湛江灣沉積物中反硝化和厭氧氨氧化細(xì)菌的豐度、多樣性及分布特征*

毛鐵墻 董宏坡 陳法錦 侯慶華 朱慶梅 陽(yáng)雯娜張家偉 紀(jì)梓晗 凌煒琪

(1.廣東海洋大學(xué) 海洋與氣象學(xué)院 湛江 524088；2.華東師范大學(xué) 河口海岸學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200062)

盡管反硝化作用一直被認(rèn)為是海洋中脫氮的最重要過(guò)程,但隨著厭氧氨氧化(anammox)的發(fā)現(xiàn)并對(duì)其逐步的深入研究,科學(xué)家普遍認(rèn)為厭氧氨氧化才可能是海洋氮損失的主要原因(Thamdrupet al,2002)。有研究表明,厭氧氨氧化細(xì)菌對(duì)海洋中N2產(chǎn)生的貢獻(xiàn)率約為50%(Jettenet al,2009),對(duì)淡水生態(tài)系統(tǒng)中N2產(chǎn)生的貢獻(xiàn)率約為30%(Wenket al,2013)；也有研究表明,厭氧氨氧化在沉積物中脫氮貢獻(xiàn)率最高可達(dá)80%(Thamdrup,2012)。厭氧氨氧化微生物為專性厭氧的化能自養(yǎng)型細(xì)菌,其主要在厭氧環(huán)境下,以CO2為唯一碳源,將氨氧化為氮?dú)?+→N2+2H2O)。16SrRNA基因分析結(jié)果表明,厭氧氨氧化細(xì)菌隸屬于浮霉菌門(mén)(Strouset al,1999),分為五個(gè)Candidatus屬：“Candidatus Kuenenia”、“Candidatus Brocadia”、 “Candidatus Scalindua”、 “Candidatus Anammoxoglobus”和“Candidatus Jettenia”,且在海洋生態(tài)系統(tǒng)中,Candidatus Scalindua占主導(dǎo)地位(Choiet al,2016)。但由于培養(yǎng)條件的苛刻與困難,至今厭氧氨氧化細(xì)菌暫無(wú)純培養(yǎng)菌株(Danget al,2010),環(huán)境中厭氧氨氧化細(xì)菌的豐度和多樣性主要通過(guò)特異性引物如Anammox 16SrRNA或hzo基因(Schmidet al,2008)進(jìn)行研究。近些年來(lái),許多科學(xué)家使用分子生態(tài)學(xué)手段在海洋(Danget al,2010；Liet al,2013；Choiet al,2016)、淡水(Pentonet al,2006)以及陸地生態(tài)系統(tǒng)(Wanget al,2012；Menget al,2016)等生境中檢測(cè)到了厭氧氨氧化細(xì)菌,并對(duì)其豐度、多樣性以及生理生態(tài)功能開(kāi)展了較為深入的研究。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

湛江灣(110.32°—110.52°E,21.05°—21.38°N)位于中國(guó)粵西雷州半島的東北側(cè),臨近南海,其水域面積為1419km2,平均水深約13m,湛江地區(qū)屬于熱帶亞熱帶季風(fēng)氣候,由于河流輸入、潮汐作用、排污口等人為因素導(dǎo)致湛江灣沉積速率較快,其營(yíng)養(yǎng)鹽在四季的分布不均可能對(duì)沉積物中的微生物活動(dòng)有著重要的影響。2017年4月、9月、11月,2018年2月份航次采集湛江灣15個(gè)站位表層(0—3cm)沉積物樣品,站位信息詳見(jiàn)圖1。沉積物泥樣使用抓斗采泥器采集,取少量表層沉積物樣品裝入已滅菌的采樣杯,-20°C低溫保存并帶回實(shí)驗(yàn)室。取少量沉積物進(jìn)行分裝、離心,并于-80°C冰箱保存,以用于DNA提取；另取部分樣品進(jìn)行理化參數(shù)分析。

圖1 湛江灣沉積物采樣站位Fig.1 The sampling sites in Zhanjiang Bay

1.2 沉積物及其上覆水的理化指標(biāo)測(cè)定

營(yíng)養(yǎng)鹽、總有機(jī)碳(TOC)以及沉積物含水率的測(cè)定均參照《土壤農(nóng)化分析》(鮑士旦,2008)的方法,用2mol/L KCl溶液浸提取沉積物樣品,浸提液經(jīng)聚醚砜針式濾頭(13mm,0.45um,安普,上海)過(guò)濾后,采用連續(xù)流動(dòng)分析儀(Skalar Analytical B.V SAN++,檢測(cè)限：≥0.1μmol/L)測(cè)定、、,TOC含量用重鉻酸鉀-氧化還原滴定法進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)Wang等(2014)的方法,使用采水器采集沉積物上覆水,并采用碘量滴定法測(cè)定溶解氧(DO)。沉積物中的pH使用pH計(jì)(雷磁,上海儀電科學(xué))進(jìn)行測(cè)定；使用溫度計(jì)(雷磁,上海儀電科學(xué))測(cè)定溫度；對(duì)于孔隙水的獲取,取適量沉積物至2mL離心管,12000r/min室溫離心,然后使用鹽度計(jì)(WYY-Ⅱ鹽度計(jì),深圳)測(cè)量鹽度。

