響應面法優化紅曲調味酒的發酵條件

董彩文，王雪純，李一晴，汪雪蓮，楊曉磊，胡曉龍*

(1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，鄭州 450002；2.河南省食品生產與安全協同創新中心，鄭州 450002；3.長葛市頤恒健蜂業有限公司，河南 長葛 461502；4.許昌市蜂蜜發酵工程技術研究中心，河南 長葛 461502)

紅曲米是曲霉科真菌屬紅曲霉的菌絲體附著寄生在糯米中，并且以秈稻和粳稻等為原料發酵而成，紅曲米具有許多十分重要的藥用功能，例如：降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗癌等多種重要功效[1,2]。紅曲調味酒以蜂蜜為原料，將蜂蜜的營養功能和酒的保健功能集為一體，所以對其進行開發更具有特色和一定的商業價值[3]。紅曲已經在調味品中得到應用[4]，同時已經建立了紅曲釀造料酒的相關標準[5]。本研究的紅曲調味酒則是在蜂蜜發酵的基礎上，在釀酒的過程中利用紅曲米和酵母進行發酵。在發酵過程中，紅曲米中的多種活性物質溶解于酒中，可以加強營養保健功能[6]；同時，與傳統的料酒工藝相比[7]，省去了浸米、蒸米、淋飯等復雜操作，更容易實現工業化和連續化生產。高級醇是酒精發酵過程中產生的副產物，其含量高低對調味酒的香氣和品質有很大影響，是評價酒品質的重要指標之一[8]。

通過單因素試驗確定pH、培養時間、溫度、氮源、糖濃度等對紅曲調味酒中高級醇含量的影響；然后通過響應面優化試驗確定釀造紅曲調味酒的最佳條件[9,10]。

1 材料與方法

1.1 材料

蜂蜜：棗花蜜，購自長葛市；紅曲米：購自福建古田；釀酒高活性酵母：購自安琪公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

蜂蜜→稀釋→調酸→加熱滅菌→冷卻→接入酵母(加磷酸氫二銨)→發酵→分離原酒→調整成分→過濾→裝瓶→滅菌→冷卻→成品。

1.2.2 高級醇的測定

1.2.2.1 標準曲線的制作

取6支干凈的比色管，編號依次為0～5。在6支比色管中依次分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL高級醇標準使用液，加水定容至2.0 mL，搖勻后置于冰水浴中，沿管壁緩慢加入4 mL 0.5%對二氨基苯甲醛濃硫酸溶液，將各比色管同時搖勻后蓋塞，置于沸水浴中精確計時加熱15 min后取出迅速放于冰水中冷卻，加水定容至10 mL搖勻后，用1 mL比色皿以0號管作為對照，于520 nm波長下測定OD值。以OD值為縱坐標，高級醇含量為橫坐標，繪制高級醇標準曲線。

1.2.2.2 發酵液中高級醇的測定

在空白對照組中加入2 mL蒸餾水，其余試驗組中加入1.5 mL蒸餾水、0.5 mL樣液。在冰水浴中加入0.5%對二氨基苯甲醛濃硫酸溶液4 mL，隨后放入80 ℃的水浴中15 min。取出后加入4 mL的蒸餾水混勻，用分光光度計測量OD值。根據標準曲線方程，計算高級醇含量。

1.2.3 紅曲調味酒發酵溫度試驗

配制的蜂蜜水糖度為16%，pH調整為4.5，紅曲米的添加量為10 g，釀酒高活性酵母的添加量為0.5 g。將溫度梯度設置為24，26，28，30，32 ℃，每個溫度包含2瓶樣品作為平行試驗，培養時間為3 d。培養結束后離心，取上清液蒸餾，進行高級醇的測定。

1.2.4 紅曲調味酒發酵pH試驗

配制的蜂蜜水糖度為16%，培養溫度為28 ℃，每瓶250 mL。紅曲米的添加量為10 g，釀酒高活性酵母的添加量為0.5 g。將pH梯度設置為3.5，4，4.5，5，5.5，每個pH包含2瓶樣品作為平行試驗，培養時間為3 d。培養結束后離心，取上清液蒸餾，進行高級醇的測定。

1.2.5 紅曲調味酒發酵培養時間試驗

配制的蜂蜜水糖度為22%，pH調整為4.5，每瓶250 mL。紅曲米的添加量為10 g，釀酒高活性酵母的添加量為0.5 g，將培養時間梯度設置為3，4，5，6，7 d，每個培養時間梯度下包含2瓶樣品作為平行試驗，培養結束后離心，取上清液蒸餾，進行高級醇的測定。

1.2.6 紅曲調味酒發酵氮源添加量試驗

配制的蜂蜜水糖度為22%，pH調整為4.5，每瓶250 mL。紅曲米的添加量為10 g，釀酒高活性酵母的添加量為0.5 g，發酵時間為5 d。將氮源添加量梯度設置為300，600，900，1200，1500 mg/L，每個氮源添加量梯度下包含2瓶樣品作為平行試驗。培養結束后離心，取上清液蒸餾，進行高級醇的測定。

1.2.7 紅曲調味酒發酵糖濃度試驗

配制的蜂蜜水pH為4.5，每瓶250 mL。紅曲米的添加量為10 g，釀酒高活性酵母的添加量為0.5 g，磷酸氫二銨添加量為900 mg/L，培養時間為5 d。將糖濃度梯度設置為16%、20%、24%、28%、32%，每個糖濃度梯度下包含2瓶樣品作為平行試驗。培養結束后離心，取上清液蒸餾，進行高級醇的測定。

