羅非魚源無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)新型AI-2信號分子受體RbsB蛋白結晶生長研究*

樊博琳 潘麗霞 王忠良 黎 源 簡紀常,3,4 王 蓓,3,4①

(1.廣東海洋大學水產學院 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室 廣東省水產經濟動物病害控制重點實驗室 湛江 524088；2.廣西科學院 南寧 536000；3.中國科學院實驗海洋生物學重點實驗室 中國科學院海洋研究所 青島266071；4.海洋生物學與生物技術功能實驗室 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 青島 266071)

無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)是一類致病性革蘭氏陽性細菌,又被稱為B群鏈球菌(group BStreptococcus,GBS)。能引起人類敗血癥、腦膜炎等疾病及多種動物鏈球菌病(Pereiraet al,2010),也是近年引起羅非魚鏈球菌病的主要病原菌。無乳鏈球菌誘發的羅非魚發病率和死亡率極高,發病率一般達20%—30%,發病魚死亡率達95%以上,嚴重影響了我國羅非魚養殖業的經濟效益(盧邁新等,2010)。

AI-2信號分子受體(呋喃酰硼酸二酯受體,Furanosyl borate diester receptor)在細菌識別和感知周圍環境變化,并做出適應性反應(細菌密度感應系統,Quor-um sensing,QS)的過程中發揮著重要的作用(Bassleret al,2006；馬艷平等,2013)。迄今為止,研究者們已從遺傳學、生物化學和生物信息學三個層面鑒定出了兩種AI-2特異性表面結合受體(Chenet al,2002；Milleret al,2004),分別為 LuxP蛋白和 LsrB蛋白(Pereiraet al,2013)。然而,研究發現并不是所有細菌均存在以上兩類受體蛋白。那么在其他種類的細菌中,由誰來擔當AI-2信號分子受體呢？近年來,科學家們展開了一系列研究,Armbruster等(2010)在分析伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitan)和流感嗜血桿菌(Haemophilusin fluenzae)全基因組序列時,發現了一種被稱作核糖結合蛋白B(Ribose binding protein B,RbsB)的可溶性細胞周質蛋白家族成員,它們與大腸桿菌(Escherichia coli)LsrB蛋白的核酸和氨基酸序列同源性分別達到了86%和76%,且與LsrB蛋白一樣,具有由L-S-G-G-Q氨基酸殘基組成的高親和力蛋白特征性模Walker C(Armbrusteret al,2010)。Armbruster及其團隊通過體外人工補充AI-2分子,構建luxS和rbsB基因缺失株,獲得了流感嗜血桿菌生物膜形成表型的正負反饋調控的實驗證據。綜上所述,推測RbsB可能是一種新型的細菌 AI-2信號分子受體,并在AI-2介導的QS系統中單獨或與LsrB和LuxP經典受體共同發揮作用(Armbrusteret al,2009,2010,2011)。

研究AI-2信號分子介導的細菌密度感應系統對于了解無乳鏈球菌毒力因子調控、生物膜結構穩定性及抗藥性產生等生物學效應具有重要的意義,也是尋找新型藥物靶標的重要理論基礎(馬艷平等,2013)。本研究以期獲得無乳鏈球菌RbsB具有AI-2信號受體功能的可靠證據,并開展對RbsB的AI-2分子受體功能分析及作用機制研究,旨在為開發羅非魚無乳鏈球菌病的新型抗菌候選藥物提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚源無乳鏈球菌強毒株(S.agalactiae)ZQ 0910(中國微生物菌種保藏中心保藏編號為CGMCC 7.264)由本實驗室分離保存；大腸桿菌表達菌株 BL 21(DE3)與pGEX-6P-1載體均為本實驗室保存；限制性核酸內切酶BamHI和XhoI,克隆載體pMD18-T,ExTaq DNA聚合酶,T4 Ligase購買自寶生物工程有限公司(大連)；質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和PierceTMHRV 3C Protease Solution Kit購買自賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific)公司；引物、氨芐青霉素(Ampicillin)、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)買自生工生物工程有限公司(廣州)；考馬斯亮藍快速染液購買自全式金生物技術有限公司(北京),NeXtal Tubes JCSG Core Suite I,II,III,IV為德國QIAGEN產品。

1.2 方法

1.2.1 提取細菌基因組DNA及擴增RbsB基因 提取無乳鏈球菌基因組DNA,根據GenBank上已登錄的RbsB基因序列(GenBankAccession：AP018935.1)設計特異性引物RbsBF/RbsBR,引入酶切位點BamHI和XhoI,引物由生工生物工程(廣州)有限公司合成。