1.3 DNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR

DNA提取使用PowerSoil?DNA Isolation Kit提取試劑盒(MoBio公司,加拿大)從沉積物樣品中提取總DNA,并通過(guò)NanoVueTMPlus微量分析儀(GE公司,英國(guó))測(cè)定其DNA濃度。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(CFX96 TouchTM,Bio-Rad公司,美國(guó))進(jìn)行定量PCR,定量PCR選擇的特異性引物如表1所示。對(duì)于細(xì)胞色素cd1-亞硝酸鹽還原酶(nirS)基因、Cu-亞硝酸鹽還原酶(nirK)基因、一氧化二氮還原酶(nosZ)基因以及厭氧氨氧化的Ca.scalindua16SrRNA基因,總反應(yīng)體系為20μL,包括SYBR Permix ExTaqMII(2×)(Takara,大連)10μL,正、反向引物各 0.5μL(10μmol/L),1μL模板DNA,用雙蒸餾水(ddH2O)補(bǔ)至20μL。各基因擴(kuò)增程序如下：95°C,30s；95°C,5s；退火溫度見(jiàn)表1,退火時(shí)間：30s；72°C,30s(nirS、Ca.scalindua16SrR NA 基因延伸時(shí)間為60s)；共40個(gè)循環(huán),添加溶解曲線(將溫度從 65°C 提高至 95°C,每 5s提高 0.5°C)。所有的DNA樣品及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒都設(shè)置三個(gè)平行。

本研究設(shè)置陰性對(duì)照,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋,再進(jìn)行qPCR,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建主要按以下流程進(jìn)行：使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(Axygen,美國(guó))分別獲得純化后的nirS、nirK、nosZ、Ca.scalindua16SrRNA基因片段PCR產(chǎn)物,利用 pMD?l8-T Vector連接試劑盒(Takara,大連)將目的片段連接到載體上,并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,再涂布至含有AMP的固體培養(yǎng)基,放入恒溫震蕩培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)12h；然后挑取已做好標(biāo)記的1/2單菌落進(jìn)行菌落PCR,驗(yàn)證完畢后,選取擴(kuò)增結(jié)果良好的單菌落轉(zhuǎn)入含有適宜濃度AMP的液體培養(yǎng)基,并將其放至恒溫震蕩培養(yǎng)箱(37°C、180r/min)培養(yǎng)12—16h；然后使用質(zhì)粒提取試劑盒(Takara,大連)提取質(zhì)粒,從而獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。擴(kuò)增效率由以下公式計(jì)算：E%=(10-1/slope)-1(式中slope：標(biāo)曲斜率)(Klein,2002),本研究的斜率在-3.79—-3.05,其擴(kuò)增效率在84%—112%之間(R2＞0.98)。

表1 定量PCR(qPCR)引物Tab.1 Quantitative PCR(qPCR)primers used in this study

1.4 文庫(kù)構(gòu)建與高通量測(cè)序

以沉積物基因組DNA作為PCR模板,使用表1中nirS、nirK、nosZ特異性引物,利用Veriti?96-Well熱循環(huán)儀(Applied Biosystems,Foster,CA,美國(guó))進(jìn)行PCR擴(kuò)增,由于高通量測(cè)序結(jié)果需要對(duì)不同樣品序列進(jìn)行區(qū)分,故本研究對(duì)引物上游5′端添加標(biāo)簽(Barcode)。PCR 擴(kuò)增體系(20μL)為：10μL 2×Taq Plus Master mix(南京諾唯贊生物科技有限公司),1μL模板DNA,正、反向引物各 0.5μL(15μmol/L),8μL ddH2O。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性 3min,95°C變性 30s,退火：(nirS、nirK、nosZ、Ca.scalindua16SrRNA基因的退火溫度和時(shí)間分別為：56°C、20s；58°C、30s；57°C、30s；57°C、1min),72°C 延伸 45s,循環(huán)數(shù)為 35個(gè)；最后72°C延伸 10min；4°C保存。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(Axygen,美國(guó))進(jìn)行回收純化,送至上海微基生物科技有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量和均一化,構(gòu)建PE文庫(kù),并在Illumina平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。基于MOTHUR v.1.39.5軟件平臺(tái),按照MOTHUR操作流程(https：//mothur.org/wiki/MiSeq_SOP),對(duì)獲 得的序列進(jìn)行處理優(yōu)化,并按照97%的相似度進(jìn)行操作分類(lèi)單元(operational taxonomic unit,OTU)劃分,用于Coverage、 Chao1、 Shannon、Simpson等多樣性指數(shù)分析(Wanget al,2014)。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

抽取reads數(shù)為前20的OTU的代表序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST,提取其相似度高的前幾條序列與已知的OTU代表序列導(dǎo)入MEGA7.0軟件,使用鄰接法(neighbor-joining)對(duì)系統(tǒng)軟件進(jìn)行發(fā)育分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(phylogenetic tree),自助法(Boostrap method)設(shè)置1000次計(jì)算,步長(zhǎng)值(bootstrap value)低于50%不予以顯示。

1.6 生物學(xué)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 22軟件分析反硝化細(xì)菌、厭氧氨氧化細(xì)菌豐度與環(huán)境因子之間的相關(guān)性和顯著性水平(P＜0.05即有顯著相關(guān)性),單因素方差分析,以及線性回歸分析。用Vegan軟件中的典范對(duì)應(yīng)分析(canonical correspondence analysis,CCA)解析各站位的反硝化細(xì)菌、厭氧氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間的關(guān)系。用蒙特卡羅置換檢驗(yàn)(Monte Carlo Permutation Test)檢驗(yàn)環(huán)境因子和群落結(jié)構(gòu)之間相關(guān)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉積物樣品的理化性質(zhì)

