底棲硅藻生物膜附著基對扇貝幼蟲附著和變態的影響*

杜美榮 方建光 毛玉澤 李 鋒 高亞平房景輝 王同勇 蔣增杰①

(1.農業部海洋漁業資源可持續利用重點開放實驗室 山東省漁業資源與生態環境重點實驗室 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071；2.青島海洋科學與技術國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266000；3.威海市文登區水產技術推廣站 威海 264400)

我國是世界第一水產養殖大國和水產品貿易大國(唐啟升等,2014),貝類養殖在水產養殖中占據舉足輕重的地位,目前已養殖的種類有40余種(王如才等,2008),我國主要養殖的扇貝包括櫛孔扇貝、蝦夷扇貝、海灣扇貝等。其中,大量苗種的獲得對規模化養殖功不可沒。人工培育的苗種可以彌補天然苗種的不足,有目的地選種和育種,提高養殖企業的效益,是規?；B殖中獲取苗種的主要方式(王如才等,2008)。

扇貝苗種培育經歷胚胎期、浮游幼蟲期和附著變態期。附著變態是扇貝幼蟲發育史中的重要環節,其形態和生活習性發生巨大的變化,是發育和存活的敏感期。在此過程中,幼蟲分泌足絲在適合的附著基上進行附著,面盤退化,發育出鰓、閉殼肌,在幾丁質殼的外緣長出新的碳酸鈣質的殼(次生殼),由浮游生活轉變為固著生活。附著變態階段幼蟲對環境因素異常敏感,環境因素稍有不適,幼蟲即會延遲變態或者大量死亡,死亡率有時可以高達80%—90%,給生產造成巨大損失(Keoughet al,1982)。對雙殼貝類的附著和變態的化學物質的研究較多,例如咖啡因能誘導海灣扇貝Argopecten irradians的變態(Zhanget al,2003),K+、GABA離子能促進紅鮑幼蟲和螺的附著和變態,L-DOPA和兒茶酚胺等神經遞質能促進長牡蠣幼蟲的附著和變態(Coonet al,1990；Zhanget al,2003；Fenget al,2006；Luet al,2006),化學物質的誘導并不穩定,會導致幼蟲死亡率高等問題。幼蟲被誘導后會出現下沉到培育池底部或者無附著變態的現象,難以實現向人為投放的附著基上附著(定向附著),而定向附著在使用懸浮性附著基(聚乙烯網片,紅棕繩)的貝類(扇貝,魁蚶等)采苗中十分重要(Zhang,2000),在此過程中如果可以優化育苗技術方案來促進眼點幼蟲大量同步定向附著和變態,將可以顯著地提高扇貝育苗中產量和效益。

生物膜、菌膜等被眾多學者認為能較好地誘導海洋無脊椎動物幼蟲的附著和變態(Baoet al,2007；Peteiroet al,2007；Zapataet al,2007；Yuet al,2010),且定向性好。底棲硅藻是生物膜的一種,關于底棲硅藻對無脊椎動物幼蟲附著變態誘導作用的研究大多集中在鮑、參和海膽等(柯才煥等,2001；康慶浩等,2003；于秀娟等,2007)。研究表明,硅藻膜之于鮑、刺參和海膽幼蟲,是三種舔食/雜食性動物附著變態階段的優良餌料(Chen,2007；Xinget al,2008；Tunget al,2011),食物來源是一個關鍵因素(Watsonet al,2004；Xinget al,2008)。底棲硅藻為附著型硅藻,而扇貝的幼蟲和稚貝均為濾食性,附著型的底棲硅藻是否能成為濾食型貝類的有效食物來源尚存質疑,尚無底棲硅藻附著基對扇貝附著和變態的影響相關研究。櫛孔扇貝Chlamys farreri和海灣扇貝為我國北方重要養殖經濟貝類,附苗量和變態率的高低對育苗生產至關重要,本研究針對底棲硅藻附著基對櫛孔扇貝和海灣扇貝的附著和變態的影響進行了實驗,目的是為生態、高效的商業化苗種培育提供理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