反應條件為：94°C 預變性 5min,94°C 30s,60°C 30s,72°C 90s,共30個循環,72°C再延伸10min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物后再切膠回收,連接入pMD18-T載體,菌落PCR鑒定后將陽性克隆送生工生物工程股份有限公司(廣州)測序。

1.2.2 構建重組質粒載體及誘導表達融合蛋白PCR擴增產物經純化試劑盒純化回收后用BamHI和XhoI限制性內切酶進行雙酶切,對目的條帶進行切膠回收后定向插入經BamHI和XhoI內切酶雙酶切的pGEX-6P-1質粒載體中,構建重組質粒pGEX-6p-1-RbsB轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中,涂布于Amp+的LB瓊脂平板,37°C條件下培養12h,從平板挑取單菌落于Amp+的LB液體培養基中,37°C、220r/min培養1h,提取重組質粒送至測序(廣州生工)測序正確后,進行菌落PCR鑒定和雙酶切檢測,檢測正確后接種于新鮮的Amp+的 LB液體培養基(比例 1∶100)中,37°C繼續震蕩培養,至 OD600值達到0.6—0.8,加IPTG(終濃度為0.2mmol/L)進行誘導表達。

1.2.3 重組融合蛋白表達條件的優化 將鑒定正確的表達菌接種到 2mL Amp+的LB液體培養基中,加入IPTG進行誘導(終濃度為0.2mmol/L),選擇16°C、30°C、37°C 三個溫度條件下 220r/min 振蕩培養4h后離心收集菌體沉淀。經超聲波破碎離心后分別取樣品上清液和菌體沉淀(溶于尿素中)并進行3個相同條件的重復組,用SDS-PAGE電泳分析目的蛋白表達的最佳條件。

1.2.4 RbsB蛋白純化及鑒定 大量表達pGEX-6P-1-RbsB重組融合蛋白,離心收集菌體沉淀后用Equilibration Buffer(50mmol/L Tris-HCl,150mmol/L NaCl,10%glycerol pH 8.0)溶液混懸,超聲波破碎并高速離心制備菌體上清。取3mL谷胱甘肽瓊脂糖樹脂(Glutathione Sepharose 4B)加入到5mL層析柱中,層析柱與DH電腦恒流泵和HUXI紫外檢測儀連接。使用50mL GST Equilibration Buffer平衡層析柱30min,加入制備好的菌體上清,使菌體上清與谷胱甘肽瓊脂糖樹脂靜置結合30min,使用GST Elution Buffer(50mmol/L Tris-HCl,150mmol/L NaCl,15mmol/L reduced glutathione pH 8.0)洗脫液進行洗脫,根據紫外顯示儀數字變化(波長為A280nm)收集洗脫液,收集原始菌體上清液,流穿液,洗脫液進行SDS-PAGE電泳。

1.2.5 切除融合表達蛋白GST標簽 使用超濾濃縮管(Milipore)(10kDa)濃縮收集到的蛋白洗脫液后,用PierceTMHRV 3C Protease Solution Kit試劑盒進行切除GST標簽,純化后的重組蛋白2900μL中加入HRV 3C Protease 100μL,4°C 冷藏過夜。用 AKTATMpurifier全自動層析儀根據分子量大小不同分離GST標簽與Rbsb蛋白,收集洗脫峰對應樣品,用SDSPAGE進行檢測并采用蛋白定量試劑盒進行定量檢測。

1.2.6RbsB基因序列分析 通過使用DNAMAN程序獲得RbsB推導氨基酸序列；使用ExPASy(http：//expasy.org/tools/)網址進行RbsB蛋白質理化性質分析；使用Softberry程序對氨基酸功能位點進行分析；使用signalIP4.0預測信號肽位置及剪切位點；使 用 InterProScan 程 序(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)進行結構域預測；使用(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)網址進行蛋白二級結構預測,并通過圓二色譜實驗對預測結果進行驗證(實驗在持續氮氣流的作用下,對樣品的圓二色譜變化進行測定,掃描波長范圍在200—260nm之間,比色皿的光程為0.5cm,掃描速度為50nm/min,進行3次重復掃描)；使用SWISS-MODEL在線軟件(http：//www.expasy.org/)對RbsB蛋白3D三級結構進行預測。

