低分子量鯰魚蛋白肽的酶解工藝優化及氨基酸分析

馮倩，曾里，冉旭*，高安友，應萍輝

(1.四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610065；2.四川省新溪源生物科技發展有限公司，成都 618500)

鯰魚，同鲇魚，種類繁多，適應能力好，容易養殖，成本低廉[1]，其體內含有豐富的亞油酸、亞麻酸等構成人腦極為重要的一系列營養素，具有一定的調中、益陽的藥用功效[2]。近年來有關利用生物酶解技術生產魚類發酵制品的研究越來越多[3,4]，研究發現生物酶解不僅效率高、污染低，而且酶解產物包含許多人體必需的氨基酸[5]。另一方面，通過酶解可以得到具有抗氧化活性、能夠緩解體力疲勞和降血壓等功能性的更利于人體吸收的小分子多肽[6]。但目前對于鯰魚酶解多采用單酶水解，因而存在底物水解不完全和利用率較低的問題。另外，對酶解后的多肽及氨基酸做進一步的分析以開發鯰魚發酵產品的研究還鮮有報道[7]。因此，本文對鯰魚進行雙酶復合酶解，然后應用響應面分析法對酶解制備鯰魚多肽的工藝進行優化研究，再對酶解液進行氨基酸分析和多肽分子量評價，以期為后續鯰魚相關的發酵制品的開發提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

鯰魚：由四川溪源水產養殖有限公司提供；木瓜蛋白酶(80×104U/g)、中性蛋白酶(5×104U/g)：Solarbio公司；其他試劑：均為分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-3C精密數顯pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；UV-1800PC紫外可見分光光度計 上海美譜達有限公司；KDN-C 定氮爐 浙江托普儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；ELEOS System凝膠色譜儀 美國Wyatt公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

新鮮鯰魚解凍后，去除魚頭、內臟和魚皮，將洗凈后的魚肉以小袋分裝，于-20 ℃下保存，備用。

1.3.2 原料最佳酶添加量的選擇

選用酶切位點為疏水性大分子氨基酸Leu、Ile、Phe的中性蛋白酶和酶切位點為Arg、Lys、Gly、Cys殘基羧基參與形成肽鍵的木瓜蛋白酶，添加不同比例以確定最佳酶添加量[8-13]。

1.3.3 酶解鯰魚肉的響應面試驗設計

1.3.3.1 單因素試驗

準確稱取一定量的鯰魚肉，通過預試驗添加中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶為1∶1作為本試驗酶的添加量。分別對酶解pH、溫度、時間和料液比4個因素進行單因素試驗分析，衡量指標為鯰魚肉的水解度及多肽得率。

1.3.3.2 響應面試驗優化提取鯰魚多肽工藝參數

鯰魚多肽提取工藝的設計因素及水平編碼見表1。

表1 鯰魚多肽提取工藝的設計因素及水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.4 水解度的測定

1.3.4.1 總氮的測定

參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法測定鯰魚肌肉的總氮含量。

1.3.4.2 游離氨基酸態氮的測定

參考GB 5009.235-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》中的酸度計法，并稍加修正[14]。吸取5.0 mL酶解液，加入50 mL去離子水稀釋，用NaOH標準溶液(0.05 mol/L)調節pH至8.2，再加入10.0 mL甲醛溶液(38%，V/V)，混勻靜置5 min，繼續滴定至pH為9.2，記錄消耗NaOH標準溶液的體積(V1，mL)；以去離子水作空白，采用同樣的操作方法，記錄消耗NaOH標準溶液的體積(V0，mL)。酶解液中游離氨基酸態氮的含量(CN，g/dL)計算公式如下：

CN=(V1-V0)×C×0.014/5。

式中：CN為酶解液中游離氨基態氮的含量，g/mL；C 為NaOH標準溶液的濃度，mol/L；V1為酶解液加入甲醛后滴定消耗NaOH標準溶液的體積，mL；V0為空白液加入甲醛后滴定消耗NaOH標準溶液的體積，mL；0.014為1.00 mL氫氧化鈉標準滴定[c(NaOH)=1.000 mol/L]相當于氮的質量，g。