附著基分為2種,一種為聚乙烯網片附著基,目前被廣泛應用于雙殼貝類后期幼蟲附著。聚乙烯網片附著基由聚乙烯繩(直徑約1.5—2.0mm)編織而成的網結組成,成品規格為40×80cm,每張網片約3000網扣,網扣處面積較大,是幼蟲附著的主要位置,實際養殖生產中常以網扣為計量稚貝附著數量的單位。網片下方懸掛墜石,在培育池內海水浮力的作用下,網片便可垂直懸浮于育苗池中。另外一種為載玻片,主要用于底棲硅藻的附著后在顯微鏡下觀測底棲硅藻在黑暗的幼蟲培育池內的數量變動情況。

實驗中所用的底棲硅藻為混合藻種,優勢種類為舟形藻Naviculasp.和卵形藻Naviculasp.(金德祥等,1982),將聚乙烯網片和載玻片進行清洗后接種底棲硅藻,聚乙烯網片接種30片,載玻片接種6片,具體操作如下。在扇貝預計附著前10d開始進行接種,首先將聚乙烯網片平鋪于藻類培養室的池底,載玻片裝于玻片架置于水池中,加水至水深約20—30cm,按照接種密度1.5×104cell/mL的接種密度將底棲硅藻藻種均勻的潑灑于水池中。第5天,將載玻片和聚乙烯網片附著基分別翻轉過來,按照同樣的密度進行另外一面的接種,培育池水溫8—10°C,光照300—400μmol/(m2·s)。從第2天開始,使用流水培養附著基,流速為0.5—0.8cm/s,每天流水4h,流水后施肥,施肥的營養鹽比例為：硝酸鈉(10mg/L),磷酸二氫鉀(1mg/L),檸檬酸鐵(0.1mg/L),硅酸鈉(0.1mg/L)。

幼蟲于全黑暗的幼蟲培育池內培育,當眼點幼蟲的數量超過30%時開始投放附著基。眼點幼蟲布苗密度為5個/mL,將底棲硅藻網片附著基,對照組網片附著基和載玻片附著基按照常規操作布放于幼蟲培育池,分別觀測附著基上幼蟲的附苗量和變態率(計算公式如下)以及底棲硅藻在育苗池環境下的數量變動。每個幼蟲培育池投放附著基200片,其中投放底棲硅藻處理組附著基100片,對照組附著基100片,均勻的穿插布放。在投入附著基12d后進行附著和變態數據統計,每種附著基選取10片,在上、中、下三個位置分別剪取5—10個網扣,計數幼蟲、稚貝和死殼的數量,并計算附苗量和變態率。實驗于3個幼蟲培育池內開展,實驗結束后以三個培育池的附著基上的數量計算平均值和標準差。附苗量和變態率計算公式如下：

載玻片用于計數底棲硅藻在育苗池內的數量變動情況。每3d一次將載玻片從幼蟲培育池內取出進行底棲硅藻豐度的測定后迅速放回至幼蟲培育池內,豐度測定于顯微鏡(×400)下進行,視野內所有的底棲硅藻均進行計數,一個載玻片計數6個視野,使用目微尺測量視野直徑,計算視野的面積并統計底棲硅藻的豐度。

1.2 基于穩定碳氮同位素的櫛孔扇貝稚貝食物來源分析

人工培育下,扇貝幼蟲和稚貝的主要食物來源為人工培育的金藻Isochrysis galbana,扁藻Platymonas subcordiformis。將金藻和扁藻分別經4500r/min離心后去掉上清液經60°C烘干,瑪瑙研缽研磨過篩(180目),稚貝烘干后經HCl酸洗處理,以上所制備的樣品進入連接元素分析儀(Elementar,美國)的同位素質譜儀ISOprime 100(Isoprime,英國)進行δ13C和δ15N的測定。碳、氮同位素比值以δ值的形式表達,定義為δX(‰)=[(Rsample/Rstandard)-1]×1000,式中,X表示13C或15N；Rsample是樣本的同位素比值(12C/13C；14N/15N),Rstandard是標樣的同位素比值。碳、氮穩定同位素測定的標準物質分別為 PDB(美洲擬箭石)和空氣中的N2。