沉積物樣品的理化性質(zhì)各月份變化趨勢(shì)如表2所示。溶解氧在四個(gè)月份都整體較高,最高可達(dá)8.49mg/L,可能對(duì)厭氧微生物的活動(dòng)有一定的抑制作用；pH值顯示湛江灣沉積物在十一月份時(shí)偏弱酸性(6.26),而四月份時(shí)偏弱堿性(7.99)；鹽度在九月份時(shí)最低(25.60),在二月份時(shí)最高(29.42)；銨鹽濃度在十一月份最低(3.42mg/kg),在九月份最高(7.39mg/kg)；硝酸鹽濃度在九月份最低(0.06mg/kg),四月份最高(0.40mg/kg)；亞硝酸鹽在十一月份最高(0.52mg/kg),而在四月、九月份未檢測(cè)到。

表2 不同月份沉積物理化參數(shù)Tab.2 Characteristics of sediment samples in different months

2.2 反硝化細(xì)菌及厭氧氨氧化細(xì)菌豐度與環(huán)境影響因素

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR,對(duì)湛江灣各站位沉積物樣品進(jìn)行了基于DNA水平上的絕對(duì)定量,結(jié)果顯示：nirS型、nirK型、nosZ型反硝化細(xì)菌、厭氧氨氧化細(xì)菌在四個(gè)月份的豐度平均值變化范圍分別為：6.17×105—9.12×105copies/g(以干土計(jì)),8.00×104—6.72×105copies/g(以干土計(jì)),6.39×103—1.81×104copies/g(以干土計(jì)),2.85×104—8.13×105copies/g(以干土計(jì))。在湛江灣四個(gè)月份中發(fā)現(xiàn)：nirS型反硝化細(xì)菌豐度在二月份達(dá)到最高(ANOVA,F=8.60,P=0.012),各站位平均豐度為9.12×105copies/g(以干土計(jì)),在四月份、九月份、十一月份的平均豐度分別為6.17×105copies/g(以干土計(jì))、7.59×105copies/g(以干土計(jì))、8.20×105copies/g(以干土計(jì))。nirS型反硝化細(xì)菌四個(gè)月份平均豐度在位于特呈島旁的Z15站位較之其它站位高一個(gè)數(shù)量級(jí),而位于寶鋼排污口的Z21站位平均豐度低于其他站位,僅為4.61×105copies/g(以干土計(jì)),各站位在四個(gè)月份的平均豐度有從湛江灣灣內(nèi)向?yàn)晨诟浇尸F(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)。nirk型反硝化細(xì)菌在九月份豐度最高(ANOVA,F=5.43,P=0.043),平均豐度為6.72×105copies/g(以干土計(jì))；四月份次之,其平均豐度為2.14×105copies/g(以干土計(jì))；十一月份最低(ANOVA,F=5.21,P=0.045),其平均豐度為3.88×104copies/g(以干土計(jì))。nosZ型反硝化細(xì)菌在四月份有最高豐度(ANOVA,F=24.79,P=0.000),其平均豐度為1.81×104copies/g(以干土計(jì)),而在其他三個(gè)月份的豐度變化不大,其空間分布的趨勢(shì)與nirS型反硝化細(xì)菌大體一致。對(duì)于厭氧氨氧化細(xì)菌而言,其在九月份有最高豐度(ANOVA,F=4.65,P=0.049),平均豐度為8.13×105copies/g(以干土計(jì))；四月份次之,平均豐度為1.74×105copies/g(以干土計(jì))；二月份豐度最低(ANOVA,F=7.19,P=0.018),平均豐度為2.85×104copies/g(以干土計(jì))。厭氧氨氧化細(xì)菌四個(gè)月份的平均豐度在位于火電廠旁的Z24站位平均豐度較之其他站位低了一個(gè)數(shù)量級(jí),而Z18站位平均豐度最高,為 8.22×105copies/g(以干土計(jì))。總的說(shuō)來(lái),在四個(gè)月份中nirS型反硝化細(xì)菌平均豐度最高,nosZ型反硝化細(xì)菌豐度在反硝化細(xì)菌中占比最低；而厭氧氨氧化細(xì)菌與在湛江灣中占主導(dǎo)作用的nirS型反硝化細(xì)菌相比較,兩者在四、九月份豐度相差不大,均處于同一數(shù)量級(jí),而在二月份、十一月份厭氧氨氧化細(xì)菌豐度則均低于nirS型反硝化細(xì)菌。另外,四個(gè)月份的nirS型反硝化細(xì)菌豐度與氨氧氨氧化細(xì)菌豐度呈顯著正相關(guān)性(R=0.572,P＜0.05)。

圖2 不同月份沉積物中反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌豐度變化箱型圖Fig.2 Box plot of abundance changes of denitrifying bacteria and anaerobic ammonium oxidizing bacteria in sediments of different months

使用SPSS 22分別對(duì)nirS、nirK、nosZ型反硝化細(xì)菌、厭氧氨氧化細(xì)菌豐度與沉積物樣品中的環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性分析(表3)。結(jié)果表明,nirS型反硝化細(xì)菌豐度與呈顯著正相關(guān)(P＜0.05),與pH呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)；nirK型反硝化細(xì)菌豐度與鹽度呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)；nosZ型反硝化細(xì)菌豐度與、pH呈顯著性正相關(guān)(P＜0.05),與溫度呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)；厭氧氨氧化細(xì)菌豐度與、呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。

2.3 湛江灣沉積物中反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌的多樣性

表4展現(xiàn)了5個(gè)沉積物站位中反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌的OTU數(shù)目和多樣性指數(shù)。從所有站位豐富度與多樣性指數(shù)計(jì)算結(jié)果來(lái)看,反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌文庫(kù)覆蓋率均在99%以上,表明得到的多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)有效可靠。

