兩段式發酵法中曬露階段醬醪理化情況的研究

董亮,張晶,葉碧霞,左勇*

(1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 自貢 643000;2.重慶大學 生物工程學院，重慶 400030)

甜面醬是以面粉作為原料，經蒸煮糊化后，人工接種曲種(常用滬釀3.042)制曲[1]，再拌入適量鹽水進行發酵而成的半固態調味品。甜面醬的生產方式主要是基于拌鹽水后發酵方式的不同進行劃分，常用的發酵方式有自然曬露發酵方式和人工保溫發酵[2,3]。根據目前生產實際的情況，現有的兩種生產方式各有優缺點，前者傳統自然曬露發酵生產的甜面醬色澤鮮亮、香氣濃郁、滋味鮮甜咸適宜，但因其發酵過程中始終依靠外界環境的溫度促使發酵，整個發酵過程緩慢進行，原料降解緩慢，從而使得發酵周期較長，通常需1年以上成熟，影響企業的產能提升。而保溫發酵通過控制發酵溫度，使得原料快速降解，發酵周期短，但該方式生產的甜面醬成品色澤較淡，酯香與醬香不夠協調，同時醬體較稀，成品質量不足以媲美傳統自然曬露發酵所生產的甜面醬[4]。基于現有的兩種生產方式所提出的兩段式發酵法即先保溫發酵后自然曬露發酵的生產方式在面醬的生產應用上具有一定前景[5,6]。甜面醬制曲優勢微生物主要為霉菌，其在制曲階段大量繁殖并分泌各種酶類，如淀粉酶、蛋白酶等，多種酶類共同作用分解原料中的淀粉和蛋白質，形成的小分子糖類、多肽及氨基酸進一步參與各種化學反應促使甜面醬成色、生香以及構成甜面醬的獨特滋味[7-10]。

目前，對于兩段式發酵技術的深入研究鮮有報道。基于前期對兩段式發酵法的初步研究結果表明，保溫階段主要為大分子糖類及蛋白質的快速降解。保溫20～40 d后則可結束保溫發酵，進入下一階段即自然曬露階段發酵。本研究以前期保溫發酵后再進行自然曬露發酵的甜面醬作為研究對象，研究甜面醬后期自然曬露過程中理化指標的變化情況，并結合曬露過程中醬體感官形態的變化情況，以確定甜面醬兩段式發酵成熟的生產周期，以期為甜面醬后期曬露發酵工藝的改善提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

取分別保溫發酵20，25，30，35，40 d后的甜面醬進行曬露階段的研究，樣品分別編號為1，2，3，4，5。以各自曬露開始時間計為0，取樣時間設置為0，5，8，14，22，34，49，68 d。

工藝流程：面粉、水→拌和→蒸煮→冷卻→接種(曲精)→制曲→拌鹽水→保溫發酵(一定時間)→一次磨醬→曬露發酵→二次磨醬→檢驗→包裝。

1.2 儀器

T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；pHS-3C酸度計 奧豪斯儀器(上海)有限公司；HH-S恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市正基儀器有限公司；臺式高速微量離心機 大龍創新試驗儀器(北京)有限公司。

2 試驗方法

2.1 理化值的測定

總酸及氨基酸態氮的測定：采用直接滴定和甲醛滴定法；還原糖含量的測定：采用斐林法[11]。

2.2 酶活力的測定

淀粉酶活力的測定：采用碘量法[12]；中性和酸性蛋白酶活力的測定：依據國標法測定[13]。

2.3 感官形態記錄

依據標準SB/T 10296-2009要求，感官形態記錄涵蓋甜面醬的色澤、香氣、滋味與體態。

2.4 數據分析與處理

試驗數據均采用SPSS 19.0軟件進行分析，采用Duncans新復極差法進行多重比較[14]。在0.05水平上檢驗試驗結果的差異顯著性，試驗結果利用Origin作圖。

3 結果與分析

3.1 甜面醬曬露階段總酸及pH的變化情況

甜面醬中酸度主要源自微生物發酵產生的有機酸、氨基酸等[15]。有機酸是酯類物質生成的基礎底物，適量的有機酸生成對面醬的呈香具有重要作用，但過量的有機酸會嚴重影響甜面醬的風味的品質[16]。評價甜面醬的質量通常依據標準SB/T 10296-2009所規定的指標進行，其中甜面醬的感官特性中關于滋味的描述中，明確要求無酸味。故甜面醬發酵過程中，需要嚴格控制醬醪酸度，因而通過測定醬醪酸度變化情況反映發酵狀況。經保溫發酵一定時間的甜面醬，采用陶質瓦缸(缸口加一不銹鋼篩蓋)盛裝，置于室外開放環境下，進行日曬夜露發酵，定期進行翻醅處理。

