外泌體miR-940在前列腺癌骨轉移中的作用

黃航 李萍 葉雪挺 陳偉 張方毅

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，而且PCa病死人數占癌癥總病死人數的3.8%[1]。2015年相關數據統(tǒng)計顯示，我國PCa發(fā)病率及病死率逐年升高，達26.6/100萬[2]，確診時多處于晚期，且出現(xiàn)遠處轉移[3]。骨轉移是PCa最常見的轉移方式，約90%的PCa病死患者合并骨轉移[4]。成骨細胞、破骨細胞和間充質干細胞是骨微環(huán)境的重要組成部分[5]，PCa細胞可以通過分泌骨形成蛋白、血管內皮生長因子、內皮素-1等骨促進因子來調節(jié)成骨細胞和破骨細胞分化，對骨轉移前微環(huán)境進行重構[6-8]。因此，在治療原發(fā)灶的同時，對播散的PCa細胞和潛在的轉移前微環(huán)境進行針對性干預，有望遏制PCa骨轉移灶的形成，改善晚期患者的預后。外泌體是一種直徑約30～100 nm的細胞外囊泡[9]，近年來研究證實是腫瘤微環(huán)境生態(tài)互動中的重要信使，它可以選擇性地包裹特異的RNA、DNA、蛋白和脂類等物質，并被腫瘤細胞釋放到細胞外，從而介導細胞間通訊[10]。腫瘤來源的外泌體釋放入血循環(huán)后，可被靶器官的細胞攝取并定植，通過一系列信號分子啟動與靶器官的生態(tài)互動，促進轉移前微環(huán)境的重塑[11-12]。微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類小片段非編碼單鏈RNA，也是目前最受關注的外泌體信號分子。有證據表明，腫瘤細胞來源的miRNA可借助外泌體的“運載”到達靶器官，通過調控靶器官內其他細胞的基因表達來影響細胞表型及生物學功能，從而參與轉移前微環(huán)境的構建[13-14]。另外，miRNA還可以通過調控成骨細胞或破骨細胞分化，重構骨微環(huán)境，在腫瘤骨轉移過程中發(fā)揮至關重要的作用[15-17]。本研究將PC-3細胞經轉染后與人骨髓間充質干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hMSC）共培養(yǎng) 48 h，檢測成骨細胞分化相關基因表達及礦化面積占比，以探討外泌體miR-940在PCa骨轉移中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）血清標本：2017年6月在溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院就診的3例正常老年男性及3例PCa骨轉移患者的血清標本。（2）細胞株：PCa細胞株為PC-3細胞，正常前列腺上皮細胞株為RWPE-1細胞，購自中國科學院上海生命研究院細胞資源中心；hMSC購自深圳華拓生物科技有限公司。本研究經醫(yī)院倫理委員會審查通過，血清標本的獲取取得研究對象的知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 蛋白質定量試劑盒（500-0005）購自美國Bio-Rad Laboratories公司；抗-VDAC（ab14734）、抗-D63（ab134045）、抗-Hsp70（ab2787）、抗-CD81（ab155760）購自美國Abcam公司；ECL試劑（320002）購自英國GE Healthcare公司；Trizol（100 ml，15596018）購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒（RR047A）購自日本 TaKaRa 公司；miR-940 mimic、miR-940 inhibitor購自上海吉瑪公司；InvitrogenTMLipofectamine 2000轉染試劑購自美國Thermo Fisher公司；Transwell細胞培養(yǎng)小室（MCHT06H48）購自美國Sigma Aldrich公司。RTPCR儀（ABI7900）購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 細胞培養(yǎng) （1）PC-3細胞、RWPE-1細胞均用10% FBS-F12K培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。FBS 4℃、120 000 g離心14 h，獲得無外泌體FBS；待細胞生長至鋪滿培養(yǎng)皿80%～90%時，更換為無外泌體血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，24 h后收集培養(yǎng)液上清液，待后續(xù)外泌體提取。（2）hMSC使用專用培養(yǎng)基（Corning）進行培養(yǎng)。