1.3 掃描電鏡樣品制備方法

將在底棲硅藻附著基上完成附著變態的櫛孔扇貝稚貝連同附著基一起剪下,反復用生理鹽水沖洗后,固定于2.5%的戊二醛溶液中。乙醇脫水,醋酸異戊脂置換,CO2臨界點干燥器干燥,離子濺射儀鍍金,KYKY-2800B掃描電鏡觀察并拍照。

1.4 數據分析

數據使用SPSS18.0進行分析,不同處理組別間附苗量和變態率的使用獨立樣本T檢驗,以P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。主要食物來源對扇貝食物貢獻的分析用混合模型在R程序包SIAR(Stable IsotopeAnalysis in R)下進行(Parnellet al,2010)。軟件運行50000次,計算各食物源0.95、0.75和0.25的置信水平下的置信區間(分別以淺灰色、中灰色和深灰色顯示),其中0.95下的置信區間在文中詳述。

2 結果

2.1 底棲硅藻附著基對海灣扇貝和櫛孔扇貝附著和變態的影響

底棲硅藻附著基對海灣扇貝和櫛孔扇貝附著變態的影響結果(表1)表明,底棲硅藻附著基的附苗量和變態率均高于對照組附著基,海灣扇貝實驗中,底棲硅藻處理組比對照組附苗量提高220.19%(P＜0.01),變態率和殼長指標中,處理組和對照組差異不顯著(P＞0.05)。在櫛孔扇貝實驗中底棲硅藻處理組比對照組附苗量提高43.02%(P＜0.01),變態率提高87.31%(P＜0.01),底棲硅藻處理組殼長和對照組差異不顯著(P＞0.05)。對照組附著基約在投放7d左右在附著基上可以檢查到變態的稚貝,而底棲硅藻附著基在投放4d后即可檢查到變態的稚貝,比對照組早3d。

表1 底棲硅藻附著基對海灣扇貝和櫛孔扇貝附著和變態的影響Tab.1 Effects of benthic diatom filmed substrate to the settlement and metamorphosis of A.irradias and C.farreri

2.2 附著基上扇貝的掃描電鏡觀察

對附著在底棲硅藻處理后的聚乙烯網片上的櫛孔扇貝稚貝的掃描電鏡觀察發現,底棲硅藻在網片上生長狀態良好,雖然有少量硅殼破碎的現象,但大部分生長良好,部分處于分裂期,櫛孔扇貝稚貝在附著基上分泌足絲附著,生長狀態良好。

2.3 底棲硅藻在幼蟲培育池內的數量變動

底棲硅藻載玻片在幼蟲培育池內的數量變動情況見圖2,底棲硅藻接種并生長10d后,轉移至黑暗的幼蟲培育池,由于光照不足,底棲硅藻光合作用受限,在充氣和換水等影響下容易導致脫落,數量有一定的下降,但豐度最終能保持56.0—183.9ind/mm2。

2.4 底棲硅藻附著基上扇貝的食物來源

大規模人工培育的稚貝,其主要投喂餌料為金藻和扁藻,對底棲硅藻附著基上的稚貝的穩定同位素測定,使用基于混合模型對其食物來源進行分析結果顯示櫛孔扇貝幼蟲培育池中金藻對稚貝的食物貢獻較高(圖3),其0.95水平的置信區間的貢獻率為18%—65%(淺灰色),高于扁藻的28%—44%,位于第三的是底棲硅藻,其0.95水平的置信區間的貢獻率為0%—44%,附著于底棲硅藻附著基上的稚貝,底棲硅藻也是其食物來源之一。

圖1 底棲硅藻附著基上附著櫛孔扇貝稚貝的掃描電鏡觀察Fig.1 Scanning electron microscopic observation of C.farreri on the benthic diatom filmed substrate

圖2 底棲硅藻在扇貝幼蟲培育池內的數量變動Fig.2 Quantity changes of the benthic diatom in the scallop larval nursery pool

圖3 基于混合線性模型的底棲硅藻附著基上櫛孔扇貝稚貝的食物來源分析Fig.3 Comparison in the contributions(%)of food source to C.farreri spat on benthic diatom filmed substrate