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注：誤差線代表標準偏差(n=3)；不同小寫字母表示總酸含量差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示pH值差異顯著(P<0.05)；a～e分別代表1～5號樣品在曬露階段的總酸與pH變化情況。

由圖1中a可知，經保溫發酵20 d再進行曬露發酵的甜面醬，在曬露階段，醬醪中總酸含量先上升后趨于平穩，pH值隨著發酵的進行逐漸降低。0～22 d，甜面醬總酸含量逐漸上升(P<0.05)，從1.5%上升到1.85%，22 d后總酸含量上升趨勢減緩，曬露發酵68天時，醬醪中總酸含量達到1.97%。pH值則由曬露初期的4.75下降到曬露后期的3.7。

由圖1中b可知，經保溫發酵25 d再進行曬露發酵的甜面醬，在曬露階段，醬醪中總酸含量逐漸增加，pH值則逐漸降低。醬醪總酸含量從1.46%增加到1.68%；pH值從4.78下降為4.02。

由圖1中c可知，經保溫發酵30 d再進行曬露發酵的甜面醬，在曬露階段，醬醪中總酸含量逐漸上升，pH值隨之降低。醬醪總酸含量由1.48%上升至2.13%，該階段總酸含量增加了0.65%。pH值從4.33降低到3.65。

由圖1中d可知，經保溫發酵35 d再進行曬露發酵的甜面醬，在曬露階段，醬醪中總酸含量隨著曬露時間的延長而增加，pH值則逐漸下降。總酸含量由1.61%上升到2.05%。醬醪pH值由4.12下降到3.7，降低趨勢較緩慢。

由圖1中e可知，經保溫發酵40 d再進行曬露發酵的甜面醬，在曬露階段，醬醪中總酸含量呈上升趨勢，pH值則相應下降。總酸含量從1.69%迅速上升為2.25%(P<0.05)，該階段總酸含量增加了0.56%；醬醪的pH值則由4降低為3.6。

圖1結果表明，兩段式發酵甜面醬曬露階段，醬醪中總酸含量逐漸增加，pH值相應降低。分析造成酸度逐漸上升的原因有：曬露階段，環境中微生物進入醬醪，微生物發酵產酸以及原料中蛋白質水解生成的氨基酸會造成醬醪中總酸含量逐漸上升。曬露發酵68 d后的甜面醬中總酸含量最低的是2號樣品，約為1.68%，pH值為4.02；總酸含量最高是5號樣品，約為2.25%，pH值為3.6，1，3，4號樣品中總酸含量分別為1.97%、2.13%、2.05%，pH值分別為3.88，3.65，3.7。

3.2 甜面醬曬露階段還原糖與淀粉酶活力的變化情況

還原糖主要源自原料水解。在甜面醬發酵過程中，一部分還原糖作為乳酸、酒精發酵等底物生成有機酸類物質和高級醇等，一部分還原糖作為微生物生長的碳源，還有一部分參與色素的形成[17]。淀粉酶能夠催化原料中淀粉質降解為小分子還原糖，因而其在甜面醬發酵過程中起著重要作用。

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注：誤差線代表標準偏差(n=3)；不同小寫字母表示還原糖含量差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示淀粉酶活力差異顯著(P<0.05)；a～e分別為1～5號樣品曬露階段的還原糖與淀粉酶活力變化情況。

由圖2中a可知，經保溫發酵20 d再進行曬露發酵的甜面醬，曬露過程中，醬醪中還原糖含量先緩慢上升后略微下降直至穩定，淀粉酶活力則逐漸降低。0～14 d，還原糖含量逐漸上升(P<0.05)，醬醪中還原糖含量從25.92%上升到29.58%；14～34 d，醬醪中還原糖含量略微下降到27.81%，此后還原糖含量整體變化不顯著(P>0.05)，其含量維持在27.8%左右。淀粉酶活力從50.78 U/g下降到6.58 U/g，整個曬露階段淀粉酶活力降低了44.2 U/g。曬露前期，還原糖含量有所增加，其原因在于此階段淀粉酶活力仍發揮作用，繼續催化原料中的淀粉質物質進一步降解為小分子還原糖類。曬露發酵14 d，測得醬醪中還原糖含量達到峰值，之后還原糖含量開始下降，原因有：其一，還原糖部分作為微生物代謝碳源；其二，還原糖參與焦糖色素生成；其三，還原糖通過酒精、乳酸等發酵生成有機酸、高級醇等物質。曬露后期，醬醪中還原糖含量維持穩定的主要原因在于：醬醪酸度增大，微生物活動降低，還原糖消耗降低，基本維持穩定。