1.3.4.3 水解度的計算

DH=CN×V/總氮。

式中：CN為酶解液中游離氨基酸態氮的含量，g/mL；V為酶解液總體積，mL。

1.3.5 多肽含量的測定

魯偉等[15]采用加入等量10%(W/V)三氯乙酸(TCA)沉淀大分子蛋白后，再采用雙縮脲法測定酶解液中肽的含量。本試驗參照此法并稍作改變。

1.3.5.1 雙縮脲試劑的配制

稱取硫酸銅(CuSO4·5H2O)3 g、酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)9.0 g、碘化鉀5.0 g、氫氧化鈉24 g，加水溶解并稀釋至1000 mL，搖勻，即得雙縮脲試劑。

1.3.5.2 蛋白質溶液標準曲線的繪制

精密稱取牛血清蛋白(BSA)標準品，用超純水定量稀釋成蛋白質含量分別為1，2，3，4，5 mg/mL的溶液。取5 mL溶液于試管中，加入4 mL雙縮脲試劑，混勻，用軟塞塞住上管口，置于37 ℃水浴中30 min。然后以超純水調零，在波長540 nm處測定吸光度。

1.3.5.3 多肽含量的測定與計算

精密量取稀釋一定濃度后的樣品液5 mL，其余方法同1.3.5.2。根據標準曲線方程計算出多肽含量(mg/mL)。

1.3.6 游離氨基酸的測定與分析

利用A300德國MembraPure氨基酸分析儀，采用570 nm和440 nm雙檢測通道對樣品進行分析。為了進一步準確判斷評價蛋白質的營養價值，可通過WHO/FAO提出的氨基酸模式譜來計算樣品中的必需氨基酸比值(RAA)、氨基酸比值系數(RC)、比值系數分(SRC)[16-18]。

1.3.7 多肽相對分子質量的分布測定

采用ELEOS System型凝膠色譜儀(色譜柱為ShodexOHpak系列SB-806串803)進行相對分子質量的測定，選擇柱溫40 ℃、流速1 mL/min、進樣量500 μL[19-21]。

2 結果與分析

2.1 不同酶解條件對鯰魚蛋白水解度及多肽的率得影響

圖1 pH、料液比、酶解溫度及酶解時間對鯰魚酶解液水解度和多肽含量的影響Fig.1 Effect of pH values, solid-liquid ratios, enzymolysis temperatures and enzymolysis time on the degree of hydrolysis and peptide content

由圖1可知，在酶解過程中，水解度與多肽含量隨著條件的變化都呈現先增加后降低的趨勢。由圖1中A可知，pH為6時，水解度和多肽含量都達到最大值，可能是因為其均在中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最適pH范圍內。由圖1中B可知，隨著溶劑量的增多，更多的多肽被水解出來，當料液比繼續增大時，由于溶液體積的增大導致多肽含量明顯下降，再考慮到試驗操作的損耗以及后期試驗的方便性，選擇料液比為1∶4時最佳。酶的催化活性受溫度的影響較大，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶都有各自的最適反應溫度，由圖1中C可知，在55 ℃時，水解度趨于平穩，同時多肽含量達到最大值，隨即顯著降低，可能是因為過度水解導致小分子多肽也開始被消耗。反應時間對水解的影響見圖1中D，由于酶解底物量的限制以及酶活的自我損失，當酶解到300 min時，水解度已經慢慢達到穩定狀態，然而之后由于小分子多肽也開始被水解為氨基酸，導致多肽含量開始降低。

2.2 響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Behnken的原理，選擇對結果影響較大的料液比、pH、酶解溫度作為自變量X1、X2、X3，酶解得到的多肽含量Y為響應值，設計三因素三水平的響應面分析試驗，見表2，采用Design-Expert 11軟件進行數據分析。

通過Design-Expert軟件對數據進行擬合分析，可以得到料液比、pH和溫度對多肽得率影響的二次多項回歸方程：

Y=3.17-0.3095A+0.0233B+0.0290C-0.0123AB+0.0022AC+0.0019BC-0.2346A2-0.1044B2-0.0872C2。

表2 鯰魚酶解工藝的響應面設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiment of enzymatic hydrolysis for catfish

鯰魚蛋白的回歸模型各項系數的顯著性檢驗結果及方程的方差分析結果見表3。

注：“*”表示差異顯著，P<0.05；“**”表示差異極顯著，P<0.01。

由表3可知，該回歸模型的P<0.0001，其中，失擬項值為0.6327，>0.5，表現為不顯著。綜上表明所設計的三因素三水平響應面試驗是可行的，方程相關系數R2=0.9835，相關系數RAdj2=0.9623，表明該模型的擬合度較好，能夠在96.23%的程度上解釋試驗結果；變異系數為1.74%，表明該模型能夠很好地反映真實的試驗值；精密度為17.0792，>4.0，表明其是一個適宜的信號值。