1.2.8 方差分析軟件分析單變量單因素的顯著性

采用方差分析方法對由各個因素得到的試驗結果進行顯著性檢驗。分析得到的結果中，顯著的兩個單變量之間用不同的字母表示,不顯著的兩個單變量之間用相同的字母表示。

1.2.9 響應面優化

根據單因素試驗的結果，對紅曲調味酒發酵影響較大的因素進行響應面優化，試驗的因素水平見表1。

表1 試驗因素及水平Table 1 Experimental factors and levels

2 結果與分析

2.1 高級醇標準曲線的繪制

按照高級醇標準曲線的步驟得到的標準曲線見圖1。

圖1 高級醇標準曲線Fig.1 Standard curve of higher alcohols

由圖1可知，R2值達到0.99，說明擬合的試驗結果準確率較高。通過該回歸曲線得到的高級醇含量結果較為準確。

2.2 發酵溫度對紅曲調味酒高級醇的影響結果

圖2 溫度對高級醇的影響Fig.2 Effect of temperature on higher alcohols

由圖2可知，高級醇的含量先呈現下降的趨勢，在28 ℃時達到最低值，隨后高級醇的含量又有緩慢的回升，但是差別不顯著。

2.3 pH對紅曲調味酒高級醇的影響結果

圖3 pH對高級醇的影響Fig.3 Effect of pH on higher alcohols

由圖3可知，高級醇含量隨著pH的上升先上升后下降，在pH達到5以后，高級醇含量趨于平衡。

2.4 培養時間對紅曲調味酒高級醇的影響結果

圖4 培養時間對高級醇的影響Fig.4 Effect of culture time on higher alcohols

由圖4可知，高級醇含量隨著培養時間的增加而增加，超過5 d以后增加明顯。

2.5 氮源添加量對紅曲調味酒高級醇的影響結果

圖5 氮源添加量對高級醇的影響Fig.5 Effect of nitrogen source additive amount on higher alcohols

由圖5可知，磷酸氫二銨濃度的變化對高級醇的生成影響不明顯。方差分析結果顯示：磷酸氫二銨濃度為300，600，900，1200 mg/L 時，4個試驗組無顯著性差異。說明在此范圍內，磷酸氫二銨濃度對高級醇的生成影響不大。當磷酸氫二銨濃度達到1500 mg/L時，高級醇的生成顯著降低。

2.6 糖濃度對紅曲調味酒高級醇的影響結果

圖6 糖濃度對高級醇的影響Fig.6 Effect of sugar concentration on higher alcohols

由圖6可知，糖濃度為16%時，高級醇含量達到最高值。隨著糖濃度增加，高級醇含量減少。

2.7 響應面優化結果

其中高級醇的回歸方程為：

Y=43.16+0.44A-1.6B-26.49C+7.1AB-2.17AC-6.7BC+10.66A2+1.43B2+20.51C2，方程中每項字母前系數的正負代表Y值的影響是正相關還是負相關。

表2 試驗設計及其結果Table 2 Experimental design and results

表3 高級醇回歸方程方差分析結果Table 3 Results of variance analysis of higher alcohols regression equations

注：“****”為差異極顯著(P<0.0001)；“***”為差異高度顯著(P<0.01)；“**”為差異顯著(P<0.05)；“*”為差異不顯著(P>0.05)。

由表3可知，由于模型的P值<0.01，說明該模型高度顯著。回歸方程的回歸系數>0.9049，說明約有90.49%高級醇含量的變化率可以用該模型來解釋。對糖度、磷酸氫二銨添加量和培養時間進行分析，發現培養時間的P值<0.0001，說明培養時間對高級醇的影響是極顯著的。糖度的P值=0.8654>0.05，說明糖度對高級醇變化率的影響是不顯著的。磷酸氫二銨的P值=0.5405>0.05，說明磷酸氫二銨對高級醇變化率的影響是不顯著的。但是該模型總體對高級醇變化率的影響是高度顯著的。在對二次項的分析中，發現糖濃度的P值=0.0171<0.05，磷酸氫二銨添加量的P值=0.6886>0.05，培養時間的P值=0.0006<0.01，分別說明糖濃度對高級醇變化率的影響是顯著的，磷酸氫二銨添加量對高級醇變化率的影響是不顯著的，培養時間對高級醇變化率的影響是高度顯著的。在交互項中，AB、AC、BC的P值均大于0.05，說明交互項對高級醇變化率的影響是不顯著的。綜合以上分析表明，回歸方程為高級醇的變化率提供了一個較為合適的模型。

2.8 驗證試驗結果

軟件分析給出的試驗條件及結果為：當糖濃度為25.45%、磷酸氫二銨添加量為1000 mg/L、培養時間為6 d時理論的高級醇含量為28.78 mg/L。為了驗證該模型給出的方案是否與實際情況相符合，進行2次平行驗證試驗，但是從實際情況考慮，高級醇的驗證條件調整為：糖度為25.4%，磷酸氫二銨添加量為1000 mg/L，培養時間為6 d。高級醇的驗證試驗中實際測得的高級醇平均值為28.6 mg/L，與理論值的相對誤差為0.6%，說明該模型能較好地反映實際情況。

3 結論

通過單因素試驗和響應面優化試驗方法考察了培養溫度、pH、培養時間、氮源添加量、糖濃度等因素對高級醇含量的影響。結果表明：培養時間對紅曲調味酒釀造過程的影響較大，其次是糖濃度的影響。通過響應面優化和驗證試驗得到的高級醇的優化方案為：培養溫度為28 ℃，培養液pH為5，紅曲米添加量為4%，酵母添加量為0.2%，糖濃度為25.4%，磷酸氫二銨添加量為1000 mg/L，培養時間為6 d。