對(duì)于反硝化細(xì)菌,其在所有樣品中的OTU數(shù)范圍為278—563,nosZ的OTU數(shù)最大,nirK的OTU數(shù)最小；通過(guò)Chao1指數(shù)評(píng)估樣品中群落豐富度可知,nirS、nosZ型反硝化細(xì)菌均在Z15站位豐富度最高,Z24站位最小。nirK型反硝化細(xì)菌在Z21站位豐富度最高,Z06站位最小。通過(guò)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)對(duì)群落多樣性進(jìn)行分析,結(jié)果表明,對(duì)于nirS型反硝化菌,其群落多樣性在的Z15站位最大,在Z21站位最小；nirK型反硝化細(xì)菌的群落多樣性在Z21站位最大,在Z06站位最小；nosZ型反硝化菌的群落多樣性在Z15站位最大,在Z21站位最小。

表3 反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌豐度與環(huán)境變量的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation between abundances of denitrifying bacteria or anammox bacteria,and environmental variables

表4 nirS、nirK、nosZ、Ca.scalindua16SrRNA基因的豐富度和多樣性Tab.4 Richness and diversity of nirS,nirK,nosZ,Ca.scalindua16SrRNA genes

對(duì)于厭氧氨氧化細(xì)菌而言,在所有站位的樣品中,Ca.scalindua16SrRNA共有 207個(gè) OTUs,通過(guò)Chao1指數(shù)評(píng)估樣品中群落豐富度,其在Z06站位最大,在Z24站位最小；通過(guò)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)對(duì)群落多樣性進(jìn)行分析,其群落多樣性在灣口附近的Z21站位最大,在Z24站位最小。

總而言之,在湛江灣中,反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌在不同環(huán)境下的群落組成不同,且反硝化細(xì)菌的生物多樣性明顯比厭氧氨氧化細(xì)菌高。

2.4 湛江灣沉積物中反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析

基于OTU聚類(lèi)結(jié)果,提取reads數(shù)值為前20的OTU為代表序列,在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST,提取同源性高的序列導(dǎo)入MEGA7.0中,基于核酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),如圖3—6。nirS、nirK、nosZ、Ca.scalindua16SrRNA的OTUs分別占總序列的50.05%、44.24%、29.40%、98.45%。

對(duì)于nirS基因,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可劃分為6個(gè)Cluster,ClusterⅠ有10個(gè)OTUs跟不同環(huán)境得到的序列存在親緣關(guān)系,包括來(lái)自河口、水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)、富營(yíng)養(yǎng)化的海灣的沉積物。ClusterⅡ中OTU14和OTU17與九龍江和閩江、珠江口富營(yíng)養(yǎng)化的河口沉積物中得到的序列有著很高的親緣關(guān)系。ClusterⅢ中OTU34、OTU13與來(lái)自河口、海岸濕地沉積物得到的序列有很大的相似性。ClusterⅣ中有3個(gè)nirS OTUs與富營(yíng)養(yǎng)化的長(zhǎng)江口、大陸邊緣沉積物得到的序列有高親緣關(guān)系。ClusterⅤ中OTU5、OTU12與海洋表層、河口、富營(yíng)養(yǎng)化河口區(qū)、海灣沉積物存在一定得親緣關(guān)系。ClusterⅥ中只有OTU10與Chesapeake海灣的水層、河口等地區(qū)的沉積物有一定親緣關(guān)系。總的說(shuō)來(lái),與nirS基因OTUs同源性高的序列大部分來(lái)自河口沉積物。

圖3 基于反硝化細(xì)菌nirS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(自展1000次驗(yàn)證節(jié)點(diǎn)置信度)Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree based on denitrifying bacteria nirS sequence(Bootstrap values were calculated using 1000 replications)

對(duì)于nirK基因,共可分為五個(gè)Cluster,ClusterⅠ包含8個(gè)OTUs,它們與不同環(huán)境下獲得的序列有著一定的親緣關(guān)系,如黃河河口、我國(guó)東部海域、美國(guó)加利福利亞海灣等的沉積物。ClusterⅡ只包含OTU12,它與黃河河口沉積物、Fenghua垃圾填埋場(chǎng)、濕地土壤獲得的序列有著較高同源性。ClusterⅢ包含三個(gè)OTUs,分別為OTU18、OTU6、OTU10,它們間的相似性為96%—97%,與加利福利亞河口沉積物中所獲得的序列有著一定的相似性(84%—87%)。ClusterⅣ也只包含三個(gè)OTUs,分別為OTU13、OTU3、OTU7,它們與加利福利亞河口區(qū)沉積物獲得的序列有一定的同源性(85%)。ClusterⅤ包含4個(gè)OTUs,它們與濕地土壤獲得的序列有著很高的相似性(96%—100%)。

圖4 基于反硝化細(xì)菌nirK序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(自展1000次驗(yàn)證節(jié)點(diǎn)置信度)Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree based on denitrifying bacteria nirK sequence(Bootstrap values were calculated using 1000 replications)

對(duì)于nosZ基因,其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可分為4個(gè)Cluster。ClusterⅠ中共計(jì)14個(gè)OTUs,其中OTU8、OTU101、OTU24、OTU10、OTU26都屬于Alpha-proteobacteria,其他9個(gè)OTUs與來(lái)自不同環(huán)境里得到的序列有一定的親緣關(guān)系,包括海洋沉積物、紅樹(shù)林濕地土壤、近海岸沉積物等。ClusterⅡ包含3個(gè)OTUs,它們與近海岸、深海沉積物,近海岸海水得到的序列存在一定的同源性。ClusterⅢ中包含2個(gè)OTUs,分別為OTU2、OTU41,它們只與從萊州灣沉積物中得到的序列有高親緣關(guān)系。ClusterⅣ只有OTU7與從濕地、草原土壤,及鄱陽(yáng)湖沉積物中得到的序列有一定同源性。