1.4 外泌體的提取和鑒定 （1）血清外泌體提取：血清4℃、300 g離心10 min，收集上清液；30 000 g離心20 min，經0.22 μm一次性濾器過濾后，收集上清液；120 000 g離心 90 min，棄上清液，100 μl PBS 重懸，分裝，貯存于-80℃待用。（2）細胞外泌體的提取和鑒定：采用差速離心法。取細胞培養(yǎng)液上清液，300 g離心10 min，取上清液；2 000 g離心10 min，取上清液；10 000 g離心30 min，取上清液；100 000 g離心70 min，棄上清液，PBS重懸；100 000 g離心70 min，所得沉淀即外泌體。在透射電鏡下，對獲得的外泌體進行大小、形態(tài)鑒定；并用Western blot法檢測外泌體標志性蛋白（VDAC、CD63、Hsp70、CD81）表達：用含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液裂解細胞，提取蛋白，用蛋白質定量試劑盒定量。在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，每個泳道上樣40 μg蛋白并轉移至PVDF膜上。用含0.1% Tween 20、5% BSA的Tris緩沖鹽溶液（TBST）封閉膜 2 h；再用抗-VDAC、抗-CD63、抗-Hsp70和抗-CD81（1∶1 000稀釋）4℃ 孵育過夜。次日TBST洗去抗體，PVDF膜分別與二抗結合（1∶2 000稀釋）孵育2 h；洗去抗體，使用ECL試劑使膜上標記的抗體發(fā)生反應，暗室曝光，洗膠片，獲得條帶。

1.5 外泌體中miRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取血清外泌體或細胞外泌體標本，使用Trizol提取mRNA，逆轉錄試劑盒進行逆轉錄；利用ABI7900序列檢測系統(tǒng)進行RT-PCR。采用2-ΔΔCt法計算目標基因與管家基因表達量的比值，即目的基因的相對表達量。

1.6 PC-3細胞轉染與PCa-hMSC共培養(yǎng)體系的建立 將未處理的PC-3細胞以1×105個/孔接種于6孔板并補充2 ml相應培養(yǎng)基，待細胞生長至80%左右進行轉染；將 50 nM siRNA（miR-940 mimic或 miR-940 inhibitor） 和 50 μl InvitrogenTMLipofectamine 2000 轉染試劑加入到鋪板的細胞中，分別為miR-940過表達組、miR-940敲減組，同時設置空白對照組；轉染48 h。采用插入式Transwell細胞培養(yǎng)小室（0.4 μm孔徑的6孔板）構建PCa-hMSC共培養(yǎng)體系，經轉染的PC-3細胞以2.5×104個/孔接種于上室，hMSC 以 5×104個/孔接種于下室，共培養(yǎng)72 h后檢測細胞外泌體成骨細胞分化相關基因表達；共培養(yǎng)28 d后去除培養(yǎng)基，hMSC經PBS漂洗后加入4%多聚甲醛固定，行Von Kossa染色。

1.7 成骨細胞分化相關基因表達檢測 采用RTPCR法，實驗步驟同1.5。成骨細胞分化相關基因包括 ALP、骨鈣素（bone gamma carboxyglutamate protein，BGLAP）等。

1.8 礦化面積占比檢測 采用Von Kossa染色。固定后的hMSC加入適量5%硝酸銀染色液覆蓋細胞表面，在紫外線直射60 min或直至肉眼可見黑色，去除染色液，蒸餾水漂洗數次；加入5%硫代硫酸鈉溶液孵育2～3 min平衡定影，再次漂洗，行核固紅復染5 min；在光學顯微鏡下觀察黑色的鈣沉積細胞（陽性細胞）區(qū)域，即礦化面積；計算礦化面積占比，公式為陽性細胞面積/總細胞面積×100%。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件。計量資料均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PCa骨轉移患者與正常老年男性血清外泌體中miRNA表達比較 與正常老年男性比較，PCa骨轉移患者血清外泌體中多個miRNA表達明顯升高，其中miR-940尤為明顯，見圖1（插頁）；同時在Starbase數據庫中得到進一步驗證，見圖2。

圖1 PCa骨轉移患者與正常老年男性血清外泌體miRNA表達譜（PCa為前列腺癌，miRNA為微小RNA；A、B、C為PCa骨轉移患者；D、E、F為正常老年男性）

