，能夠影響Bcl-2家族蛋白的活性。

實驗證實，木香烴內酯確實能抑制B16黑色素瘤細胞中Bcl-2的表達，并促進Bax蛋白表達(圖7)。細胞內與線粒體膜通透性蛋白Bax發生作用的Bcl-2蛋白受到了木香烴內酯的抑制，從而線粒體膜通透性得到了提高，線粒體釋放Cyt-C，促進caspase-9和caspase-3的表達，最終促進B16細胞發生凋亡。

圖7 Western blot分析CL對B16細胞PI3K/AKT通路的作用Fig.7 Effect of CL on PI3K/AKT pathway in B16 cells

惡性黑色素瘤被稱為“皮膚癌王”，是皮膚癌致死的主要元兇。目前手術、放療和化療對于惡性黑色素瘤的治療不明朗，存在一系列的問題，如手術造成的創傷和術后后遺癥；化療藥物的副作用脫發、惡心、肝腎損傷；放療不敏感等。中藥是天然藥物的寶庫，在中醫理論的指導下，借鑒現代醫學手段，越來越受到科學家和醫學工作者的重視。木香烴內酯和去氫木香內酯能夠抑制B16細胞增殖，并成濃度和時間依賴。據報道，木香烴內酯能夠抑制黑色素瘤細胞SK-MEL-2的增殖，并成濃度依賴趨勢，木香烴內酯處理細胞48 h后，IC50為0.5 μg/mL，文中未對抑制增殖機理、細胞凋亡和作用機制進行研究[12]。誘導腫瘤細胞凋亡是抗癌的主要思路之一。木香烴內酯和去氫木香內酯是木香的主要成分，木香是一些中成藥的常見成分，可內服，可外用。CL誘導B16細胞凋亡可能是通過線粒體釋放Cyt-C從而激活caspase凋亡通路，最終引起B16細胞凋亡，起到抗黑色素瘤的作用。Ding等[13]研究表明細胞色素C參與新狼毒素A誘導人黑色素瘤A375細胞凋亡過程，下調Bcl-2蛋白的表達。這與文獻報道木香烴內酯誘導肺癌A549細胞凋亡的途徑一致[14]，木香烴內酯還能促進激活促凋亡因子Bax的表達和抑制抗凋亡因子Bcl-2的表達來抑制人非小細胞肺癌A549細胞增殖，并促進其凋亡[15]。去氫木香內酯引起線粒體跨膜電位降低而破壞了線粒體的結構，進一步阻礙了線粒體的功能，導致了細胞內代謝物的紊亂，最終誘導了人類乳腺癌細胞 MCF-7細胞的凋亡[11]。木香中部分有效成分的抗腫瘤機制通過引起線粒體通透性轉換(MPT)、細胞色素C釋放或破壞線粒體膜電位而誘導人白血病細胞HL-60凋亡[16]。

本文發現CL和DL能抑制小鼠黑色素瘤細胞B16的增殖，并能誘導B16細胞凋亡。研究表明，木香烴內酯通過抑制惡性黑色素瘤細胞中PI3K/AKT通路激活，抑制Bcl-2蛋白的表達，促進線粒體膜通透性蛋白Bax的表達，使線粒體膜通透性增加，釋放了細胞色素C，從而促進caspase-9和caspase-3的表達，最終促進B16細胞發生凋亡。本文為開發出以木香烴內酯和去氫木香內酯為原料的抗黑色素瘤創新中藥提供理論依據，為抗黑色素瘤提供新的解決思路。