1.2.7 RbsB蛋白的結晶條件篩選 將RbsB蛋白分別濃縮到10mg/mL、20mg/mL和40mg/mL,利用NeXtal Tubes JCSG Core Suite(I,II,III,IV)蛋白結晶條件篩選試劑盒,共384個結晶條件。對RbsB蛋白通過坐滴氣相擴散法進行結晶條件的初步篩選,將RbsB蛋白溶液與池液在晶體板的樣品槽內1∶1等比例混合,用封膜密封,置于16°C恒溫室中,每3天通過顯微鏡觀察蛋白液滴內晶體的生長情況。

2 結果

2.1 擴增 RbsB基因片段以及構建可溶性表達載體

以無乳鏈球菌基因組DNA為模板,用帶酶切位點的引物擴增后,獲得一大小約為 969bp的目的條帶(圖1),與預期相符。將測序正確的重組質粒用限制性核酸內切酶BamHI和XhoI進行雙酶切,圖2中泳道片段大小分別約為5000bp和969bp,測序結果表明重組質粒構建成功。

2.2 RbsB蛋白的表達條件優化

從圖3中可以看出,在保證其他實驗條件相同情況下,不同溫度誘導融合蛋白的表達量和可溶性分析表明37°C條件下RbsB全菌蛋白表達量高于16°C和30°C的表達量；在沉淀中的融合蛋白表達量顯著低于在上清中的表達量。進行3個重復組結果均一致,故該融合蛋白最佳誘導溫度是37°C,并選擇在上清中進行純化。

圖1 無乳鏈球菌RbsB基因的克隆Fig.1 Cloning of RbsB gene from S.agalactiae

圖2 重組質粒pGEX-6p-1-RbsB的酶切鑒定Fig.2 The result of pGEX-6p-1-RbsB digested by BamHI and XhoI

2.3 RbsB蛋白的純化及鑒定

將pGEX-6P-1-RbsB質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中,經優化條件(0.2mmol/L IPTG,4h,37°C)誘導后,根據紫外顯示儀數字變化在第二個峰值處(波長為A280nm)收集洗脫液(圖4)。分別取上清液、流穿液、洗脫液進行SDS-PAGE電泳鑒定。結果表明,經過純化后可以得到含量較高的融合蛋白(10.464mg/mL),且在59ku處有一條明顯蛋白條帶(圖5),與預期相符。

2.4 切除融合蛋白GST標簽

將收集到的洗脫液濃縮至3mL,用試劑盒進行切除GST標簽工作,經谷胱甘肽瓊脂糖樹脂(Glutathione Sepharose 4B)純化后收集3管洗脫液,分別與HRV 3C Protease過夜反應,SDS-PAGE電泳結果表明,本研究成功將GST標簽從融合蛋白成除,分別得到GST標簽蛋白(26ku)和RbsB蛋白(33ku)。

圖3 不同溫度誘導表達的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expression of the Rbsb fusion protein at different temperatures

圖4 紫外吸收圖譜Fig.4 The ultraviolet absorption spectrum

圖5 重組蛋白GST-RbsB純化后的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified GST-RbsB

2.5 分子篩分離RbsB蛋白

將收集到的3管融合蛋白與HRV 3C Protease過夜反應上清濃縮至2mL,使用AKTATMpurifier全自動層析儀,根據分子量大小不同徹底分離GST-tag與RbsB蛋白,根據全自動層析儀電腦操作頁面數據變化顯示,選取峰值處10管進行SDS-PAGE鑒定。結果顯示第1—6管為RbsB蛋白(33ku),第7—10管為GST-tag(26ku)與融合蛋白(59ku)混合液,分子量大小正確(圖7)。

圖6 GST-Rbsb融合蛋白純化及切除GST標簽Fig.6 Purity of GST-Rbsb fusion protein excision of GST-tag

2.6 RbsB基因序列分析

RbsB基因(GenBank Accession：AP018935.1)全長969bp,可編碼322個氨基酸,ProtParam分析RbsB推導氨基酸序列,RbsB蛋白理論分子量33.9ku,等電點為9.41,其中丙氨酸(Ala)含量最高為13.4%,賴氨酸(Lys)其次為11.8%。其中帶正電荷的氨基酸有42個,帶負電荷的氨基酸有31個。SoftBerry-Psite預測該序列功能位點,發現該序列有N-糖基化位點4個,cAMP-和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點1個,蛋白激酶C磷酸化位點5個,酪蛋白激酶II磷酸化位點2個,N-豆蔻酰化位點8個,酰胺化位點3個,原核膜脂蛋白脂質附著部位1個,微生物C末端靶向信號7個。signalIP4.0預測RbsB存在信號肽,1—24為信號肽區域,其中信號肽剪切位點在24—25氨基酸之間。