對(duì)于Ca.scalindua16SrRNA基因而言,其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可分為3個(gè)Cluster。ClusterⅠ共包含7個(gè)OTUs,它們歸屬于未可培養(yǎng)的Candidatus Scalinduasp.其相似性范圍為94%—97%,同時(shí)它們與不同環(huán)境下得到的序列存在一定同源性關(guān)系,如深海冷泉、膠州灣、淡水湖等區(qū)域的沉積物。ClusterⅡ包含6個(gè)OTUs,它們與從淡水、水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)、鹽湖的沉積物中得到的序列有較高親緣關(guān)系。ClusterⅢ包括7個(gè)OTUs,OTU10、OTU11、OTU13、OTU15均未在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)里找到與之相匹配的序列,本研究將其定義為一個(gè) new cluster。

2.5 反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間的關(guān)系分析

圖5 基于反硝化細(xì)菌nosZ序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(自展1000次驗(yàn)證節(jié)點(diǎn)置信度)Fig.5 Neighbor-joining phylogenetic tree based on denitrifying bacteria nosZ sequence(Bootstrap values were calculated using 1000 replications)

圖6 基于厭氧氨氧化細(xì)菌Ca.scalindua16SrRNA序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(自展1000次驗(yàn)證節(jié)點(diǎn)置信度)Fig.6 Neighbor-joining phylogenetic tree based on anammox bacteria Ca.scalindua16SrRNA sequence(Bootstrap values were calculated using 1000 replications)

圖7 反硝化細(xì)菌、厭氧氨氧化細(xì)菌與環(huán)境因子的CCA分析Fig.7 CCA ordination plots for relationships between denitrifier or anammox bacteria and environment factors

通過(guò)CCA分析環(huán)境變化對(duì)反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響(圖7)。從圖7a可以看出,兩個(gè)CCA軸解釋了96.34%的nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化,且TOC對(duì)nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大。溶解氧對(duì)Z06、Z21的nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有較強(qiáng)的影響,硝酸鹽主要影響內(nèi)灣的Z24站位的nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。通過(guò)使用Permutation檢驗(yàn)的五個(gè)環(huán)境因子,結(jié)果表明,硝酸鹽(P＜0.05)與nirS型反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)顯著正相關(guān)。灣口Z17、Z15兩站位的nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高,而內(nèi)灣的Z24與其余幾個(gè)站位的nirS型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在較大差異。從圖7b可以看出,兩個(gè)CCA軸解釋了89%的nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化,且鹽度對(duì)其影響最大。pH對(duì)Z17的nirK型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較強(qiáng),溶解氧對(duì)Z06影響較強(qiáng),銨鹽對(duì)Z24影響較強(qiáng),而鹽度主要對(duì)Z21、Z15影響較強(qiáng)。通過(guò)使用Permutation檢驗(yàn)五個(gè)環(huán)境因子,結(jié)果表明硝酸鹽(P＜0.05)與nirK型反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)顯著正相關(guān)。Z21和Z15站位的nirK型反硝化細(xì)菌存在著較高的群落結(jié)構(gòu)相似性。從圖7C可以看出,兩個(gè)CCA軸解釋了79.10%的nosZ型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化,且鹽度對(duì)其影響最小。pH對(duì)Z17的nosZ型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較強(qiáng),銨鹽對(duì)Z24影響較強(qiáng),硝酸鹽對(duì)Z06影響較強(qiáng),而鹽度對(duì)Z15影響最強(qiáng)。使用Permutation檢驗(yàn)五個(gè)環(huán)境因子,結(jié)果表明,各環(huán)境因子對(duì)nosZ型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均無(wú)顯著性差異。在Z06和Z24的nosZ型反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)具有較高相似性。從圖7D可以看出,兩個(gè)CCA軸解釋了98.94%的厭氧氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化,且在Z17和Z21具有較高的群落相似性。溶解氧對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較其他因素強(qiáng)。pH對(duì)Z21站位的厭氧氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較強(qiáng),鹽度對(duì)Z17影響較強(qiáng),TOC對(duì)Z24影響較強(qiáng)。通過(guò)使用Permutation檢驗(yàn),結(jié)果表明銨鹽(P＜0.05)和硝酸鹽(P＜0.05)與厭氧氨細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)具有顯著正相關(guān)性。綜上所述,硝酸鹽可能是影響反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌的一個(gè)重要環(huán)境因素。