3 討論

硅藻廣泛分布于自然界的各大海水、淡水水域,數量和種類占水域浮游生物的90%以上,是水域初級生產力的主要貢獻者,浮游種類為濾食性貝類和小型浮游動物提供餌料,貢獻初級生產力。底棲硅藻能生長于生物和非生物的表面,有一定的運動能力,細胞壁較厚(金德祥等,1982)。底棲硅藻附著的底層表面能有效地誘導鮑、刺參和海膽等舔食型幼蟲的附著和變態(Avenda?o-Herreraet al,2003；Chen,2007；Xinget al,2008；Van Colenet al,2009；Tunget al,2011；孫景春,2012)。硅藻之于鮑、刺參和海膽幼蟲,食物來源是一個關鍵因素(Watsonet al,2004；Xinget al,2008),對于濾食性的扇貝幼蟲是否有效,尚未見相關報道。普遍認為底棲硅藻為附著型的硅藻,而扇貝幼蟲的整個發育周期為濾食性,底棲硅藻在刺參和鮑附著變態中的誘導機理是基于其優良的食物來源,而附著型的底棲硅藻在幼蟲食譜組成中的貢獻有限。其次,扇貝幼蟲培育過程對水質要求極為苛刻,海水必須經過不少于24h的沉淀、砂濾等,力求使得水體中的顆粒有機物、微生物和藻類的數量降到最低,最大限度減少對幼蟲培育環境的影響。貝類用附著基(網片)也要采用多道程序的浸泡、清洗、沖刷甚至使用鹽酸、抗生素等處理。目的也是減少對幼蟲培育水體穩定性的影響。并且,現有的底棲硅藻的培養一般不是純種/無菌培養,大部分采用刮取長流水地面或者池壁,或者洗刷大型藻表面附著的底棲硅藻獲得,幾乎均是混種/菌培養,其中不乏夾雜著浮游動物、原生動物等。

本研究結果從電鏡,底棲硅藻在幼蟲培育池內的狀態以及其誘導附著變態效果多方面對以上幾個問題進行了解析。目前扇貝幼蟲的商業化培育過程一般為黑暗培育,幼蟲培育池內光照低于底棲硅藻附著基培育池內的光照(300—400μmol/(m2·s)),本文的研究表明,進入幼蟲培育池的黑暗環境后,底棲硅藻附著基上的底棲硅藻豐度逐漸降低。相似的結果在其他藻類也有發現,針對近岸卵形藻Cocconeis sublittoralis的結果表明,在 16.6μmol/(m2·s)的低光照下,細胞數量先小幅度提高,在接種2d或4d后數量開始下降(Parkeret al,2007),近岸卵形藻的豐度在高光照處理組比低光照處理組要低。在本研究中,在扇貝幼蟲培育池的低光照環境下,部分底棲硅藻能夠存活,在稚貝附著變態前(附著基投入后8—10d)仍能保持一定的豐度,幼蟲培育池的換水頻率為每天兩次,脫落個體會在每天兩次的換水中被換掉,不影響幼蟲培育池的環境,掃描電鏡的觀察也表明部分底棲硅藻在扇貝幼蟲完成附著變態后依然可以存活并保持良好狀態。

扇貝幼蟲的附著和變態經歷三個階段：(1)大范圍探索。在這個階段,幼蟲通常是沿直線爬行,并經常從一個地點游動到另一個地點；(2)選定大致范圍后開展小范圍探索。在這個階段,探索的步調縮短,方向改變的頻率增加；(3)最后開始在小范圍內的檢查階段。在這個階段,幼蟲在很小范圍內探索附著地點的適宜情況,在它體長范圍內移動和旋轉,幼蟲如果暫時找不到合適的附著基,就會發生變態延遲現象,長牡蠣幼蟲的變態延遲可達30d以上(Pechenik,1990)。

扇貝幼蟲在水中生活并呼吸和排泄,向水體中釋放二氧化碳和氨氮等(Luet al,1999),同時幼蟲的主要食物——單胞藻的養殖過程中,需要添加N、P等營養鹽(孫穎穎等,2006),其中總氨和亞硝酸鹽均對貝類幼蟲有毒害作用(王曄,2016),近年來開發出濃縮藻膏、藻粉等,也是為了避免將單胞藻培養液代入幼蟲培育池影響水環境穩定。而底棲硅藻的營養鹽的吸收研究表明,在其培養的前10d,能夠使培養液中的氨氮濃度顯著降低(唐棣等,2016)。本研究結果表明底棲硅藻附著基比對照組附著基早3d檢測到變態后的稚貝,底棲硅藻附著基吸收利用營養鹽和對局部微環境的改善,可能在縮短上述3個探索階段的時間,完成對附著基的選擇過程中有至關重要的導向作用。