圖7 使用AKTATMpurifier切除GST標簽后RbsB蛋白的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of single RbsB protein using AKTATMpurifier

2.7 RbsB蛋白二級結構預測與驗證

分析RbsB的二級結構,從RbsB蛋白二級結構預測圖(圖9)中可以看出RbsB蛋白的二級結構有：α-螺旋(46.27%)、無規卷曲(38.15%)、β-折疊(15.22%)。蛋白質二級結構的變化情況可以用圓二色譜實驗結果來說明,已知α-螺旋構象的CD譜在222nm、208nm處呈負峰,在190nm附近有一正峰。結果顯示所測二級結構具有明顯的α螺旋結構且所占比重最高,與預測結果一致。

2.8 RbsB蛋白三級結構預測

用InterProScan程序分析預測結構域得在氨基酸50—300間有一結構域,為周質結合蛋白區域。采用在線SWISS-MODEL程序對RbsB蛋白同源建模,建模結果如圖11所示,其中三維圖是以2joy.1.A為模版,分別利用無乳鏈球菌ZQ0910菌株RbsB和大腸桿菌核糖結合蛋白A氨基酸序列49—318區域構建的三維結構,相似性達到47.78%。

2.9 RbsB蛋白結晶條件初篩

通過蛋白質結晶條件篩選試劑盒NeXtal Tubes JCSG Core(I,II,III,IV)共計384個條件對RbsB蛋白進行了結晶條件的初步篩選。如圖12所示,在NeXtal Tubes JCSG Core Suite III(0.2mol/L di-Potassium hydrogen phosphate,20%(W/V)PEG3350)和NeXtal TubesJCSG CoreSuite IV(1.5mol/L ammonium sulfate,25%(V/V)Glycerol)條件下有晶體長出,該晶體呈棱柱狀較為規整,對應于圖12中a、b,提示有希望進一步優化獲得可衍射的晶體。

3 討論

尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)不但肉質鮮嫩,而且具有生長快、環境適應力強等優點,受到了國內外養殖戶的青睞。但是近年隨著養殖規模的不斷擴大,養殖環境的持續惡化,鏈球菌病的大規模暴發,嚴重影響了我國國內尼羅羅非魚養殖業的發展(張新艷等,2008；黃錦爐,2012)。羅非魚鏈球菌病(Streptococcosis)具有高溫好發、傳染性高和死亡率高的特點,其從屬于細菌性疾病。在世界范圍內其病原主要為無乳鏈球菌(S.agalactiae)和海豚鏈球菌(S.iniae),無乳鏈球菌(S.agalactiae)是我國南方地區鏈球菌病的主要病原菌(王蓓等,2013)。研究AI-2信號分子介導的細菌密度感應系統對于了解無乳鏈球菌毒力因子調控、生物膜結構穩定性及抗藥性產生等生物學效應具有重要意義。本研究將對探索RbsB分子作為“第3類”AI-2信號分子受體提供直接證據。

獲得晶體的前提條件是得到純度好、濃度高的可溶性蛋白,因此在表達載體和表達菌株的選擇上,我們采用了可溶表達性更高的pGEX-6P-1載體,并采用大腸桿菌BL21作為表達菌株。pGEX-6P-1表達載體自帶 GST融合標簽,具有一定的溶解度在大腸桿菌中,同時還參與了體系中二硫鍵還原等過程,為后續蛋白質的純化與鑒定提供了方便(Mainaet al,1988；Sharrocks,1994)。重組蛋白用大腸桿菌BL21(DE3)表達有兩種形式；一種表達形式是以包涵體出現,另外一種是可溶性表達,即重組蛋白存在于上清中。經過SDS-PAGE實驗驗證3組重復試驗均顯示在上清中表達量明顯高于在包涵體中的表達量,故實驗選擇在上清中表達利于后續蛋白純化工作,獲得有活性的RbsB蛋白。

圖8 RbsB基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列和功能位點Fig.8 Open reading frame and deduced amino acid sequences of RbsB gene

重組融合蛋白的表達水平不僅與宿主和表達載體有關,也和誘導條件有著密切的關系(Sharrocks,1994)。其中一個重要的影響條件是誘導溫度,在誘導過程中溫度會影響氧的溶解度快慢、并對酶的反應速率造成加快或減慢,進而影響蛋白的活性。本實驗通過固定其他因子,對單個因子溫度進行16°C、30°C、37°C三個條件進行誘導,經SDS-PAGE驗證37°C表達量最佳。為了降低誘導劑IPTG對大腸桿菌代謝的毒性作用,用終濃度為0.2mmol/L的IPTG誘導蛋白表達,誘導時間為4h,用Glutathione Sepharose 4B親和樹脂純化重組蛋白,結果測得在上清中取得了10.464mg/mL較高的重組蛋白表達量。使用PierceTMHRV 3C Protease切掉GST-tag然后經AKTATMpurifier全自動層析儀按分子量大小將Rbsb蛋白與GST-tag分離開。SDS-PAGE檢測表觀徹底將RbsB蛋白與GST-tag分離開,成功獲取到純度很高的RbsB蛋白。