圖2 pH值和料液比交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.2 Response surface figure and contour plot of interaction effect of pH value and solid-liquid ratio

由圖2可知，隨著料液比或pH值的增加，多肽得率都先增加，達極大值后減小，這與單因素結果保持一致。

圖3 酶解溫度和料液比交互作用的響應面圖Fig.3 Response surface figure and contour plot of interaction effect of enzymolysis temperature and solid-liquid ratio

由圖3可知，料液比的曲線比酶解溫度的曲線更陡，表明料液比對試驗結果的影響大于酶解溫度的顯著性。

由圖4可知，當酶解溫度一定時，多肽得率隨pH值的增加先升高后降低。

圖4 酶解溫度和pH值交互作用的響應面圖和等高線Fig.4 Response surface figure and contour plot of interaction effect of enzymolysis temperature and pH value

根據上述響應面優化得到鯰魚酶解液多肽含量的最佳提取條件為：料液比1∶2.673，pH值6.076，酶解溫度56.595 ℃，多肽得率預測值為3.279 mg/mL。考慮到實際操作條件，將最佳酶解工藝條件修正為：料液比1∶2.7，pH值6，酶解溫度57 ℃。進行3次平行驗證試驗，在此條件下，鯰魚酶解液多肽含量平均值為3.165 mg/mL，非常接近于預測值。這說明該回歸模型能夠較好地反映鯰魚酶解液多肽含量的變化規律。

2.3 氨基酸分析結果

表4 鯰魚酶解液中的氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of catfish enzymatic hydrolysate

表5 各種必需氨基酸的RAA、RC及SRCTable 5 RAA, RC and SRC of human essential amino acids

由表4和表5可知，水解后鯰魚樣品中氨基酸的種類齊全，其中必需氨基酸(EAA)與非必需氨基酸(NEAA)的比值(EAA/NEAA)為57.45%，較接近于FAO/WHO所提出的比值40%。為了進一步說明鯰魚酶解液的營養價值，采用氨基酸比值系數法對酶解液中各種必需氨基酸進行了進一步分析。鯰魚酶解液中各種必需氨基酸的氨基酸比值(RAA)、氨基酸比值系數(RC)以及比值系數分(SRC)見表5，可知鯰魚酶解液氨基酸的比值系數分較高，為83.2，這為后續進一步加工利用提供了可靠的科學依據。

2.4 多肽相對分子質量的分布

圖5 分子量分布Fig.5 Molecular weight distribution

由圖5可知，鯰魚酶解液中多肽分子峰尖分子量為1.100×103g/mol，數均分子量為1.842×103g/mol，平均分子量為1.334×103g/mol，多分散性指數為1.651。酶解液中多肽分子量分布在700.0～28922.0 g/mol之間，其中，多肽分子量在700.0～2800.0 g/mol之間占總多肽分子量含量的53%；多肽分子量在2800.0～3200.0 g/mol之間，占總多肽分子量含量的28.6%，說明酶解后的多肽分子含量主要以3000.0 g/mol以下的小分子肽為主，水解程度較好。具體分析數據見表6。

表6 凝膠色譜結果分析Table 6 Analysis of gel chromatography results

3 結論

通過響應面試驗，得到料液比1∶2.7、pH值6、酶解溫度57 ℃和酶解時間300 min為鯰魚酶解的最佳條件，在此條件下鯰魚酶解液的多肽含量平均值為3.165 mg/mL。鯰魚經過酶解后，人體必需氨基酸含量大幅上升，其中必需氨基酸(EAA)與非必需氨基酸(NEAA)的比值(EAA/NEAA)為57.45%，氨基酸比值系數分SRC為83.2，符合FAO/WHO所提出的蛋白評價標準。通過GPC凝膠色譜儀對樣品進一步的檢測分析可知，鯰魚酶解液中多肽分子平均分子量為1.334×103g/mol，主要以3000.0 g/mol以下的多肽為主。該研究確定了一種水解程度較高、營養豐富、容易吸收消化的鯰魚酶解液的制備方法，可為后續鯰魚相關發酵制品的研發提供理論指導。