3 討論

盡管科學(xué)家們對(duì)于反硝化微生物和厭氧氨氧化微生物的豐度、多樣性、群落結(jié)構(gòu)等都有較為深入的研究(Kimet al,2016；Oshikiet al,2016),但對(duì)于反硝化細(xì)菌與厭氧氨氧化細(xì)菌之間的關(guān)系及其季節(jié)性的變化仍有一定的局限性。本研究對(duì)湛江灣沉積物中反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌各季度的豐度進(jìn)行分析,由圖2可看出,反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌在不同季節(jié)的豐度變化較大,其整體豐度大小為：秋季＞夏季＞春季＞冬季,這可能是由于湛江灣在一年中氮輸入量在秋季最大,夏季次之(施玉珍等,2015),而亞硝酸鹽、銨鹽可分別為反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化微生物提供底物,從而刺激反硝化作用及厭氧氨氧化作用,本研究也發(fā)現(xiàn)nirS、nosZ型反硝化細(xì)菌豐度與亞硝酸鹽均呈顯著正相關(guān)性(P＜0.05),厭氧氨氧化細(xì)菌與銨鹽、亞硝酸鹽均呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)性(P＜0.05),這可從一定程度上說(shuō)明亞硝酸鹽和銨鹽對(duì)反硝化作用及厭氧氨氧化作用的影響。對(duì)于反硝化細(xì)菌,其結(jié)果表明,湛江灣中的nirS型反硝化細(xì)菌豐度變化范圍相對(duì)較低于舊金山海灣、萊州灣、揚(yáng)子江河口區(qū)域(Mosieret al,2010；Wanget al,2014；Zhenget al,2015),而比黃河河口區(qū)域高,其變化范圍為 4.34×104—2.62×105copies/g(以干土計(jì))(Liet al,2017)。nirS型反硝化細(xì)菌豐度在二月份最高,十一月份次之,四月份最低,這可能與pH和亞硝酸鹽有關(guān),pH在四月份、九月份明顯高于二月份和十一月份(表2),而亞硝酸鹽濃度則與之相反(四、九月份亞硝酸鹽濃度低于檢測(cè)限),盡管二月份的pH要高于十一月份,但二月份的亞硝酸鹽濃度卻低于十一月份；而從其空間分布來(lái)看,nirS型反硝化細(xì)菌四個(gè)月份平均豐度在位于特呈島旁的Z15站位較之其它站位高一個(gè)數(shù)量級(jí),而位于寶鋼排污口的Z21站位平均豐度低于其它站位,僅為4.61×105copies/g(以干土計(jì)),各站位在四個(gè)月份的平均豐度有從湛江灣灣內(nèi)向?yàn)晨诟浇尸F(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì),亞硝酸鹽濃度也大致呈現(xiàn)出此變化趨勢(shì),且本研究發(fā)現(xiàn)pH與nirS型反硝化細(xì)菌豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05),亞硝酸鹽與其呈顯著正相關(guān)(P＜0.05),故而pH和亞硝酸鹽可能相互制約、共同調(diào)控著湛江灣中的nirS型反硝化細(xì)菌豐度。nirK型反硝化細(xì)菌豐度變化范圍相對(duì)較一些河口區(qū)域低,如南海、舊金山海灣(Liet al,2013；Leeet al,2017),與美國(guó)Elkhorn Slough區(qū)域的nirK豐度大致相同(Smithet al,2015)。nirK型反硝化細(xì)菌豐度在湛江灣四個(gè)月份的變化比較明顯,在九月份的時(shí)候豐度最高,這可能是DO對(duì)其影響比較大(Lefebvreet al,2006)。nosZ豐度變化范圍相對(duì)來(lái)說(shuō)比La Caldera湖低(Castellano-Hinojosaet al,2017),其在四月份豐度最大,其他月份相差不大明顯,這可能與亞硝酸鹽、溫度、溶解氧有關(guān)(表3)。從圖2可看出湛江灣反硝化作用以nirS型反硝化細(xì)菌為主導(dǎo),其豐度明顯高于nirK、nosZ型反硝化細(xì)菌,這與在舊金山海灣的研究結(jié)果一致(Mosieret al,2010)。對(duì)于氨氧氨氧化細(xì)菌而言,其在九月份豐度最高,四月份次之,二月份最低,這可能與銨鹽、亞硝酸鹽有關(guān)。在湛江灣沉積物中,厭氧氨氧化細(xì)菌與主導(dǎo)反硝化作用的nirS型反硝化菌相比較,發(fā)現(xiàn)在二月份、十一月份時(shí),厭氧氨氧化細(xì)菌豐度明顯小于nirS型反硝化細(xì)菌,本研究通過(guò)SPSS 22分析豐度與環(huán)境因子的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn),厭氧氨氧化細(xì)菌豐度與呈顯著的正相關(guān)性(P＜0.05),且二月份、十一月份的 N O+4-N濃度低于四、九月份,這可從一定程度上說(shuō)明厭氧氨氧化微生物在此時(shí)的活動(dòng)受到一定的抑制,使得消耗量減少,其濃度累積較高,這促進(jìn)了nirS型反硝化細(xì)菌的活動(dòng),故而在此時(shí),厭氧氨氧化細(xì)菌的豐度明顯低于nirS型反硝化細(xì)菌。而在四月份和九月份時(shí),厭氧氨氧化細(xì)菌與主導(dǎo)反硝化的nirS型反硝化細(xì)菌豐度相差不大,此時(shí)亞硝酸鹽的濃度低于儀器檢測(cè)限以下,且通過(guò)相關(guān)性分析結(jié)果表明,與nirS/Ca.scalindua16SrRNA豐度比值呈顯著負(fù)相關(guān)性(P＜0.05),這說(shuō)明厭氧氨氧化細(xì)菌與反硝化細(xì)菌對(duì)亞硝酸鹽可能存在一定的競(jìng)爭(zhēng)作用,使亞硝酸鹽濃度嚴(yán)重偏低,這與前人的研究結(jié)果一致(Duet al,2017)。本研究通過(guò)分析四個(gè)月份的nirS型反硝化細(xì)菌與厭氧氨氧化細(xì)菌呈顯著正相關(guān)性(P＜0.01),并通過(guò)CCA分析表明,硝酸鹽對(duì)nirS、nirK型反硝化細(xì)菌,以及厭氧氨氧化細(xì)菌均有著顯著的正相關(guān)性,這表明硝酸鹽可能是反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌共存的重要環(huán)境因子,這與Li等(2016)對(duì)于反硝化細(xì)菌與厭氧氨氧化細(xì)菌的研究結(jié)果一致。在厭氧環(huán)境條件下,硝酸鹽能被反硝化作用還原為亞硝酸鹽,這可為反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌提供底物,同時(shí)有研究表明,硝酸鹽顯著影響反硝化和厭氧氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)(Wanget al,2012；Menget al,2016)。綜合上述分析推測(cè),湛江灣棲息的厭氧氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌之間存在一種特殊的競(jìng)爭(zhēng)與共存的關(guān)系,且由銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽、pH等共同驅(qū)動(dòng)。