圖2 Starbase數據庫中前列腺癌（PCa）組織與正常前列腺組織miR-940表達比較

2.2 PC-3細胞外泌體形態(tài)觀察及標志性蛋白表達在電鏡下，PC-3細胞外泌體呈40～100 nm的盤狀囊泡，見圖 3a；外泌體標志性蛋白 VDAC、CD63、Hsp70、CD81表達均明顯上調，見圖3b。

圖3 電鏡下PC-3細胞外泌體形態(tài)觀察及標志性蛋白表達（a：電鏡下所見，×10 000；b：標志性蛋白表達的電泳圖）

2.3 PC-3細胞與RWPE-1細胞外泌體中miR-940表達比較 PC-3細胞外泌體中miR-940表達明顯高于RWPE-1細胞外泌體，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 PC-3細胞與RWPE-1細胞外泌體中miR-940表達比較（與PC-3細胞外泌體比較，*P＜0.05）

2.4 PCa細胞外泌體miR-940過表達對骨轉移前微環(huán)境的影響 在PCa-hMSC共培養(yǎng)體系中，miR-940過表達組ALP、BGLAP基因表達及礦化面積占比較miR-940敲減組、空白對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖 5a-d（插頁）。

圖5 PCa細胞外泌體miR-940過表達對骨轉移前微環(huán)境的影響（PCa為前列腺癌，BGLAP為骨鈣素；a：ALP基因表達比較，與miR-940過表達組比較，*P＜0.05；b：BGLAP基因表達比較，與miR-940過表達組比較，*P＜0.05；c：礦化面積占比比較，與miR-940過表達組比較，*P＜0.05；d：Von Kossa染色所見，×100）

3 討論

大部分PCa患者會發(fā)生成骨細胞型骨轉移。分子介導的信號傳導途徑可能是預防或治療成骨細胞型骨轉移的潛在靶標。關于PCa與骨骼之間溝通的介體，目前有研究提出了多種機制[18]。例如PCa通過旁分泌的方式，使可溶性蛋白與骨骼之間產生相互作用，從而誘導溶骨或成骨細胞活性，進而導致骨骼重塑，影響PCa轉移生長的骨基質[19]。另有研究表明，骨髓能釋放基質衍生因子-1，增強PCa細胞到骨髓的轉移[20]。癌細胞分泌的miRNA可以修飾腫瘤微環(huán)境，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移[21]。而它通過外泌體在細胞間進行傳遞，從而影響受體細胞的表型[22]。研究表明，外泌體可以將生物分子（如蛋白質、miRNA和mRNA等）轉移到不同的細胞[23]，其中來自原發(fā)腫瘤的外泌體可增強轉移。有證據顯示，原發(fā)性黑色素瘤的外泌體通過增加基質細胞中MET癌基因的表達來培育骨髓間質，從而促進骨轉移[24]。因此，本文就PCa來源外泌體在骨轉移前微環(huán)境中的作用進行探討。

目前關于PCa細胞釋放的外泌體攜帶何種特異性的miRNA信息，其能否通過調控轉移前微環(huán)境介導骨轉移的發(fā)生、發(fā)展鮮有報道。本研究首先通過正常老年男性及PCa骨轉移患者血清外泌體miRNA表達譜，結合Starbase數據庫中既往報道參與調控PCa侵襲轉移的miRNA研究，篩選出了存在顯著表達差異的外泌體miR-940。然后通過體外實驗比較了PCa細胞株PC-3與正常前列腺上皮細胞株RWPE-1外泌體中miR-940表達；再轉染PC-3細胞并建立PCa-hMSC共培養(yǎng)體系，觀察了PCa細胞外泌體miR-940過表達對骨轉移前微環(huán)境的影響。本研究結果顯示，PC-3細胞外泌體中miR-940表達明顯高于RWPE-1細胞外泌體；在PCahMSC共培養(yǎng)體系中，miR-940過表達組ALP、BGLAP基因表達及礦化面積占比較miR-940敲減組、空白對照組均明顯降低；這提示PCa細胞來源的外泌體miR-940有望成為逆轉骨轉移前微環(huán)境重構、抑制PCa骨轉移形成的潛在靶點。

綜上所述，外泌體miR-940可以有效抑制PCahMSC成骨分化，這為轉移性PCa個體化治療提供了新的靶點。但是其調控PCa骨轉移前微環(huán)境的分子機制尚未研究，筆者將進一步篩選出存在潛在調控的基因，驗證miR-940與候選靶基因是否存在直接的靶向關系，探討具體調控機制。