圖9 無乳鏈球菌RbsB蛋白二級結構預測Fig.9 Predicted secondary structure of RbsB protein

圖10 圓二色譜測RbsB蛋白二級結構Fig.10 Determination of secondary structure of RbsB protein by circular dichroism

圖11 無乳鏈球菌RbsB蛋白(a)與大腸桿菌周質糖結合蛋白A(b)蛋白三維結構預測圖Fig.11 Three-dimensional structure prediction

圖12 RbsB蛋白結晶體Fig.12 The crystallization of RbsB protein

生物信息學是研究基因組學和蛋白質組學的重要工具,是一門檢索、儲存并分析生物信息的科學,它將信息技術應用到了生命科學領域。本研究對RbsB蛋白進行了一系列基因序列分析包括；蛋白質理化性質分析；氨基酸功能位點進行分析；預測信號肽位置及剪切位點；預測結構域；進行蛋白二級結構和蛋白3D三級結構預測等工作。通過氨基酸功能位點分析可知蛋白激酶C磷酸化位點5個,N-豆蔻酰化位點8個以及微生物C末端靶向信號7個(數量最多)蛋白激酶C能作用于細胞核中的轉錄因子,能激活細胞質中的靶酶參與生化反應的調控,參與細胞生長和分化相關的基因表達的調控(周小東等,2013)；而N-豆蔻酰化位點和微生物C末端靶向信號位點也在信號轉導中起著重要作用,更為驗證了RbsB可能是一種新型的細菌AI-2信號分子受體,并在AI-2介導的QS系統中單獨或與LsrB和LuxP經典受體共同發揮作用這一推測。通過二級結構預測和圓二色譜實驗發現α螺旋結構所占比重最高,而α螺旋結構是蛋白質構象中最穩定的一種結構,不論是長鏈還是短鏈,也不論α螺旋相互作用是強還是弱,一旦螺旋結構形成,在拉伸過程中都能保持α螺旋結構的穩定性,這無疑為后續蛋白晶體優化實驗提供了保證。

20世紀70年代初期,中國科學工作者測定了亞洲地區第一個蛋白質晶體結構-豬胰島素三方二鋅晶體結構,成為中國結構生物學歷史發展的起點,進入新世紀后該學科更是展現出快速發展姿態(王大成,2014)。本研究利用蛋白質結晶試劑盒NeXtal Tubes JCSG Core(I,II,III,IV)共計384個條件篩選出了兩個可形成柱狀晶體的條件,從結晶篩選條件和晶體外觀可判斷出這些晶體應為蛋白晶體,說明RbsB蛋白具備可結晶性。柱狀蛋白晶體相比較針狀蛋白晶體來說,其通常衍射能力較強,可以滿足后期收集較高分辨率數據的需要。對于單顆晶體,我們也經常可以對采用多點收集以及螺旋收集(helical collection)的方法來獲得更好的數據質量與分辨率(閆創業,2014)。為了能夠得到良好的衍射數據,我們擬在后續實驗中,以上述篩選到的結晶條件為基礎,繼續優化結晶條件,以提升獲得可用于衍射數據收集的高質量RbsB晶體的概率,關于RbsB蛋白晶體,我們將從功能位點進行分析并輔以細菌表型的研究從而確認其受體功能,旨在為尋找新型藥物靶標的重要理論基礎。

4 結論

本研究成功克隆RbsB基因,該基因全長969堿基,編碼322個氨基酸,二級結構中α螺旋結構所占比重最高,RbsB蛋白理論分子量33.9ku,篩選到RbsB蛋白的初始結晶條件為：0.2mol/L di-Potassium hydrogen phosphate,20%(W/V)PEG3350；1.5mol/L ammonium sulfate,25%(V/V)Glycerol),獲得RbsB蛋白結晶體。本研究結果可為無乳鏈球菌核糖結合蛋白(RbsB)的功能解析提供實驗及理論基礎,將從功能位點進行分析并輔以細菌表型的研究從而確認其受體功能,旨在為尋找新型藥物靶標的重要理論基礎。