由圖2中b可知，經保溫發酵25 d再進行曬露發酵的甜面醬，在曬露階段，醬醪中還原糖含量先上升后降低至基本穩定，淀粉酶活力則逐漸降低。0～14 d，甜面醬中還原糖含量逐漸上升(P<0.05)，其含量從26.12%上升到29.58%，此階段還原糖含量增加了3.46%。14～22 d，此階段還原糖含量有所降低，從29.58%減小至28.68%；此后，隨著曬露時間的延長，醬醪中還原糖含量整體變化不顯著(P>0.05)，曬露發酵68 d后，醬醪中還原糖含量約為28.57%。0～14 d，淀粉酶活力從43.46 U/g迅速下降到11.27 U/g；14～68 d，該階段淀粉酶活力緩慢降低;68 d時，淀粉酶活力約為5.85 U/g。

由圖2中c可知，經保溫發酵30 d再進行曬露發酵的甜面醬，在后期曬露過程中，醬醪中還原糖含量先上升后緩慢降低，淀粉酶活力逐漸降底。0～8 d，還原糖含量逐漸上升(P<0.05)，醬醪中還原糖含量約由26.55%上升至28.19%，此階段還原糖含量增加了1.64%。此后，隨著曬露時間的延長，醬醪中還原糖含量逐漸降低，從28.19%下降為27.14%。甜面醬中淀粉酶活力從34.61 U/g降低至3.85 U/g。

由圖2中d可知，經保溫發酵35 d再進行曬露發酵的甜面醬，在曬露過程中，醬醪中還原糖含量先緩慢上升后逐漸降低，淀粉酶活力逐漸下降。0～5 d，甜面醬中還原糖含量逐漸上升(P<0.05)，其還原糖含量從27.32%增加為28.15%。此后，隨著曬露時間的延長，醬醪中還原糖含量逐漸降低，由28.15%下降為27.46%。0～68 d，淀粉酶活力從27.56 U/g減小到5.34 U/g。

由圖2中e可知，經保溫發酵40 d再進行曬露發酵的甜面醬，在曬露過程中，醬醪中還原糖含量略有降低，淀粉酶活力則逐漸降低。還原糖含量從27.25%減少為26.21%；淀粉酶活力從15.51 U/g逐漸下降至2.56 U/g。

圖2結果表明，甜面醬曬露階段還原糖含量均先逐漸上升后有所降低，而淀粉酶活力則逐漸下降至穩定。總體來看，原料中淀粉質物質降解為還原糖使得其含量逐漸上升，同時曬露階段微生物的發酵作用會利用部分還原糖，故還原糖含量變化較小，這是后期還原糖含量維持穩定的原因。曬露階段淀粉酶活力降低，其原因有：隨著曬露進行，醬醪中水分含量降低，微生物數量減少，醬醪酸度加大，使得淀粉酶活力受到抑制，同時高鹽的環境進一步抑制酶活力。甜面醬先經保溫發酵不同時間后，再進行曬露發酵68 d，其中還原糖含量最高的是2號樣品，約為28.57%；還原糖含量最低是樣品5，其含量約為26.21%，1，3，4號樣品中還原糖含量分別約為27.81%、27.14%、27.46%。

3.3 甜面醬曬露階段氨基酸態氮與蛋白酶活力的變化情況

氨基酸態氮的含量一定程度上反映蛋白質的水解程度，甜面醬中氨基酸主要源自蛋白酶水解蛋白生成，其作為重要的風味成分，部分氨基酸提供呈味作用，同時氨基酸還會通過美拉德反應參與面醬的成色[18,19]。

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注：誤差線代表標準偏差(n=3)；不同小寫字母表示氨基酸態氮含量差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示酸性蛋白酶活力差異顯著(P<0.05)；不同希臘字母表示中性蛋白酶活力差異顯著(P<0.05)；a～e分別為1～5號樣品在曬露階段的氨基酸態氮與蛋白酶活力變化情況。

由圖3中a可知，經保溫發酵20 d再進行曬露發酵的甜面醬，在后期曬露過程中，醬醪中氨基酸態氮含量先上升后略微下降至基本穩定，而蛋白酶活力則在整個曬露階段均呈現下降趨勢。0～8 d，此階段醬醪中氨基酸態氮含量逐漸上升，8 d時氨基酸態氮含量達到最大約為0.44%。8～68 d，氨基酸態氮含量從0.44%逐漸降低為0.41%。曬露階段，中性蛋白酶活力從63.49 U/g降低到6.42 U/g，酸性蛋白酶活力則由101.15 U/g減少為31.56 U/g。

由圖3中b可知，經保溫發酵25 d再進行曬露發酵的甜面醬，在后期曬露過程中，醬醪中氨基酸態氮含量逐漸上升至基本穩定，蛋白酶活力則逐漸降低。0～8 d，該階段甜面醬中氨基酸態氮含量由0.39%上升至0.43%；8～68 d，氨基酸態氮含量從0.43%緩慢降低至0.41%。通過顯著性差異分析可知，5～68 d，該曬露階段中氨基酸態氮含量無顯著性差異(P>0.05)，表明在曬露過程中氨基酸態氮含量無顯著性變化。0～68 d，中性蛋白酶活力從38.21 U/g降低到9.65 U/g，酸性蛋白酶活力則由92.32 U/g減少為42.33 U/g。