研究發(fā)現(xiàn)nirS豐富度變化范圍為351.08—459.05,其結(jié)果大小順序?yàn)閆15＞Z17＞Z21＞Z06＞Z24,可以看出nirS型反硝化細(xì)菌豐富度從湛江灣內(nèi)向?yàn)晨诟浇尸F(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì),并在特呈島旁的Z15站位有最大值,這可能是因?yàn)樵赯15站位的周邊有許多的魚(yú)蝦養(yǎng)殖區(qū),使得大量DIN的輸入影響了nirS反硝化細(xì)菌的群落(Honget al,2014)；Shannon指數(shù)分析表明,nirS型反硝化細(xì)菌的群落多樣性在Z15最大,位于寶鋼鋼鐵廠排污口附近的Z21最低,且nirS型反硝化細(xì)菌四個(gè)月份平均豐度在Z15站位最高,而Z21的平均豐度最低,這可能表明nirS型反硝化細(xì)菌群落耐受污染能力較弱。nirK型反硝化細(xì)菌豐富度范圍為 244.14—449.25,其豐富度的平均值為(367.36±93.24),比nirS型反硝化細(xì)菌(408.89±40.66)低,這與Jiang等(2017)研究長(zhǎng)江沉積物中反硝化細(xì)菌的結(jié)果一致。Shannon指數(shù)分析表明,nirK型反硝化細(xì)菌的群落多樣性在位于寶鋼排污口的Z21站位最大,而在位于東頭山島旁的Z06站位最小,這可能揭示了nirK型反硝化細(xì)菌群落耐污染能力較強(qiáng),這與nirS型反硝化細(xì)菌相反,且兩者在四個(gè)月份的基因平均豐度也表明,Z21站位的nirK高于nirS型反硝化細(xì)菌。nirK型反硝化細(xì)菌Shannon指數(shù)的平均值(4.32±0.49)稍低于nirS型反硝化細(xì)菌(4.43±0.37),這與前人研究結(jié)果基本一致,如長(zhǎng)江沉積物(Jianget al,2017)、湖泊沉積物(Saarenheimoet al,2015)。本研究中nirS的Shannon指數(shù)比長(zhǎng)江沉積物(Zhenget al,2015；Jianget al,2017)、Chesapeake 海灣沉積物(Franciset al,2013)高。nosZ豐富度范圍為405.50～569.95,其結(jié)果大小為Z15＞Z17＞Z21＞Z06＞Z24,可以看出nosZ與nirS豐富度的變化趨勢(shì)相同,且其群落多樣性在Z15最大,Z21最小,這與nirS型反硝化細(xì)菌的群落多樣性變化一致。而對(duì)于厭氧氨氧化細(xì)菌而言,其群落豐富度遠(yuǎn)低于反硝化細(xì)菌,Chao1指數(shù)的平均值僅為49.84±4.32,在東頭山島旁的Z06站位最大,而在火電廠旁的Z24站位最小；其Shannon指數(shù)的平均值為1.56±0.56,且群落多樣性在灣口附近的Z21站位最大,在內(nèi)灣的Z24站位最小,且厭氧氨氧化細(xì)菌四個(gè)月份的平均豐度在位于火電廠旁的Z24站位較之其他站位低了一個(gè)數(shù)量級(jí),靠近灣口的Z18站位豐度最高,且灣口其他站位的豐度均較高于灣內(nèi),說(shuō)明湛江灣厭氧氨氧化細(xì)菌呈現(xiàn)出從灣口向?yàn)硟?nèi)逐漸遞減的趨勢(shì)。厭氧氨氧化細(xì)菌群落多樣性明顯低于反硝化細(xì)菌,這與Li等(2013)對(duì)于中國(guó)南海表層沉積物中nirS型反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌的研究結(jié)果一致。