O'Foighil等(1990)對蝦夷扇貝的研究表明,在雙殼貝類尋找附著基的過程中,匍匐期幼蟲使用足探尋適宜附著基的過程中有短暫的足攝食的過程,生物膜附著基上的稚貝殼長顯著大于普通附著基上的稚貝。這與本文對稚貝食物來源的穩定碳氮同位素結果是一致的,人工培育的扇貝幼蟲和稚貝,后期主要的餌料種類為金藻和扁藻等,因此金藻和扁藻在其食譜組成中占據了相當大的比重,底棲硅藻數量少,并且時間較短,在食譜組成中比例最低,但是從結果表明其依然承擔了部分作用,而這部分作用有可能是在扇貝附著和即將變態期間至關重要的。舊的攝食器官——面盤的退化、消失,以及新的攝食器官——鰓的長出,都需要一定的時間,這一段時間內扇貝幼蟲的營養供給至關重要。在底棲硅藻附著基上使用足進行探索和檢查的扇貝眼點幼蟲,可能會導致底棲硅藻脫落,自然脫落或者由于匍匐期幼蟲的擾動脫落的底棲硅藻可以成為幼蟲部分食物來源(Avenda?o-Herreraet al,2003),雖然其比例遠遠弱于大量投喂的單胞藻,但是在附著和變態這個異常敏感的階段,底棲硅藻附著基可能是幼蟲從面盤攝食和轉向鰓攝食中間的橋梁,這種足攝食的模式也許能夠成為面盤脫落且尚未形成穩定的鰓攝食的幼蟲或者稚貝的一個重要餌料來源。

以往的一些貝類附著和變態誘導實驗大多數采取小體積實驗(5mL培養皿(Yuet al,2010)及1000L容器(Pearceet al,1996)),本研究為大規模中試實驗,單位實驗水體體積為18m3,較大的實驗水體以及多次的重復實驗結果更有參考價值,有利于扇貝幼蟲商業化培育過程中的應用、推廣。對雙殼貝類的附著和變態的化學物質較多,化學物質的誘導并不穩定、有負面效果,并且定向性誘導差,不利于使用懸浮性附著基的扇貝幼蟲培育。相較之下,本文中使用的底棲硅藻附著基在定向性誘導方面表現良好,附苗量和變態率均較高。同時,底棲硅藻附著基也能用于其他使用懸浮性附著基進行附著和變態的貝類,如蝦夷扇貝Patinopectin yessoensis、魁蚶Anadara uropygimelana等。底棲硅藻能誘導鮑、刺參和海膽幼蟲的附著和變態,除食源誘導外,底棲硅藻的胞外產物(硅藻多糖和蛋白質等)被認為能促進多種海洋無脊椎動物幼蟲的附著和變態。這些物質能被幼蟲吸收從而誘導甲殼動物、藤壺和苔蘚蟲類的附著和變態(Kavouraset al,2000；Van Colenet al,2009),胞外產物成分復雜,底棲硅藻是否因其代謝的胞外產物對幼蟲的附著和變態造成誘導、具體的成分及其誘導的分子生物學機理等將是下一步工作的重點。

4 結論

底棲硅藻生物膜附著基對櫛孔扇貝和海灣扇貝幼蟲附著和變態具有明顯的誘導作用。底棲硅藻在幼蟲培育池的黑暗條件下不會迅速脫落影響水質,部分在幼蟲完成附著變態前依然能保持一定的豐度和良好的狀態。雖不能成為幼蟲的主要食物來源,但底棲硅藻在稚貝的食譜組成中仍具有一定的貢獻。本研究為底棲硅藻生物膜在貝類幼蟲附著變態過程中作用的研究奠定了良好的基礎,并為生態、高效的商業化苗種培育提供理論和技術支撐。