由圖3中c可知，經保溫發酵30 d再進行曬露發酵的甜面醬，在后期曬露過程中，醬醪中氨基酸態氮含量先上升后緩慢降低，蛋白酶活力則迅速下降。0～8 d，該階段甜面醬中氨基酸態氮含量從0.39%上升為0.42%；8～68 d，氨基酸態氮含量由0.42%逐漸下降至0.4%。曬露階段，中性蛋白酶活力從27.22 U/g降低到3.24 U/g，酸性蛋白酶活力則由80.74 U/g減少為14.76 U/g。

由圖3中d可知，經保溫發酵35 d再進行曬露發酵的甜面醬，在后期曬露過程中，醬醪中氨基酸態氮含量先上升后趨于穩定，蛋白酶活力逐漸降低。0～14 d，醬醪中氨基酸態氮含量從0.39%增加為0.42%；曬露發酵14 d之后，醬醪中氨基酸態氮含量無顯著性差異(P>0.05);68 d，氨基態氮含量約為0.41%。曬露階段，中性蛋白酶活力由12.24 U/g降低到5.08 U/g，酸性蛋白酶活力則從78.04 U/g下降至18.99 U/g。

由圖3中e可知，經保溫發酵40 d再進行曬露發酵的甜面醬，在曬露過程中，醬醪中氨基酸態氮含量略微有增加后趨于穩定，曬露發酵68 d，氨基酸態氮含量約為0.42%。隨著曬露時間的延長，醬醪中蛋白酶活力則逐漸降低，其中，中性蛋白酶活力從7.66 U/g降低到2.34 U/g，酸性蛋白酶由62.71 U/g下降至12.23 U/g。

圖3結果表明，甜面醬曬露階段氨基酸態氮含量逐漸上升，后期有所下降，而蛋白酶活力在整個曬露過程中均逐漸減小。曬露初期，中性蛋白酶及酸性蛋白酶共同作用促使原料中未降解完全的蛋白質繼續水解為氨基酸，使得氨基酸態氮含量逐漸上升；曬露階段后期，氨基酸經脫氨、脫羧反應參與其他物質生成使得含量有所下降，同時，蛋白酶活力雖降低但仍發揮催化作用，又促使氨基態氮含量上升，兩者共同作用維持曬露后期醬醪中氨基酸態氮含量略微下降至基本穩定。曬露階段蛋白酶活力進一步降低，其原因有：其一，經過前期的保溫發酵，醬醪中pH值進一步下降；其二，隨著發酵過程中水分含量降低，食鹽相對濃度增加，從而抑制酶活力。因酸性蛋白酶較中性蛋白酶所受影響小，整體而言，酸性蛋白酶活力要高于中性蛋白酶活力。甜面醬經保溫發酵不同時間后，再進行曬露發酵68 d，其中氨基酸態氮含量最高的為5號樣品，其含量約為0.42%；3號樣品的氨基酸態氮含量最低，約為0.4%；其余樣品中氨基酸態氮含量約為0.41%。整體而言，樣品間氨基酸態氮含量無顯著性差異(P>0.05)。

3.4 甜面醬曬露階段醬體感官變化情況

對保溫不同時間的甜面醬分別經曬露成熟的樣品進行感官評定，結果見表1。

表1 甜面醬曬露階段醬體的感官記錄Table 1 Sensory record of sweet soy bean paste during insotation and exposure stage

續 表

由表1可知，甜面醬在曬露發酵過程中，感官形態隨著發酵的進行發生動態變化，曬露階段，醬醪色澤逐漸趨于成熟要求，滋味香氣互相協調，此階段主要為生香、成色的過程。結合3.1～3.3理化指標的測定結果和標準SB/T 10296-2009要求，分別保溫發酵20，25，30，35，40 d的甜面醬在經曬露相同時間70 d左右后基本成熟，兩段式保溫發酵生產甜面醬的周期在3～4個月左右，比人工保溫發酵周期長1～2個月，但縮短自然曬露發酵周期8～9個月。

4 結論

保溫發酵不同時間的甜面醬，在曬露發酵相同時間70 d左右，醬醪理化指標與感官形態基本符合標準SB/T 10296-2009中對甜面醬達到成熟的要求。兩段式發酵生產甜面醬的周期在3～4個月左右，比自然曬露發酵的生產周期縮短8～9個月。

結合理化指標與感官形態確定了甜面醬兩段式發酵的生產周期，后期研究將通過對比保溫發酵不同時間后經曬露成熟的甜面醬成品質量來進一步確定最佳的保溫發酵時間。