通過(guò)分析反硝化細(xì)菌的nirS、nirK、nosZ基因的進(jìn)化樹(shù)(圖3—5),發(fā)現(xiàn)在nirS基因進(jìn)化樹(shù)中,ClusterⅠ中的OTUs跟許多棲息地中得到的序列有很高的相似性,包括來(lái)自河口、水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)、富營(yíng)養(yǎng)化的海灣的沉積物。ClusterⅠ中的這些OTUs遍及于諸多海域的沉積物中,如膠州灣(Danget al,2009),說(shuō)明這些nirS型反硝化細(xì)菌在海洋中是廣泛分布的。在ClusterⅡ中,OTU14和OTU17與九龍江和閩江、珠江口富營(yíng)養(yǎng)化的河口沉積物中得到的序列有著很高的親緣關(guān)系,說(shuō)明這兩類(lèi)反硝化細(xì)菌對(duì)鹽度的適應(yīng)能力很強(qiáng),在淡水和海水中都有存在,這也從一定程度說(shuō)明鹽度影響了某些nirS型反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu),這也符合Mosier等(2010)在舊金山海灣河口的研究結(jié)果。同時(shí)本文發(fā)現(xiàn)nirS中包含的OTUs序列大多數(shù)與來(lái)自河口區(qū)域的序列有很高的相似性,如珠江口、九龍江河口、墨西哥河口、長(zhǎng)江河口等流域。對(duì)于nirK基因,其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分為5個(gè)Cluster,其中ClusterⅡ只包含OTU12,它與黃河河口沉積物、Fenghua垃圾填埋場(chǎng)、濕地土壤獲得的序列有著較高同源性,說(shuō)明該類(lèi)nirK型反硝化細(xì)菌在陸地和海洋廣泛分布,且其對(duì)環(huán)境污染的適應(yīng)能力很強(qiáng)。ClusterⅢ包含三個(gè)OTUs,分別是OTU18、OTU6、OTU10,它們間的相似性為96%—97%,與舊金山河口沉積物(Mosieret al,2010)中所獲得的序列有著一定的相似性(84%—87%)。ClusterⅣ也只包含三個(gè)OTUs,分別為OTU13、OTU3、OTU7,它們與舊金山河口沉積物(Mosieret al,2010)獲得的序列有一定的同源性(85%)。本研究發(fā)現(xiàn)在ClusterⅤ中包含4個(gè)OTUs,它們只與濕地土壤獲得的序列有著很高的相似性(96%—100%),說(shuō)明這幾類(lèi)nirK型反硝化細(xì)菌之前在海洋里還未曾被發(fā)現(xiàn),是一類(lèi)新奇的海洋nirK型反硝化細(xì)菌。對(duì)于nosZ基因,其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明,nosZ型反硝化細(xì)菌主要屬于Alpha-proteobacteria,這與Castellano-Hinojosa等(2017)在地中海區(qū)域的高山湖的研究結(jié)果一致。在ClusterⅠ中的9個(gè)OTUs與來(lái)自不同環(huán)境里得到的序列有一定的親緣關(guān)系,包括海洋沉積物、紅樹(shù)林濕地土壤、近海岸沉積物等,說(shuō)明這些nosZ型反硝化細(xì)菌存在于不同的生境中。ClusterⅢ中只包含OTU2、OTU41,且它們只與從萊州灣沉積物中得到的序列有高親緣關(guān)系,說(shuō)明這兩類(lèi)nosZ型反硝化細(xì)菌之前可能只存在于萊州灣海域,本研究在湛江灣海域可能目前尚屬于第二次發(fā)現(xiàn)這兩類(lèi)反硝化細(xì)菌。ClusterⅣ只有OTU7,它與從濕地、草原土壤,及鄱陽(yáng)湖沉積物中得到的序列有一定同源性,說(shuō)明該類(lèi)nosZ型反硝化細(xì)菌之前只在陸地和淡水區(qū)域有發(fā)現(xiàn),本研究可能是首次在海洋里發(fā)現(xiàn)這類(lèi)反硝化細(xì)菌。

對(duì)于厭氧氨氧化細(xì)菌而言,其進(jìn)化樹(shù)主要分析了由沉積物樣品中擴(kuò)增的厭氧氨氧化16SrRNA基因,一個(gè)以“Candidatus Scalindua”(圖6)為主的厭氧氨氧化群落。其進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明,湛江灣地區(qū)的厭氧氨氧化細(xì)菌主要屬于Candidatus Scalinduasp.,以及浮霉菌門(mén)(planctomycetes),這跟一些科學(xué)家以前在其他不同環(huán)境中的研究結(jié)果一致(Danget al,2010；Liet al,2013),且它們具有較高的耐鹽性,存在于許多生境中,如一些上升流水柱的低氧區(qū)和一些次低氧水體中(Schubertet al,2006；Schmidet al,2007)。Cluster Ⅲ包括 7個(gè)OTUs,且OTU10、OTU11、OTU13、OTU15均未在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)里找到與之相匹配的的序列,說(shuō)明在湛江灣沉積物中棲息著一些還未曾被發(fā)現(xiàn)的新奇的厭氧氨氧化細(xì)菌。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn),在熱帶海灣反硝化細(xì)菌與厭氧氨氧化細(xì)菌之間存在特殊的競(jìng)爭(zhēng)與共存的關(guān)系,即當(dāng)亞硝酸鹽濃度較低時(shí),反硝化和厭氧氨氧化細(xì)菌豐度均比其他月份高,且相關(guān)性分析結(jié)果表明亞硝酸鹽與nirS/Ca.scalindua16SrRNA豐度比值呈顯著負(fù)相關(guān)性,說(shuō)明兩者對(duì)亞硝酸鹽可能存在競(jìng)爭(zhēng)作用；而四個(gè)月份的nirS型反硝化細(xì)菌與氨氧氨氧化細(xì)菌豐度呈顯著正相關(guān)性,說(shuō)明兩者可能同時(shí)存在共存的關(guān)系,且CCA分析結(jié)果表明,硝酸鹽可能影響反硝化和厭氧氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明在湛江灣海域棲息著一些新型的反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌,這對(duì)于深入認(rèn)識(shí)人類(lèi)活動(dòng)影響下的熱帶海灣中的反硝化和厭氧氨氧化細(xì)菌有著重要的意義。施玉珍,張瑜斌,孫省利,2015.湛江灣富營(yíng)養(yǎng)化分布特征及與環(huán)境因子的關(guān)系.環(huán)境科學(xué)與技術(shù),38(12)：90—96,122袁 旗,許振勇,彭華強(qiáng)等,2016.湛江灣及其附近海域近5年海水中氮、磷變化趨勢(shì)研究.綠色科技,(24)：41—45鮑士旦,2008.土壤農(nóng)化分析.3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,50—56